Tp chớ Khoa hc v Phỏt trin 2010: Tp 8, s 3: 448 - 457 TRNG I HC NễNG NGHIP H NI448

Phân tích đặc điểm phân tử v vai trò của gen C9 trong hệ miễn dịch ở lợn
Analyzing Molecular Characterization and the Role of Porcine Gene C9
in the Immune System
Vừ Anh Khoa

B mụn Chn nuụi, Khoa Nụng nghip v Sinh hc ng dng, Trng i hc Cn Th
a ch email tỏc gi liờn h: [email protected]
Ngy gi ng: 25.01.2010; Ngy chp nhn: 9.03.2010
TểM TT
C ch iu ho min dch t nhiờn ca phc hp b th hu ht cỏc loi ng vt ó c
hiu rừ, c bit l vai trũ ca gen C9 trong s thnh lp phc hp tn cụng mng (Membrane Attack
Complex, MAC) dn n s t dung gii ca t bo vi sinh vt. Mc tiờu ca nghiờn cu l phõn
tớch chui cDNA v cu trỳc phõn t ca protein C9 ln, lm c s cho vi
c ỏnh giỏ chc nng
ca gen C9 trong nhng nghiờn cu tip theo. Kt qu phõn tớch ch ra s ging nhau trong cu trỳc
cDNA v protein C9 gia ln v cỏc loi ng vt hu nh. Vi 11 exon, gen C9 di 2536 bp ó mó
hoỏ 534 axớt amin. C9 cha nhiu min protein chc nng giu cysteine nh TSP1, LDLa v MACPF.
Nhng min protein ny úng vai trũ quan trng trong c ch min dch ca ng vt hu nh chng
li mm bnh xõm nhim. Kt qu g
i ý C9 l mt trong nhng gen tim nng cho sc khỏng bnh t
nhiờn ln.
T khúa: Chc nng, C9 gen, c im, ln.

SUMMARY
The natural immune regulation mechanism of the complement system, expecially the important
role of complement component C9 in the formation of the Membrane Attack Complex (MAC) causing

quả l lm cho tế bo liên tục bị mất nớc,
chất điện giải,... dẫn đến tự tiêu huỷ. MAC l
tập hợp của một phân tử C5b, C6, C7, C8 v
6-18 phân tử C9 (Muller-Eberhard, 1986;
Tschopp v cs., 1984; Podack v cs.,1982;
Kolb v cs., 1972). Do bởi tầm quan trọng của
MAC trong cơ chế điều ho miễn dịch tự
nhiên của cơ thể động vật hữu nhũ, đặc biệt
l protein cuối cùng C9 có vai trò cực kỳ quan
trọng trong sự thnh lập MAC cũng nh sự
điều ho của phức hợp bổ thể chống lại mầm
bệnh (Rosado v cs., 2007), nhiều nghiên cứu
trên protein C9 đã đợc tiến hnh trên ngời.
Sự thiếu hụt C9 có thể dẫn đến nhiều bệnh
khác nhau: viêm mng não (meningococcal
meningitis), dermatomyositis, (Vázquez -
Bermúdez v cs., 2003; Zhu v cs., 2000; Eng,
1980; Haeney v cs., 1980, Ichikawa v cs.,
2001). Trong nghiên cứu ny, trình tự chuỗi
cDNA (complementary DNA) của C9 ở lợn
(pC9) sẽ đợc giải mã v phân tích, l
m cơ sở
cho những nghiên cứu tiếp theo về vai trò của
C9 trong cơ chế miễn dịch tự nhiên của vật chủ.
2. PHƯƠNG TIệN V PHƯƠNG PHáP
NGHIÊN CứU
2.1. Động vật thí nghiệm v cách lấy mẫu
Đối tợng thí nghiệm l 6 lợn từ các
giống Hampshire (n=1), Duroc (n=1),
Landrace (n=1), Pietrain (n=1), Berlin

Sigma-Aldrich (Taufkirchen, CHLB Đức) để
tổng hợp (Bảng 1).
2.4. Phản ứng PCR (Polymerase chain reaction)
Tổng số 20 l dung dịch phản ứng PCR
gồm 50 ng cDNA, 0,2 mM mồi (forward or
reverse primer), 50 M dNTP (Roth,
Karlsruhe; CHLB Đức), 0,5 U Taq
polymerase (Sigma - Aldrich, Taufkirchen,
CHLB Đức), 1xTaq buffer v 1,5 mM MgCl
2
(Sigma-Aldrich, Taufkirchen, CHLB Đức).
Chu trình nhiệt đợc thiết kế với nhiệt độ
biến tính ban đầu 94
o
C trong 4 phút, theo
sau bởi chu trình khuyếch đại 40 vòng (94
o
C
trong 30 giây, 60
o
C trong 30 giây, 72
o
C
trong 1 phút) v kết thúc ở 72
o
C trong 5
phút sử dụng T1 Research Thermocycler
(Biometra, Gttingen, CHLB Đức). Sản
phẩm PCR đợc điện di trên gel agarose 1%
nhuộm với ethidium bromide. Sản phẩm

1561-1584
606 50
C9.4
up 5-atgctccggtgctcataaat-3 (9)
down 3-ccgcatatttgactgctgac-5 (11)
1492-1511
1998-2017
526 55
(*)
_V trớ ca on mi theo GenBank s DQ333198
2.5. Nhận diện sự đa hình (Single
nucleotide polymorphism, SNP)
Các đột biến điểm (SNP) đợc nhận diện
dựa trên sự so sánh chuỗi cDNA của các
động vật thí nghiệm. Các SNP sẽ đợc tái
xác định bằng phơng pháp PCR - RFLP
(Polymerase Chain Reaction-Restriction
Fragment Length Polymorphism) sử dụng
enzyme phân cắt giới hạn BsrDI (Fermentas,
www. fermentas.com) v HpyCH4III
(Biolabs, www.biolabs.com).
3. KếT QUả
3.1. Đặc điểm chuỗi cDNA
Ton bộ chiều di vùng mã hoá của pC9
đã đợc nhận diện v đợc xác định thuộc
nguồn GenBank số DQ333198. Chuỗi cDNA
của pC9 di 2536 bp gồm 11 exon (sự phân
biệt exon dựa trên nguyên tắc cấu trúc DNA:
exon 1-GT.intron.AG-exon 2). Với công thức
nguyên tử C

1
-
Cys
11
, Cys
2
-Cys
14
, Cys
3
-Cys
19
, Cys
4
-Cys
5
,
Cys
6
-Cys
15
, Cys
7
-Cys
9
, Cys
8
-Cys
13
, Cys

giữa các loi hữu nhũ đợc ghi nhận, đặc
biệt giữa các loi lợn, bò v ngời (67 - 71%)
(ClustalW2,
http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.h
tml) (Bảng 2).
Phõn tớch c im phõn t v vai trũ ca gen C9 trong h min dch heo
451
Bảng 2. Sự đồng dạng trong chuỗi cDNA v protein C9 giữa các loi động vật (%)
Loi
(*)
cDNA Axớt amin
GenBank s bp % GenBank s a.a %
S. scrofa DQ333198 2536 100 ABD13966 543 100
E. caballus NM_001081950 2661 79 NP_001075419 547 71
B. taurus BC105174 2697 78 AAI05175 548 70
H. sapiens BC020721 2094 78 AAH20721 559 67
O. cuniculus NM_001082346 2018 77 NP_001075815 557 66
M. mulatta XM_001084671 2774 73 XP_001084671 561 69
C. familiaris XM_536494 1840 72 XP_536494 589 65
R. norvegicus NM_057146 2083 66 NP_476487 567 61
M. domestica XM_001372031 1572 66 XP_001372068 523 52
M. musculus BC011137 1767 64 AAH11137 561 55
(*)
_S.scrofa: lợn, E. caballus: nga, B. taurus: bũ, H. sapiens: ngi, O. cuniculus: th, M. mulatta: kh,
C. familiaris : chú, R. norvegicus : chut bch, M. domestica: rui , M. musculus: chut nh
R.norvegicus MLLRTPGLPRRSGMASGVTITLAIAIFALEINAQAPEPTPREEPSAD--ALLPIDCRMST 58
M.musculus MLCKPPGLPRRSSMASGMAITLALAIFALGVNAQMPIPVSREEQEQH--YPIPIDCRMSP 58
S.scrofa -------------MRVRRRFTFAVCILEISILSAGPTPSYHPKPVDC GTPSPIDCRMSP 47
B.taurus -------------MSAGQRFAFAICILEISLLRAGPTPSYD--PAERQGTPLPIDCRMSS 45
M.mulatta -------------MSACWSFAAAICILEISVLTAEYTPSYDPQPTESRGSASHIDCRMSP 47

H.sapiens IIQEKTSNFNAAISLKFTPTETN------KAEQCCE-ETASSISLHGKGSFRFSYSK ET 279
.:. *. :::* .*. : . *:* * .
R.norvegicus FQRLSSYLSQTKKMFLHVRGMIQLGRFVMRNRGVMLTTTFLDDVKALPVSYEKGEYFGFL 354
M.musculus FRRLSSYFSQSKKMFVHLRGVVQLGRFVMRNRDVVLRSTFLDDVKALPTSYEKGEYFGFL 350
S.scrofa YKLLLSYSSKKEKIFLHVKGVIHLGRFVMRKRDVMLTKTFLDDVKYLPSTYEKGEYFAFL
343
B.taurus YRLLSSYSAKQEKMFLHVKGKVHLGRFVMRSRDVMLQTTFLDSINTLPTTYEKGEYFAFL 344
M.mulatta YQLFLSYSSKKEKMFLHVKGEIHLGRFMMRNRDVVLTTTFVDDIKALPTTYEKGEYFAFL 341
H.sapiens YQLFLSYSSKKEKMFLHVKGEIHLGRFVMRNRDVVLTTTFVDDIKALPTTYEKGEYFAFL 339
: : * :. *:*: ::* ::**:* *:.* .:* .**:*.:: ** :******:.**

Hình 1. So sánh chuỗi protein C9 giữa các loi động vật sử dụng nguồn GenBank ở bảng 2
Vừ Anh Khoa
452
R.norvegicus ETYGTHYSSSGSLGGLYELIYVLDKASMKEKGVELSDVKRCLGFNLDVSLYTPLQTALEG 414
M.musculus ETYGTHYSTSGSLGGQYEIVYVLDKASMKEKGVDLNDVKHCLGFNMD--LRIPLQDDLKD 408
S.scrofa ETYGTHYSSSGSLGGLYELIYVLDKATMTEKGIELRDVHRCLGFNLDLSLN-------FG 396
B.taurus ETYGTHYSSSGSLGGLYELIYVLDKKSMEQKDIELRDVQRCLGFDLDLSLK-------VG 397
M.mulatta ETYGTHYSSSGSLGGLYELIYVLDKASMNRKGVELKDVKRCLGYHLDVSLDF------SK 395
H.sapiens ETYGTHYSSSGSLGGLYELIYVLDKASMKRKGVELKDIKRCLGYHLDVSLAF------SE 393
********:**.:** **::***** * .*.::: *:::*** .:*
MACPF domain (297-507)
R.norvegicus PSLTANVNHSDCLKTGDGKVVNISRDHIIDDVISFIRGGTRKQAVLLKEKLLRGAKTIDV 474
M.musculus ASVTASVNADGCIKTDNGKTVNITRDNIIDDVISFIRGGTREQAILLKEKILRGDKTFDK 468
S.scrofa VEIKGKIDSENCLKRGDGKTENIMNDDFIDDVISFIRGGTRKYATELKEKLLKGAKMI V 456
B.taurus VEVTGNFDSKLCSKKGMGQTETNPEADLFDDVITFIRGGTRKYATELKEKLLRGARMINV 457
M.mulatta ISAGAKADKDDCVKRGEGRAVNITSDHLIDDVISLIRGGTRQYAFELKEKLLRG-TMIDV 454
H.sapiens ISVGAEFNKDDCVKRGEGRAV ITSENLIDDVVSLIRGGTRKYAFELKEKLLRG-TVIDV 452
. .. . . * . . ::***:::*.***:: * ****:* .:
R.norvegicus NDFINWASSLDDAPALISQKLSPIYNLIPLTMKDAYAKKQNMEKAIEDYVNEFSARKCYP 534

_Signal peptide
_ Thrombospondin type I (TSP1)
_ Low-density lipoprotein receptor class A (LDLa)
_ Membrane attack complex/perforin segment (MACPF)

Hình 2. Các miền protein chức năng giu Cysteine trong cấu trúc của C9 ở lợn
3.3. Sự đa hình của gen
So sánh chuỗi cDNA giữa các động vật
thí nghiệm đã phát hiện 2 đột biến điểm
tại nucleotide 350AặG/BsrDI (codon 87CAA
ặ CAG) trên miền TSP1 v 407C ặ
G/HpyCH4III (codon 106CAC ặ CAG) trên
miền LDLa của gen pC9. Đột biến điểm
trên miền LDLa lm thay đổi a.a His ặ
Gln (Hình 3).