ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGÔ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU
VÀ PHÂN LOẠI CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS)
THU THẬP Ở LAI CHÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGÔ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU
VÀ PHÂN LOẠI CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS)
THU THẬP Ở LAI CHÂU

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 8 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Vũ Thị Thu Thủy

Thái Nguyên, năm 2018

Tác giả

Ngô Thùy Linh

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii
MỤC LỤC ..........................................................................................................iii
DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................. iv
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. v
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1
2. Mục tiêu của đề tài........................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4
1.1. Giới thiệu chung về cây Bảy lá một hoa ...................................................... 4
1.1.1. Đặc điểm, phân loại cây Bảy lá một hoa ................................................... 4
1.1.2. Phân bố, vai trò của cây Bảy lá một hoa ................................................... 5
1.2. Các phương pháp định danh thực vật ........................................................... 6
1.2.1. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu ................................................. 7
1.2.2. Phương pháp sinh học phân tử .................................................................. 8
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 14
2.1. Vật liệu thực vật.......................................................................................... 14
2.2. Địa điểm nghiên cứu, hóa chất và thiết bị .................................................. 14
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu................................................................................ 14
2.2.2. Hóa chất, dụng cụ .................................................................................... 14


DNA

:

Deoxyribonucleic acid

ITS

:

Internal Transcribed Spacer

kb

:

Kilobase

matK

:

MaturaseK

NCBI

:

The National Center for Biotechnology Information

đồng và sai khác với mẫu SH .............................................................. 27
Bảng 3.2. Độ tương đồng và phân ly dựa trên trình tự gen matK ..................... 27
Bảng 3.3. Một số trình tự vùng gen ITS sử dụng để xác định độ tương đồng
và sai khác với mẫu SH ....................................................................... 32
Bảng 3.4. Độ tương đồng và phân ly dựa trên trình tự vùng gen ITS ............... 32

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Mô hình thí nghiệm tổng quát ........................................................... 15
Hình 3.1. Hình thái cơ quan sinh dưỡng của mẫu cây Bảy lá một hoa thu
thập ở huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu .................................................... 19
Hình 3.2. Cấu tạo giải phẫu cuống lá ................................................................ 20
Hình 3.3. Cấu tạo giải phẫu thân ....................................................................... 21
Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu rễ ........................................................................... 22
Hình 3.5. Kết quả tách chiết DNA tổng số của cây Bảy lá một hoa ................. 23
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen matK bằng kỹ thuật PCR .... 24
Hình 3.7. Kết quả Blast trình tự gen matK ........................................................ 25
Hình 3.8. Trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ mẫu cây Bảy
lá một hoa thu thập ở Sìn Hồ, Lai Châu .............................................. 26
Hình 3.9. Sơ đồ mô tả mối quan hệ di truyền giữa các loài Bảy lá một hoa
trong chi Paris dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matK. ....... 28
Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại vùng gen ITS bằng kỹ
thuật PCR............................................................................................. 29
Hình 3.11. Kết quả Blast trình tự vùng gen ITS ................................................ 30
Hình 3.12. Trình tự nucleotide của vùng gen ITS phân lập từ mẫu cây Bảy
lá một hoa thu thập ở Sìn Hồ, Lai Châu .............................................. 31
Hình 3.13. Sơ đồ mô tả mối quan hệ di truyền giữa các mẫu cây Bảy lá một
hoa trong chi Paris dựa trên trình tự nucleotide của vùng ITS ........... 33

Đây là phương pháp có độ chính xác cao, đặc biệt rất cần đối với thực vật dùng
làm thuốc muốn xác định ở cấp độ loài, ngay cả khi đã được chế biến. Việc xác

1


định chính xác tên loài là một bước quan trọng để có thể đảm bảo về chất lượng
sản phẩm. Bên cạnh đó, kết quả nhận diện có vai trò quan trọng trong việc bảo
tồn các loài có nguy cơ tuyệt chủng.
Mã vạch DNA là một phương tiện nhận biết mới của sinh học phân tử.
Một số mã vạch DNA được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong phân
loại các cây dược liệu như matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL… Theo đó gen
matK nằm trong lục lạp mã hóa cho enzyme mature K. Nhiều nghiên cứu đã sử
dụng gen matK trong việc định loại cây trồng và cũng mang lại những thành
tựu nhất định [11], [24],… Vùng gen ITS bao gồm trình tự ITS1-5.8S-ITS2
cũng là đối tượng được nghiên cứu nhiều. Hiện nay, số lượng các trình tự
nucleotide của vùng ITS đã được công bố trong ngân hàng gen thế giới khá
phong phú, thuận lợi cho việc phân tích so sánh. Các nghiên cứu phát sinh loài
thực vật dựa trên vùng gen ITS ở cây Đẳng sâm, cây Dâu, Nấm và nhiều thực
vật khác là minh chứng cho vai trò của vùng gen ITS trong nhận diện cây trồng
[13], [25], [33].
Tỉnh Lai Châu là một tỉnh miền núi phía bắc Việt Nam được phát hiện có
sự có mặt của cây Bảy lá một hoa [20]. Mẫu cây thu được có những đặc điểm gì
và thuộc loài nào là câu hỏi được đặt ra trong nghiên cứu này. Xuất phát từ
những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hình thái,
giải phẫu và phân loại mẫu cây Bảy lá một hoa (Paris) thu thập ở Lai Châu”.
2. Mục tiêu của đề tài
Xây dựng được dữ liệu về đặc điểm hình thái, giải phẫu và đặc điểm của
đoạn gen matK, vùng gen ITS dùng trong phân loại thực vật phục vụ nhận dạng
cây Bảy lá một hoa.


Paris polyphylla var. Alba

Quý Châu, Hồ Bắc, Vân Nam

Paris polyphylla var. chinensis

An Huy, Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng
Tây, Quý Châu, Hồ Bắc, Hồ Nam , Giang
Tô, Giang Tây, Tứ Xuyên, Đài Loan, Vân
Nam, Lào, Myanmar, Thái Lan, Việt Nam

Paris polyphylla var. latifolia

An Huy, Hà Nam, Hồ Bắc, Giang Tây,
Thiểm Tây, Sơn Tây

Paris polyphylla var. nana

Tứ Xuyên

Paris polyphylla var. panxiensis

Tứ Xuyên

Paris polyphylla var. polyphylla

Trung Quốc , Himalayas, phía bắc Đông
Dương


dục,… dài 20-23 cm, rộng 6-7 cm. Đầu phiến lá nhọn, mặt trên màu xanh đậm,
mặt dưới màu nhạt hơn. Hoa mọc trên đỉnh cây, cuống hoa dài 14 cm. Lá đài
bằng số cánh tràng. Nhụy màu tím đỏ, bầu có 3 ngăn. Nhị mảnh, có bao phấn
màu vàng nâu, xếp thành 2 vòng, xen kẽ nhau, mỗi vòng có 5 nhị [5], [20].
1.1.2. Phân bố, vai trò của cây Bảy lá một hoa
Bảy lá một hoa là cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác
dưới tán rừng kín thường xanh, dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều
mùn. Paris là một chi nhỏ, hiện chỉ có một số loài phân bố ở vùng cận nhiệt đới
hoặc ôn đới ẩm Bắc bán cầu: Trung Quốc, Ấn Độ, Nê Pan và Myanma. Ở Việt
Nam, cây Bảy lá một hoa hầu như chỉ thấy ở các tỉnh miền núi phía bắc như
Ninh Bình, SaPa (Lào Cai), Quản Bạ (Hà Giang), Sìn Hồ (Lai Châu),… [12],
[20], [32].

5


Theo dân gian, cây Bảy lá một hoa có rất nhiều công dụng để trị một số
bệnh như: bệnh gan, ung thư phổi và thanh quản, ung thư biểu mô,… Thân rễ
Bảy lá một hoa có vị đắng, hơi cay, tính hơi lạnh, hơi độc, vào kinh can, có tác
dụng xổ hạ, lợi tiểu, tiêu đờm, thanh nhiệt, giải độc. Thân rễ của cây còn chữa
sốt, sốt rét cơn, kinh giản, giải độc [12]. Kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại
còn cho thấy các thành phần trong cây Bảy lá một hoa có tác dụng: cầm ho,
giảm cơn hen. Chiết xuất hóa học trong thân và rễ còn có tác dụng cầm máu, ức
chế với mức độ khác nhau đối với trực khuẩn lị, thương hàn, tụ cầu vàng, liên
cầu khuẩn đồng thời có tác dụng ức chế Leptospira và virut cúm. Ngoài ra chiết
xuất ở cây Bảy lá một hoa có tác dụng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung [35].
Tại vùng Quảng Tây (Trung Quốc) có câu “Ốc hữu thất diệp nhất chi hoa / Độc
xà bất tiến gia” nghĩa là trong nhà có cây Bảy lá một hoa thì rắn độc không vào
nhà được. Ngoài công dụng chữa sốt và rắn độc cắn, vị tảo hưu (thân rễ của cây
Bảy lá một hoa) còn dùng chữa mụn nhọt, viêm tuyến vú, ho lao, dùng ngoài da

Nghiên cứu đặc điểm hình thái cây Ngô đồng đỏ ở Cù Lao Chàm, nhóm
tác giả Vũ Văn Dũng và Đinh Thị Phương Anh (2016) chỉ ra rằng ở Việt Nam
có 2 loài Ngô đồng đỏ cùng thuộc chi Firmiana khác nhau về nơi sống có sự
khác biệt về nhiều đặc điểm hình thái như thân, lá, cụm hoa, hoa, quả. Những
sự khác biệt thu được là tài liệu cung cấp cho việc nhận diện mẫu cây Ngô
đồng đỏ và làm căn cứ để sử dụng bền vững và phát triển loài cây ngô đồng đỏ
ở Cù Lao Chàm [2].
Năm 2006, Lê Ngọc Hân và cộng sự đã sử dụng phương pháp phân tích
đặc điểm hình thái và so sánh các đại diện họ Ban – Hypericaceae juss ở Việt
Nam, nhóm nghiên cứu đã xác định được tông và chi thuộc họ Ban. Kết quả
nghiên cứu được sử dụng làm khóa phân loại ở mức độ chi [3].
Nghiên cứu của Lê Như Hậu (2009), khi phân tích hình thái các mẫu tiêu
bản của 7 loài Rong câu chỉ ở Việt Nam phát hiện thấy có sự thay đổi lớn về
mặt hình thái. Tuy nhiên, giữa chúng vẫn có những đặc điểm chung về cấu tạo
thân, kiểu phân nhánh, hình dạng quả. Các đặc điểm hình thái ngoài cho thấy,
tuy có sự phân bố rộng khắp và được nuôi trồng dọc theo biển Việt Nam nhưng
chúng vẫn xuất phát từ cùng một loài [4].

7


Ráng thư dực (Thelypteridaceae Ching ex Pic. Serm) là một họ lớn với
khoảng 50 chi và hơn 1000 loài được phân bố ở các vùng nhiệt đới. Tại Việt
Nam, nhóm nghiên cứu của Doãn Hoàng Sơn cùng cộng sự (2017) đã sử dụng
phương pháp so sánh hình thái để mô tả một số đặc điểm cơ bản của các chi
trong họ Ráng thư dực. Kết quả nghiên cứu đã cung cấp dữ liệu của 17 chi có ở
Việt Nam về đặc điểm hình thái, sinh thái, khu phân bố, kèm theo thông tin về
số lượng loài của các chi đó ở Việt Nam [8].
Chi Mua tuy là chi nhỏ nhưng những đại diện thuộc chi Mua lại có vai
trò quan trọng trong các hệ sinh thái rừng thứ sinh. Một số loài thì làm thuốc,

Sử dụng phương pháp sinh học phân tử có thể giám định được ngay cả
khi các mẫu không còn nguyên vẹn. Việc kết hợp giữa chỉ thị phân tử DNA và
chỉ thị hình thái sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữa sinh vật này
với sinh vật khác một cách chính xác [23].
Hiện nay, nhiều loại thảo dược được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị
các bệnh, góp phần phát triển ngành công nghiệp dược liệu. Những cây dược
liệu luôn phải xác định ở cấp độ loài, vì vậy cần phải định danh chính xác để
đảm bảo được sản phẩm chất lượng và có ý nghĩa quan trọng trong việc nghiên
cứu các đặc tính đa dạng di truyền và bảo vệ các loài quý hiếm. Bên cạnh đó,
dược liệu còn bị pha trộn nhiều làm giảm đi hiệu quả của thuốc, hay dược liệu
bị thay thế bởi các thành phần chứa độc tính, nên một số trường hợp có thể thể
gây nguy hiểm đến tính mạng. Vì vậy, xác định chính xác nguồn gốc của các
loại dược liệu là điều cần thiết. Nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu
xác định nguyên liệu thảo dược bằng mã vạch DNA. He J. và cộng sự (2010)
cũng sử dụng mã vạch DNA để nghiên cứu xác định một số mẫu cây dược liệu
trong chi Aconitum [18]... Chỉ thị DNA thường dùng trong phân loại cây thuốc
là matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL …
Gen rpoC1 mã hóa 1 trong 4 tiểu đơn vị của RNA polymerase lục lạp.
Gần đây, nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra hiệu quả của việc sử dụng gen rpoC1
vào việc định danh thực vật. Nghiên cứu của Vũ Thị Thu Thủy và cộng sự
(2016) đã sử dụng đoạn gen rpoC1 có kích thước 558 bp của mẫu thu thập tại

9


huyện Bình Gia, tỉnh Lạng Sơn đã xác định được mối quan hệ của mẫu với các
loài trong chi Paris ở mức 96-99 % [10].
Nghiên cứu của Liu và đồng tác giả (2010) đã chỉ ra rpoC1 là một chỉ thị
rất hữu ích khi được sử dụng để phân biệt các loài Bryophytes. Tuy nhiên,
CBOL đã thử nghiệm 7 locus và thấy rằng khả năng phân biệt loài của đoạn

ex Balf, R. officinale Baill., và loài gần gũi Rheum palmatum L.. Kết quả
nghiên cứu cho thấy mức độ biến đổi nội bộ loài và giữa các loài khác nhau là
khá cao [11].
Trên cây Bảy lá một hoa, việc sử dụng gen matK trong việc định danh
cũng đã được thực hiện bởi một số các tác giả. Nghiên cứu của Vũ Thị Thu
Thủy và cộng sự (2017) phân lập đoạn gen matK từ các mẫu khác nhau về địa
điểm thu thập và số lượng lá. Theo đó mẫu thu được ở tỉnh Hà Giang có 6 lá và
mẫu thu ở tỉnh Lào Cai có 7 lá. Kết quả cho thấy trình tự nucleotide của đoạn
gen matK mẫu cây 6 lá (Hà Giang) có 808 nucleotide, trình tự nucleotide của
đoạn gen matK mẫu cây 7 lá (Lào Cai) có 806 nucleotide. Tuy nhiên kết quả so
sánh sự khác biệt và tương đồng cho thấy cả 2 mẫu cùng thuộc loài Paris
polyphylla var. yunnanensis [11].
Trình tự vùng gen ITS (internal transcribed spacer) là một vùng gồm các
đoạn ITS1-5,8S-ITS2. Vùng ITS nằm trong nhân tế bào được phiên mã trong quá
trình tổng hợp rRNA. Tuy nhiên, trong quá trình trưởng thành của rRNA, phần
ITS bị cắt và nhanh chóng phân hủy. Một lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2
locut riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locut 5.8S. Vùng ITS có
nhiều ưu thế trong nghiên cứu phát sinh và đánh giá sự đa dạng di truyền của các
loài như trình tự nucleotide vùng gen ITS mang các đặc tính di truyền của cả bố và
mẹ, số lượng trình tự DNA lặp lại thích hợp cho việc khuếch đại và xác định trình
tự DNA ribosome. Trình tự nucleotide vùng gen ITS đã được nghiên cứu và công
bố trong ngân hàng gen thế giới khá phong phú và đa dạng, thuận lợi cho việc
phân tích so sánh. Các nghiên cứu phát sinh loài thực vật dựa trên vùng gen ITS đã
được tiến hành bởi nhiều nhà nghiên cứu [14], [21], [22].
Trước đây nấm thường được phân loại dựa trên các đặc điểm về hình thái,
cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein nên kết quả

11



nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu Việt Nam
thuộc chi Đẳng Sâm (Codonopsis sp), kết quả nghiên cứu đã khuếch đại thành
công vùng gen ITS và phân tích được sự đa hình trên mỗi vùng gen [33].
Quả của các loài thuộc chi Zanthoxylum trong y học Trung Quốc có công
dụng lớn trong việc chữa đau vùng thượng vị. Người ta đã phát hiện ra trong
chi Zanthoxylum có đến 200 loài khác nhau. Sun Yan-Lin và cộng sự đã tìm ra
trình tự vùng gen ITS của loài Zanthoxylum piperitum đồng thời phân biệt loài
Zanthoxylum piperitum với loài Zanthoxylum schinifolium trong chi
Zanthoxylum cũng nhờ trình tự vùng gen ITS [29].
Vùng gen ITS được sử dụng như một điểm đánh dấu hiệu quả và mạnh
mẽ, đây cũng là một mã vạch tiềm năng để phân biệt các loài khác nhau trong
họ Fabaceae [17].
Trình tự nucleotide của 22 loài thuộc chi Paris trên GenBank được sử
dụng để làm trình tự tham chiếu khi so sánh với 3 mẫu cây Bảy lá một hoa khác
12


nhau kí hiệu lần lượt là PR1, PR2, PR3. Sử dụng phần mềm Bioedit Nguyễn
Tiến Dũng cùng cộng sự (2017) cho thấy kết quả so sánh có sự tương đồng rất
cao giữa 3 mẫu nghiên cứu với nhau và với trình tự loài Paris vietnamensis trên
GenBank. Trong đó vùng gen ITS khả năng phân biệt loài tốt hơn, với độ biến
thiên trình tự giữa các loài cao hơn so với vùng gen psbA-trnH [5].
Vũ Thị Thu Thủy cùng cộng sự (2017) đã khuếch đại thành công vùng
gen ITS của mẫu Bảy lá một hoa thu được ở Lào Cai. Từ trình tự vùng gen thu
được có kích thước 676 bp với hệ số tương đồng là 99% so với loài Paris
vietnamensis, mẫu cây Bảy lá một hoa thu được ở huyện SaPa, tỉnh Lào Cai đã
được định danh thuộc loài Paris vietnamensis [9].
Có thể thấy việc nghiên cứu ứng dụng mã vạch DNA trong phân tích
đa dạng di truyền các loài đã khẳng định vùng gen ITS và gen matK có thể
giúp nhận diện loài, đồng thời có thể được dùng cho các nghiên cứu tiếp

Đề tài được thực hiện theo mô hình thí nghiệm tổng quát trình bày ở
hình 2.1.

14


Thu thập mẫu cây Bảy lá một hoa

Nghiên cứu đặc điểm thực vật
Mô tả hình thái
Làm tiêu bản tế bào
Chụp ảnh, quan sát, phân
tích

Nghiên cứu đặc điểm mã vạch DNA
- Phân tích đặc điểm đoạn gen matK
Phân tích đặc điểm vùng gen ITS

Dữ liệu phục vụ nhận dạng cây Bảy lá một hoa
Hình 2.1: Mô hình thí nghiệm tổng quát
2.3.1. Phương pháp hình thái, giải phẫu
Phân tích mẫu và xác định tên loài theo phương pháp so sánh hình thái
dựa trên tài liệu “Cây cỏ Việt Nam” của Phạm Hoàng Hộ năm 1999 [5].
Phân tích giải phẫu hình thái rễ, thân, lá theo tài liệu của Hoàng Thị Sản
và cộng sự năm 2003 [7].
Các bước làm tiêu bản gồm:
- Cắt nhỏ mẫu vật, tẩy sạch bằng nước Javen, rồi rửa thật sạch bằng
nước thường.
- Nhuộm màu: nhỏ dung dịch xanh methylen lên đĩa đồng hồ có chưa
mẫu vật để trong vòng 30 phút sau đó rửa lại thật sạch bằng nước thường. Tiếp

RNase (10mg/ml), giữ ở 37º C trong 1 giờ.
8. Điện di DNA tổng số trên gel argarose 1 %.
2.3.2.2. Phương pháp nhân gen
Sau khi tách chiết và tinh sạch DNA tổng số, tiến hành nhân trình tự
đoạn matK bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi có kí hiệu matK-F và matK-R do
phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp được
trình bày ở bảng 2.1.

16