ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGÔ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU
VÀ PHÂN LOẠI CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS)
THU THẬP Ở LAI CHÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGÔ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU
VÀ PHÂN LOẠI CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS)
THU THẬP Ở LAI CHÂU

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 8 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Vũ Thị Thu Thủy

Thái Nguyên, năm 2018

Tác giả

Ngô Thùy Linh

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................ii
MỤC LỤC ..........................................................................................................iii
DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT .............................................iv
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. v
DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1
2. Mục tiêu của đề tài........................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4
1.1. Giới thiệu chung về cây Bảy lá một hoa ...................................................... 4
1.1.1. Đặc điểm, phân loại cây Bảy lá một hoa ...................................................
4
1.1.2. Phân bố, vai trò của cây Bảy lá một hoa ...................................................
5
1.2. Các phương pháp định danh thực vật ...........................................................
6
1.2.1. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu .................................................
7
1.2.2. Phương pháp sinh học phân tử .................................................................. 8
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................... 14

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 35

iv


DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
CBOL

:

Consortium for the Barcode of Life

DNA

:

Deoxyribonucleic acid

ITS

:

Internal Transcribed Spacer

kb

:

Kilobase


Bảng 2.6. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR....................................................... 18
Bảng 3.1. Một số trình tự đoạn gen matK sử dụng để xác định độ tương
đồng và sai khác với mẫu SH ..............................................................
27
Bảng 3.2. Độ tương đồng và phân ly dựa trên trình tự gen matK ..................... 27
Bảng 3.3. Một số trình tự vùng gen ITS sử dụng để xác định độ tương đồng
và sai khác với mẫu SH ....................................................................... 32
Bảng 3.4. Độ tương đồng và phân ly dựa trên trình tự vùng gen ITS ............... 32

6


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Mô hình thí nghiệm tổng quát ........................................................... 15
Hình 3.1. Hình thái cơ quan sinh dưỡng của mẫu cây Bảy lá một hoa thu
thập ở huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu .................................................... 19
Hình 3.2. Cấu tạo giải phẫu cuống lá ................................................................ 20
Hình 3.3. Cấu tạo giải phẫu thân ....................................................................... 21
Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu rễ ........................................................................... 22
Hình 3.5. Kết quả tách chiết DNA tổng số của cây Bảy lá một hoa ................. 23
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen matK bằng kỹ thuật PCR....
24
Hình 3.7. Kết quả Blast trình tự gen matK ........................................................ 25
Hình 3.8. Trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ mẫu cây Bảy
lá một hoa thu thập ở Sìn Hồ, Lai Châu .............................................. 26
Hình 3.9. Sơ đồ mô tả mối quan hệ di truyền giữa các loài Bảy lá một hoa
trong chi Paris dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matK. .......
28
Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại vùng gen ITS bằng kỹ
thuật PCR............................................................................................. 29

tiết cho 8 loài và 2 giống [20]. Tuy nhiên, tiềm năng của cây Bảy lá một hoa ở
Việt Nam còn khá phong phú và cần thiết được khai thác thêm.
Có nhiều phương pháp có thể định danh thực vật làm thuốc đảm bảo độ
chính xác và hiệu quả. Các phương pháp thường dùng như nghiên cứu và so
sánh các đặc điểm về hình thái, giải phẫu, sinh lý, hóa sinh... hướng nghiên cứu
này đã thành công trên một số đối tượng cây trồng như cây Ngô đồng đỏ, Rong
câu chỉ, Ráng thư dực [2], [3], [4]… Tuy nhiên, khi cây không còn nguyên vẹn,
hay đã được chế biến thì phương pháp nhận diện này sẽ kém hiệu quả.
Sự phát triển của công nghệ sinh học hiện đại trong những năm gần đây
có bổ sung vào hệ thống phân loại sinh vật phương pháp phân loại học phân tử.
Đây là phương pháp có độ chính xác cao, đặc biệt rất cần đối với thực vật dùng
làm thuốc muốn xác định ở cấp độ loài, ngay cả khi đã được chế biến. Việc xác

2


định chính xác tên loài là một bước quan trọng để có thể đảm bảo về chất lượng
sản phẩm. Bên cạnh đó, kết quả nhận diện có vai trò quan trọng trong việc bảo
tồn các loài có nguy cơ tuyệt chủng.
Mã vạch DNA là một phương tiện nhận biết mới của sinh học phân tử.
Một số mã vạch DNA được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong phân
loại các cây dược liệu như matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL… Theo đó gen
matK nằm trong lục lạp mã hóa cho enzyme mature K. Nhiều nghiên cứu đã sử
dụng gen matK trong việc định loại cây trồng và cũng mang lại những thành
tựu nhất định [11], [24],… Vùng gen ITS bao gồm trình tự ITS1-5.8S-ITS2
cũng là đối tượng được nghiên cứu nhiều. Hiện nay, số lượng các trình tự
nucleotide của vùng ITS đã được công bố trong ngân hàng gen thế giới khá
phong phú, thuận lợi cho việc phân tích so sánh. Các nghiên cứu phát sinh loài
thực vật dựa trên vùng gen ITS ở cây Đẳng sâm, cây Dâu, Nấm và nhiều thực
vật khác là minh chứng cho vai trò của vùng gen ITS trong nhận diện cây trồng

Cây Bảy lá một hoa là thực vật thuộc ngành Magnoliophyta (Mộc lan,
Hạt kín), lớp Liliopsida (Hành), bộ Dioscoreales (Củ nâu), họ Trilliaceae
(Trọng lâu), chi Paris (Bảy lá một hoa).
Chi Paris hiện tại được công bố có 22 loài, trong đó gồm nhiều giống
khác nhau [16]. Chỉ riêng loài Paris polyphylla kết quả thống kê cho thấy đã
gồm 8 giống. Các giống khác nhau về số lượng, hình dạng lá và sự phân bố
[32]. 8 giống thuộc loài Paris polyphylla gồm:
Giống

Phân bố

Paris polyphylla var. Alba

Quý Châu, Hồ Bắc, Vân Nam

Paris polyphylla var. chinensis

An Huy, Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng
Tây, Quý Châu, Hồ Bắc, Hồ Nam , Giang
Tô, Giang Tây, Tứ Xuyên, Đài Loan, Vân
Nam, Lào, Myanmar, Thái Lan, Việt Nam

Paris polyphylla var. latifolia

An Huy, Hà Nam, Hồ Bắc, Giang Tây,
Thiểm Tây, Sơn Tây

Paris polyphylla var. nana

Tứ Xuyên

yunanensis, Paris hainanensis [5]. Đến năm 2016, Nguyễn Quỳnh Nga và cộng
sự đã lập khóa phân loại chi tiết cho 8 loài và 2 giống [20]. Các nghiên cứu về
cây Bảy lá một hoa đều khẳng định tiềm năng của cây Bảy lá một hoa ở Việt
Nam còn khá phong phú và cần thiết được khai thác thêm.
Bảy lá một hoa là loại cây một lá mầm, thân thảo, sống lâu năm. Từ củ
nổi lên mặt đất một thân mọc thẳng, cao chừng 0,3-0,8 m, thân thon dài, trơn
nhẵn, không có cành, phía gốc có 1 số lá thoái hóa thành vảy bao lấy thân cây.
Thân mềm, mọng nước. Phần thân trên mặt đất của cây lụi hàng năm vào cuối
mùa thu. Củ có ngấn, phình to, cứ mỗi năm có thêm 1 đốt hiện ra rõ ràng, màu
xám đen. Rễ mềm, mọc dày theo củ. Giữa thân có 1 tầng lá mọc vòng, thường
từ 4 đến 9 lá. Cuống lá dài 2-3 cm, màu tím. Phiến lá hình mác, hình trứng, bầu
dục,… dài 20-23 cm, rộng 6-7 cm. Đầu phiến lá nhọn, mặt trên màu xanh đậm,
mặt dưới màu nhạt hơn. Hoa mọc trên đỉnh cây, cuống hoa dài 14 cm. Lá đài
bằng số cánh tràng. Nhụy màu tím đỏ, bầu có 3 ngăn. Nhị mảnh, có bao phấn
màu vàng nâu, xếp thành 2 vòng, xen kẽ nhau, mỗi vòng có 5 nhị [5], [20].
1.1.2. Phân bố, vai trò của cây Bảy lá một hoa
Bảy lá một hoa là cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác
dưới tán rừng kín thường xanh, dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều
mùn. Paris là một chi nhỏ, hiện chỉ có một số loài phân bố ở vùng cận nhiệt đới
hoặc ôn đới ẩm Bắc bán cầu: Trung Quốc, Ấn Độ, Nê Pan và Myanma. Ở Việt
Nam, cây Bảy lá một hoa hầu như chỉ thấy ở các tỉnh miền núi phía bắc như
Ninh Bình, SaPa (Lào Cai), Quản Bạ (Hà Giang), Sìn Hồ (Lai Châu),… [12],
[20], [32].
6


Theo dân gian, cây Bảy lá một hoa có rất nhiều công dụng để trị một số
bệnh như: bệnh gan, ung thư phổi và thanh quản, ung thư biểu mô,… Thân rễ
Bảy lá một hoa có vị đắng, hơi cay, tính hơi lạnh, hơi độc, vào kinh can, có tác
dụng xổ hạ, lợi tiểu, tiêu đờm, thanh nhiệt, giải độc. Thân rễ của cây còn chữa

Hầu hết cấu trúc của các cơ quan đều nghiên cứu ở mức độ hiển vi, vì
vậy mà các mẫu khi sử dụng phương pháp giải phẫu đều được cắt thật mỏng,
sau đó để giữ được cấu trúc bên trong tế bào, thuận lợi cho việc quan sát người
ta thường dùng phương pháp nhuộm màu. Việc nhuộm màu này giúp chúng ta
phân biệt được các thành phần cấu tạo của các cơ quan, vì mỗi một thành phần
thì bắt một màu nhất định. Nguyên tắc của phương pháp nghiên cứu hình thái
và giải phẫu chủ yếu là dựa vào việc quan sát, so sánh và trên cơ sở mẫu vật đã
thu thập được để phân tích, tổng hợp đi đến suy diễn giả thiết. Phương pháp so
sánh hình thái, giải phẫu đã cung cấp nhiều thông tin có giá trị trong định loại
thực vật [2], [3], [4], [6], [8].
Nghiên cứu đặc điểm hình thái cây Ngô đồng đỏ ở Cù Lao Chàm, nhóm
tác giả Vũ Văn Dũng và Đinh Thị Phương Anh (2016) chỉ ra rằng ở Việt Nam
có 2 loài Ngô đồng đỏ cùng thuộc chi Firmiana khác nhau về nơi sống có sự
khác biệt về nhiều đặc điểm hình thái như thân, lá, cụm hoa, hoa, quả. Những
sự khác biệt thu được là tài liệu cung cấp cho việc nhận diện mẫu cây Ngô
đồng đỏ và làm căn cứ để sử dụng bền vững và phát triển loài cây ngô đồng đỏ
ở Cù Lao Chàm [2].
Năm 2006, Lê Ngọc Hân và cộng sự đã sử dụng phương pháp phân tích
đặc điểm hình thái và so sánh các đại diện họ Ban – Hypericaceae juss ở Việt
Nam, nhóm nghiên cứu đã xác định được tông và chi thuộc họ Ban. Kết quả
nghiên cứu được sử dụng làm khóa phân loại ở mức độ chi [3].
Nghiên cứu của Lê Như Hậu (2009), khi phân tích hình thái các mẫu tiêu
bản của 7 loài Rong câu chỉ ở Việt Nam phát hiện thấy có sự thay đổi lớn về
mặt hình thái. Tuy nhiên, giữa chúng vẫn có những đặc điểm chung về cấu tạo
thân, kiểu phân nhánh, hình dạng quả. Các đặc điểm hình thái ngoài cho thấy,
tuy có sự phân bố rộng khắp và được nuôi trồng dọc theo biển Việt Nam nhưng
chúng vẫn xuất phát từ cùng một loài [4].

8


9


không được dùng cho chỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại mang nhiều
đặc điểm mong muốn. Hebert P.D, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở
Ontario, Canada từ năm 2003 đã đề xuất mã vạch DNA (DNA barcode, chỉ thị
DNA) giống như một cách để xác định loài [18].
Để đảm bảo là một mã vạch DNA điển hình cần 3 yếu tố. Thứ nhất phải
có hiệu suất nhân bản cao và trình tự có tính đặc hiệu. Thứ hai phải có tính phổ
biến. Thứ ba có khả năng phân biệt được nhiều loài một cách đồng thời [28].
Sử dụng phương pháp sinh học phân tử có thể giám định được ngay cả
khi các mẫu không còn nguyên vẹn. Việc kết hợp giữa chỉ thị phân tử DNA và
chỉ thị hình thái sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữa sinh vật này
với sinh vật khác một cách chính xác [23].
Hiện nay, nhiều loại thảo dược được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị
các bệnh, góp phần phát triển ngành công nghiệp dược liệu. Những cây dược
liệu luôn phải xác định ở cấp độ loài, vì vậy cần phải định danh chính xác để
đảm bảo được sản phẩm chất lượng và có ý nghĩa quan trọng trong việc nghiên
cứu các đặc tính đa dạng di truyền và bảo vệ các loài quý hiếm. Bên cạnh đó,
dược liệu còn bị pha trộn nhiều làm giảm đi hiệu quả của thuốc, hay dược liệu
bị thay thế bởi các thành phần chứa độc tính, nên một số trường hợp có thể thể
gây nguy hiểm đến tính mạng. Vì vậy, xác định chính xác nguồn gốc của các
loại dược liệu là điều cần thiết. Nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu
xác định nguyên liệu thảo dược bằng mã vạch DNA. He J. và cộng sự (2010)
cũng sử dụng mã vạch DNA để nghiên cứu xác định một số mẫu cây dược liệu
trong chi Aconitum [18]... Chỉ thị DNA thường dùng trong phân loại cây thuốc
là matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL …
Gen rpoC1 mã hóa 1 trong 4 tiểu đơn vị của RNA polymerase lục lạp.
Gần đây, nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra hiệu quả của việc sử dụng gen rpoC1
vào việc định danh thực vật. Nghiên cứu của Vũ Thị Thu Thủy và cộng sự

nucleotide, nằm từ vị trí 1677 đến 3224, quy định tổng hợp maturase K có 515
axit amin (KX784050) [34]. Hay như khi phân tích hệ gen lục lạp của loài
Daiswa chinensis, nhóm tác giả này cũng thu được 157847 bp. Gen matK nằm
ở vị trí từ 1651 đến 3198 quy định tổng hợp maturase K (KX784048) [34].

11


Khi sử dụng gen matK để so sánh mối quan hệ của loài có nguồn gốc từ
Rheum palmatum L (Polygonaceae), R. tanguticum (Maxim. ex Regel) Maxim.
ex Balf, R. officinale Baill., và loài gần gũi Rheum palmatum L.. Kết quả
nghiên cứu cho thấy mức độ biến đổi nội bộ loài và giữa các loài khác nhau là
khá cao [11].
Trên cây Bảy lá một hoa, việc sử dụng gen matK trong việc định danh
cũng đã được thực hiện bởi một số các tác giả. Nghiên cứu của Vũ Thị Thu
Thủy và cộng sự (2017) phân lập đoạn gen matK từ các mẫu khác nhau về địa
điểm thu thập và số lượng lá. Theo đó mẫu thu được ở tỉnh Hà Giang có 6 lá và
mẫu thu ở tỉnh Lào Cai có 7 lá. Kết quả cho thấy trình tự nucleotide của đoạn
gen matK mẫu cây 6 lá (Hà Giang) có 808 nucleotide, trình tự nucleotide của
đoạn gen matK mẫu cây 7 lá (Lào Cai) có 806 nucleotide. Tuy nhiên kết quả so
sánh sự khác biệt và tương đồng cho thấy cả 2 mẫu cùng thuộc loài Paris
polyphylla var. yunnanensis [11].
Trình tự vùng gen ITS (internal transcribed spacer) là một vùng gồm các
đoạn ITS1-5,8S-ITS2. Vùng ITS nằm trong nhân tế bào được phiên mã trong quá
trình tổng hợp rRNA. Tuy nhiên, trong quá trình trưởng thành của rRNA,
phần ITS bị cắt và nhanh chóng phân hủy. Một lợi thế của vùng ITS là nó bao
gồm 2 locut riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locut 5.8S. Vùng
ITS có nhiều ưu thế trong nghiên cứu phát sinh và đánh giá sự đa dạng di truyền
của các loài như trình tự nucleotide vùng gen ITS mang các đặc tính di truyền
của cả bố và mẹ, số lượng trình tự DNA lặp lại thích hợp cho việc khuếch đại và

cho thấy trong chi Morus trình tự ITS có sự đa dạng hơn nhiều so với trình tự
trnL-F [25].
Muthumeenakshi và cộng sự (1994) đã chứng minh có sự đa hình xảy ra
khi nghiên cứu những thay đổi trong vùng gen ITS của các dòng Trichoderma
harzianum dựa trên trình tự rRNA 18S, 5.8S và vùng gen ITS [19].
Đánh giá đa dạng di truyền trong chi Ephedra các nhà khoa học đã tiến
hành phân tích trình tự vùng ITS. Kết quả nghiên cứu xác định được nguồn gốc
lai giữa các loài và phân loại 8 được loài Ephedra [27].
Những năm gần đây, ngoài ý nghĩa phân loại, vùng ITS rất được quan
tâm ở cấp độ phân tử. Nguyễn Thị Thanh Nga và cộng sự (2012) đã tiến hành
nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu Việt Nam
thuộc chi Đẳng Sâm (Codonopsis sp), kết quả nghiên cứu đã khuếch đại thành
công vùng gen ITS và phân tích được sự đa hình trên mỗi vùng gen [33].
Quả của các loài thuộc chi Zanthoxylum trong y học Trung Quốc có công
dụng lớn trong việc chữa đau vùng thượng vị. Người ta đã phát hiện ra trong
chi Zanthoxylum có đến 200 loài khác nhau. Sun Yan-Lin và cộng sự đã tìm ra
trình tự vùng gen ITS của loài Zanthoxylum piperitum đồng thời phân biệt loài
Zanthoxylum piperitum với loài Zanthoxylum schinifolium trong chi
Zanthoxylum cũng nhờ trình tự vùng gen ITS [29].
Vùng gen ITS được sử dụng như một điểm đánh dấu hiệu quả và mạnh
mẽ, đây cũng là một mã vạch tiềm năng để phân biệt các loài khác nhau trong
họ Fabaceae [17].
Trình tự nucleotide của 22 loài thuộc chi Paris trên GenBank được sử
dụng để làm trình tự tham chiếu khi so sánh với 3 mẫu cây Bảy lá một hoa khác

13


nhau kí hiệu lần lượt là PR1, PR2, PR3. Sử dụng phần mềm Bioedit Nguyễn
Tiến Dũng cùng cộng sự (2017) cho thấy kết quả so sánh có sự tương đồng rất