ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------------------

VŨ HOÀI NAM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC
ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN
NĂNG SUẤT, CHẤT LƯỢNG CỦA NẤM
ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------------------

VŨ HOÀI NAM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC
ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN
NĂNG SUẤT, CHẤT LƯỢNG CỦA NẤM
ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris)
Ngành Công nghệ sinh học
Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC


DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ vii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài. .......................................................................................... 1
2 Mục đích nghiên cứu ...................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4
1.1. Tổng quan về Đông trùng hạ thảo .............................................................. 4
1.1.1. Tên gọi Đông trùng hạ thảo .................................................................... 4
1.1.2. Nguồn gốc và phân loại........................................................................... 4
1.1.4. Nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ........................................ 6
1.2 Giá trị nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris.................................. 7
1.2.1 Giá trị dược liệu ....................................................................................... 7
1.2.2. Giá trị dinh dưỡng ................................................................................. 11
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển nấm Đông trùng hạ thảo
Cordyceps militaris ......................................................................................... 13
1.3.1. Vai trò của giống. .................................................................................. 13
1.3.2. Yếu tố dinh dưỡng................................................................................. 14
1.4 Tiềm năng nuôi trồng Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên giá thể
nhân tạo thể rắn ............................................................................................... 15
1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ............................................... 16
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 16
1.5.2. Tình hình nghiên cứu trên Thế gới ....................................................... 19


iii
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ................................................................................................................ 21
2.1. Đối tượng, phạm vi, vật liệu nghiên cứu ................................................. 21
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 21

......................................................................................................................... 50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 53
4.1 Kết luận ..................................................................................................... 53
4.2 Đề nghị ...................................................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 55


v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BE

:

Biological efficiency

ĐC

:

Đối chứng

ĐTHT

:

Đông trùng hạ thảo

PDA

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đến sự phát triển của hệ
sợi nấm Đông trùng hạ thảo ............................................................................ 34
Bảng 3.3: bảng tổng hợp đánh giá khả năng thích nghi của hệ sợi nấm trên các
loại cơ chất giá thể khác nhau. ........................................................................ 35
Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các cơ chất gạo đến sự hình thành
và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học........................................ 36
Bảng 3.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng các nguồn carbon tới năng suất nuôi
trồng nấm Đông trùng hạ thảo ........................................................................ 40
Bảng 3.6: Bảng phân tích ảnh hưởng của nguồn carbon tới hàm lượng
Cordycepine ở quả thể nấm ĐTHT ................................................................. 41
Bảng 3.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng các nguồn ni to khác nhau tới năng
suất nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo ......................................................... 44
Bảng 3.8: Bảng phân tích ảnh hưởng của nguồn ni tơ tới hàm lượng
Cordycepine ở quả thể nấm ĐTHT ................................................................. 45
Bảng 3.9. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng muối khoáng khác nhau tới năng suất
nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo ................................................................ 48
Bảng 3.10: Bảng phân tích ảnh hưởng của nguồn muối khoáng tới hàm lượng
Cordycepine ở quả thể nấm ĐTHT ................................................................. 49
Bảng 3.11: Xác định nguồn dinh dưỡng và mức biến đổi các yếu tố dinh dưỡng 50
Bảng 3.12: Ma trận kết quả mối tương quan giữa các yếu tố dinh dưỡng tới
năng suất nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo ................................................ 51


vii
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên . ................................................... 4
Hình 1.2 Phân loại nấm Cordyceps ................................................................... 5
Hình 1.3 Vòng đời sinh trưởng của nấm Đông trùng hạ thảo........................... 6
Hình 2.1: Sơ đồ quy trình nuôi cấy nấm Đông trùng hạ thảo ......................... 30

Ascomycetes kí sinh trên ấu trùng các loài bướm thuộc chi Thitarodes. Tên gọi
của chúng bắt nguồn từ những quan sát thực tế: vào mùa Đông bào tử nấm xâm
nhiễm, ký sinh trong cơ thể ấu trùng (Đông trùng), đến mùa hè quả thể nấm mọc
chồi từ đầu con sâu nhô lên khỏi mặt đất trông giống một loại thực vật (Hạ thảo)
vì vậy nó có tên là Đông trùng hạ thảo.
Từ y học cổ truyền Trung Hoa cho đến y học hiện đại của các nước phát
triển Mỹ, châu Âu đều công nhận giá trị dược lý của đông trùng hạ thảo. C.
militaris có hàm lượng các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong quả thể:
Cordycepin có tác dụng ức chế sự phân hạch và trì hoãn sự lây lan của các tế
bào ung thư (Khan, Tania et al. 2010); Adenosine được chứng minh có tác dụng
điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch; Mannitol có tác dụng làm tăng độ thẩm
thấu của huyết tương và dịch trong ống thận, gây lợi niệu thẩm thấu và làm tăng
lưu lượng máu thận; Superoxide dismutise để phòng ngừa và điều trị xuất huyết
não, viêm loét, loại bỏ tình trạng viêm, loạn nhịp tim, phù nề, nhiễm độc, bệnh
thấp khớp, thấp khớp, viêm khớp dạng thấp, tổn thương bức xạ, nhiễm độc
thuyên tắc. Ngoài ra, trong dịch chiết Đông trùng hạ thảo còn chứa chứa nhiều
loại vitamin và acid amin thiết yếu cho cơ thể.
Do có công dụng tốt nên nhu cầu sử dụng ĐTHT ngày càng tăng cao,
trong khi đó nguồn cung cấp từ tự nhiên mỗi năm chỉ đáp ứng được m nhu cầu
thị trường. Bên cạnh đó, hoạt động khai thác quá mức có thể khiến loài nấm
này có nguy cơ bị tuyệt chủng. Trước tình hình đó, các nhà khoa học trên thế
giới như đã tiến hành nghiên cứu nuôi ĐTHT trên môi trường nhân tạo. Trong
các loài thuộc chi Cordyceps, Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris là hai
loài phổ biến và được nghiên cứu nhiều hơn cả. Các hướng nghiên cứu hiện nay


2
chủ yếu theo ba con đường: Một là ĐTHT được nuôi trên ký chủ côn trùng,
mặc dù sản lượng đã được cải thiện song vẫn chưa đáp ứng được ở quy mô
công nghiệp và chi phí sản xuất vẫn còn cao. Hai là, nuôi cấy ĐTHT trên môi

hoạt chất Cordycepine ở nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris.


4
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Đông trùng hạ thảo
1.1.1. Tên gọi Đông trùng hạ thảo
Đông trùng Hạ thảo (ĐTHT) tên khoa học là Cordyceps, chỉ hiện tượng
những loài nấm thuộc lớp Ascomycetes kí sinh trên ấu trùng các loài bọ cánh
phấn thuộc chi Thitarodes. Tên gọi chúng xuất phát từ quan sát thực tế: vào mùa
Đông bào tử nấm xâm nhiễm, ký sinh trong cơ thể ấu trùng (Đông trùng), đến
mùa hè quả thể nấm mọc chồi từ đầu con sâu nhô lên khỏi mặt đất trông giống
một loại thực vật (Hạ thảo) vì vậy nó có tên là Đông trùng hạ thảo.

Hình 1.1 Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên .
1.1.2. Nguồn gốc và phân loại
ĐTHT trong tự nhiên được phát hiện chủ yếu ở một số cao nguyên của
Nepal, Ấn Độ, Trung Quốc và Bhutan…, trung bình các cao nguyên này có độ
cao từ 3500m đến 5000m so với mặt nước biển. Dựa trên đặc điểm hình thái
cũng như đặc điểm cấu trúc phân tử, Đông trùng hạ thảo được xếp vào phân
giới nấm (Fungi), ngành nấm túi (Ascomycota), lớp Sordariomycetes, bộ


5
Hypocreales, họ Cordycipitaceae, chi Cordyceps, bao gồm 400 loài đã được
phát hiện, tuy nhiên cho đến nay người ta mới chỉ tập trung nghiên cứu 2 loài
nấm Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris có giá trị dược liệu tốt với con
người.


vào cơ thể côn trùng sử dụng nguồn dinh dưỡng trong cơ thể côn trùng. Kết thúc
giai đoạn sinh trưởng, các hệ sợi thứ cấp được liên kết với nhau tạo thành một
khối thồng nhất gọi là quả thể nấm. Quả thể nấm có màu vàng cam hoặc cam
hồng dài khoảng từ 2 – 8 cm. Quả thể nấm tiếp tục phát triển đến giai đoạn thành
thục và phát tán bào tử bắt đầu chu kì sinh trưởng và phát triển mới.


7
So với Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris nuôi trồng dễ hơn trong
môi trường nhân tạo. Gần đây, Cordyceps militaris ngày càng được xem như
là một nguồn thay thế cho Cordyceps sinensis vì các chất có hoạt tính sinh học
và tính chất dược liệu tương tự nhau. Hơn nữa, nghiên cứu gần đây cũng đã
chứng minh rằng Cordyceps militaris chứa nhiều loại thành phần có hoạt tính
sinh học như cordycepin, ergosterol, mannitol và polysaccharides....
1.2 Giá trị nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris
1.2.1 Giá trị dược liệu
 Giá trị dược liệu theo y học cổ truyền
Nấm Đông trùng hạ thảo được coi là một dược liệu truyền thống của
Trung Quốc và chữa trị được nhiều bệnh nan y. Theo y học cổ truyền của Trung
Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo được dùng để điều trị thành công các chứng rối
loạn lipit máu, viêm phế quản mạn, hen phế quản, viêm thận mạn tính, suy thận,
rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mạn tính, ung thư
phổi và thiểu năng sinh dục...
Những năm gần đây, các nghiên cứu hiện đại đã chứng minh được những
công dụng chữa bệnh và bồi bổ cơ thể mà các nhà Y học cổ truyền đã sử dụng
do các hoạt chất sinh học quý trong quả thể nấm: Cordycepin (3’deoxyadenosine) có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng u, hoạt động
kháng virus (Zhou, Meyer et al. 2002); Adenosine được cho là có tác dụng
điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch (Tsai, Lin et al. 2010); Mannitol cũng có
chức năng hoạt tính sinh học, giúp lợi tiểu, chống các chứng ho ra máu (Li,
Yang et al. 2006)… và nhiều loại vitamin khác.

Cordyceps militaris có khả năng chống lại tính độc của các tế bào u vú và ung
thư bàng quang.


9
Cơ chế chống ung thư quan trọng nhất của nấm ĐTHT là hoạt hóa lại quá
trình apoptosis (tế bào tự chết) của các tế bào ung thư. Trong một nghiên cứu
Park et al. (2009) quan sát thấy rằng dịch chiết ĐTHT ức chế sự tăng trưởng tế
bào bạch cầu U937 ở người bằng cách làm biến dạng hình thái của tế bào hoặc
làm cho tế bào chết theo chương trình apoptosis (chương trình tự chết của tế
bào) (Park, Na et al. 2009). Một nghiên cứu khác cũng chứng minh khả năng
ức chế tăng trưởng và gây ra sự chết tế bào của nước chiết nấm Cordyceps
militaris trong điều trị tế bào ung thư phổi A594.
Adenosine (C10H13N5O4)
Nucleotides (bao gồm adenosine, uridine, cytidine, uracil và guanosine)
là các thành phần quan trọng trong Cordyceps militaris (Kredich NM and
Guarino AJ 1961).. Adenosine có nhiều tác dụng dược lý, nó có thể điều trị suy
tim mãn tính và ức chế sự dẫn truyền thần kinh trong hệ thần kinh trung ương.
Các nucleosides khác cũng có thể được sử dụng để điều trị nhiều bệnh khác
nhau. Ribeiro (1995) thấy rằng adenosine ức chế sự dẫn truyền hệ thần kinh
kích thích. Dunwiddie & Masino (2001) nhận thấy rằng adenosine là một bộ
điều biến có tác dụng ức chế và tổng hợp về hoạt động thần kinh, trong đó bao
gồm quy định của giấc ngủ và mức độ hưng phấn, rối loạn thần kinh, quy định
về giữ tính nhạy cảm, vận động, giảm đau, điều hòa những tác động của ethanol
và chất gây nghiện. Tabrizchi & Bedi (2001) xem xét các đặc tính của phân
nhóm của các thụ thể adenosine trong mạch máu, cũng như ảnh hưởng của các
thụ thể adenosine trên hệ tuần hoàn ngoại biên. Carlezon et al. (2005) nhận thấy
rằng cytidine có tác dụng chống trầm cảm giống như trong các thử nghiệm bơi
ở chuột (Baik JS, Kwon HY et al.).
Cordycepic acid (D-mannitol)(C6H14O6)



11
GABA cũng có vai trò miễn dịch khuếch đại trong các bệnh viêm thần kinh
chẳng hạn như bệnh đa xơ cứng (Carmans S, Hendriks J et al. 2013).
Ergothioneine
Ergothioneine là một dẫn xuất histidine với lưu huỳnh vào vòng imidazole
và amin trimethylated (Turner E, Klevit R et al. 1986).
Nhiều thử nghiệm cho thấy đây là chất chống oxy hóa và có khả năng hoạt
hóa các tế bào chống lại một loạt các yếu tố gây stress tế bào (Cheah I and
Halliwell B 2012)
Ergothioneine đã được chứng minh là chất tác dụng ngăn ngừa bức xạ và
dọn dẹp các gốc tự do, các gốc hydroxyl, axit hypochlorous, và các gốc peroxyl
cũng như để ức chế nitrat peroxynitrite vào các protein và DNA (Dubost NJ,
Beelman RB et al. 2007).
Tuy nhiên, ergothioneine là hầu như chỉ được sản xuất bởi nấm và một số sinh
vật nhân sơ (Bello M, Barrera-Perez V et al. 2012). Ergothioneine chỉ có thể được
hấp thụ từ chế độ ăn uống và không thể tự sinh tổng hợp được ở người.
1.2.2. Giá trị dinh dưỡng
Bên cạnh các giá trị dược liệu đã được y học hiện đại chứng minh, các
phân tích dịch chiết nấm Đông trùng hạ thảo cũng cho thấy trong thành phần
của nấm có nhiều acid amin khác nhau, D-mannitol, lipit và nhiều nguyên tố
khoáng (Se, Zn, Cu...).
Tác giả Hur 2008 cũng công bố một số kết quả nghiên cứu về thành phần
hóa học của nấm ĐTHT Cordyceps militaris như sau:


12
Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng nấm ĐTHT Cordyceps militaris
(Hyun Hur 2008)


Glycine

1,84

0,52

Histedine

1,84

0,46

Arginine

5,29

0,65

Threonine

5,99

0,86

Alanine

5,18

0,98


Isoleucine

1,16

0,35

Leucine

1,43

0,46

Phenylalanine

1,15

0,42

Palmitic

24,5

21,5

Palmitoeic

2,3

2,1


Acid béo (%)


13
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển nấm Đông trùng hạ
thảo Cordyceps militaris
1.3.1. Vai trò của giống.
Quả thể nấm được sinh ra cần phải có các điều kiện cần và đủ, đó là giống
nấm và cơ chất có nguồn carbon. Trong đó, giống nấm là yếu tố quyết định
đến sản lượng và chất lượng của nấm làm ra. Một giống khỏe mạnh sẽ sinh
trưởng hệ sợi thuận lợi trên các nguồn cơ chất khác nhau và có khả năng hình
thành quả thể tốt. Mỗi giống lại có một khoảng thời gian sử dụng nhất định,
vượt qua ngưỡng thời gian này sức sinh trưởng của nấm sẽ giảm, giống bị suy
thoái. Một số dấu hiệu của giống thoái hóa bao gồm: giảm tỷ lệ sinh trưởng,
mật độ hệ sợi thấp, năng suất thấp hoặc hình thái quả thể bị biến dạng. Các
chủng thoái hóa có hoạt tính dehydrogenase giảm, quả thể nấm thay đổi sắc tố.
Bản chất của thoái hóa giống ở các chủng ĐTHT nói riêng và các loại nấm
khác nói chung là do đột biết DNA(Li, Wu et al. 2003). Càng nuôi trồng qua
nhiều thế hệ thì tần số đột biến DNA càng lớn dẫn đến các tình trạng thoái hóa
càng cao.
Một trong những nguyên nhân dẫn đến tình trạng thoái hóa giống là do
phương pháp phân lập. Hiện nay có 3 phương pháp phân lập được sử dụng
rộng rãi là: phân lập mô tế vào, phân lập đơn bào tử và phân lập bào tử phức.
Giống được tạo ra bằng phương pháp phân lập mô tế bào hoặc bào tử phức có
thời gian thoái hóa nhanh hơn, có thể sau 1, 2 lần cấy chuyển (Shrestha, Park
et al. 2004). Để hạn chế quá trình thoái hóa giống, người ta sử dụng các chủng
phân lập từ đơn bào tử.
Ngoài ra, vật liệu nuôi trồng giống cũng có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng
và phát triển của nấm trên cơ chất. Có 2 loại giống được sử dụng trong nuôi



15
1.3.2.4. Các loại vitamin
Vitamin có vai trò trong chu kỳ phát dục của Đông trùng hạ thảo
Cordyceps militaris. Tuy nhiên ĐTHT không có khả năng tổng hợp vitamin
cần thiết, vì vậy trong nuôi trồng người ta thường bổ sung thêm một hàm lượng
vitamin nhất định
1.4 Tiềm năng nuôi trồng Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên giá
thể nhân tạo thể rắn
Do có chứa nhiều hoạt chất sinh học quý: cordycepin, adenosin,
polysaccharides, ergosterol và mannitol nên từ lâu ĐTHT được coi là một loại
thảo dược quý, có nhiều giá trị dược liệu trong việc hạ đường huyết, chống
viêm, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, điều hòa hệ miễn dịch, chống oxi
hóa, tăng hoạt lực của tinh trùng. Tuy nhiên, ĐTHT trong tự nhiên sản lượng
rất ít nên để tìm kiếm và sử dụng ĐTHT tự nhiên làm dược phẩm hoặc thực
phẩm chức năng là vấn đề không khả thi (Hong,2010).
Những nghiên cứu ban đầu trên thế giới về môi trường nuôi trồng ĐTHT
được thực hiện trên côn trùng, mặc dù sản lượng đã được cải thiện song vẫn
chưa đáp ứng được ở quy mô công nghiệp và chi phí sản xuất vẫn còn cao. Bên
cạnh đó, việc tập trung sản xuất các chất hoạt chất quý trong nấm ĐTHT mà
không thu quả thể bằng phương pháp lên men lỏng cũng đang được hướng tới.
Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là khâu xử lý nguồn nước thải sau
khi thu hồi hoạt chất, đồng thời việc tách chiết thu hồi hoạt chất còn phức tạp
và giá thành cao.
Do đó, việc tìm ra nguồn cơ chất thích hợp để nuôi trồng ĐTHT trên giá
thể nhân tạo là giải pháp tối ưu. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng không
có sự chênh lệch quá nhiều giữa giá trị dinh dưỡng trong ĐTHT tự nhiên và
nuôi trên giá thể nhân tạo. Việc thu hoạch quả thể nấm trên giá thể nhân tạo
không những có thể thu hoạch được hoạt chất sinh học vốn quý trong nấm mà