BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2

PHÙNG THANH NGA

NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN
QUY TRÌNH NHÂN NHANH GIỐNG HOA CÁT TƢỜNG
(Eustoma grandiflorum) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2

PHÙNG THANH NGA

NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN
QUY TRÌNH NHÂN NHANH GIỐNG HOA CÁT TƢỜNG
(Eustoma grandiflorum) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. La Việt Hồng

HÀ NỘI, 2018


Hà Nội, Ngày 15 tháng 11 năm 2018
Học viên

Phùng Thanh Nga


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ......................................................................................... 1
2. Mục đích và nội dung nghiên cứu .............................................................. 1
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................... 2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về cây hoa Cát tƣờng .................................................. 3
1.1.1. Nguồn gốc của cây hoa Cát tường ................................................... 3
1.1.2. Phân loại ........................................................................................... 3
1.1.3. Đặc điểm thực vật ............................................................................. 5
1.1.4. Yêu cầu ngoại cảnh cây hoa Cát tường ............................................ 6
1.1.5. Đặc điểm sinh trưởng của cây hoa Cát tường.................................. 7
1.1.6. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng ...................................................... 8
1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa Cát tƣờng trên thế giới và Việt Nam ... 9
1.2.1. Tình hình sản xuất hoa Cát tường trên thế giới ............................... 9
1.2.2. Tình hình sản xuất hoa Cát tường ở Việt Nam ............................... 10
1.3. Tình hình nghiên cứu hoa Cát tƣờng trên thế giới và Việt Nam .......... 11
1.3.1. Nghiên cứu hoa Cát tường trên thế giới ......................................... 11
1.3.2. Nghiên cứu hoa Cát tường ở Việt Nam ........................................... 14
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 17
2.1. Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................... 17
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ...................................................................... 17
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ....................................................................... 17
2.1.3. Thời gian nghiên cứu ...................................................................... 17

Napthalene acetic acid

Kinetin (K)

6-furfurryl-aminopurin:
C10H9H5O

Agar

Thạch

NXB

Nhà xuất bản

MS

Murashige và Skoog, 1962

ĐC

Đối chứng

STTV

Sinh trƣởng thực vật

ND

Nƣớc dừa

sáng LED đỏ ................................................................................... 34
Hình 3.8. Ảnh hƣởng cây hoa Cát tƣờng trắng viền tím dƣới nguồn chiếu
sáng LED xanh ................................................................................ 36
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của NAA đến sự kích thích ra rễ của chồi hoaCát
tƣờng trắng viền tím ........................................................................ 38
Hình 3.10. Cây hoa Cát tƣờng trắng viền tím rèn luyện ngoài môi trƣờng
sau 5 tuần rèn luyện ........................................................................ 40
Hình 3.11. Cây hoa Cát tƣờng trắng viền tím phát triển tốt ngoài môi
trƣờng không có có sự phát triển chồi mới. .................................... 41
Hình 3.12. Cây hoa Cát tƣờng thích nghi và phát triển tốt ngoài môi trƣờng 41
Hình 3.13. Cây hoa Cát tƣờng trắng viền tím bị sâu ăn lá .............................. 42
Hình 3.14. Hoa Cát tƣờng thời điểm bắt đầu ra nụ ......................................... 43
Hình 3.15. Hoa Cát tƣờng trắng viền tím nở hoa sau thời gian trồng ............ 44


1
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Cây hoa Cát tƣờng (Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn), có nguồn gốc
từ Nam Mĩ, Mexico, Caribê, Cát tƣờng có nhiều chủng loại và màu sắc hoa rất
đa dạng nhƣ: xanh, kem, tím, vàng, hồng phai, tím đậm, trắng viền tím...Ở Việt
Nam hoa Cát tƣờng đƣợc coi là loài hoa mới lạ, vì nó không rực rỡ nhƣ hoa cúc,
lộng lẫy nhƣ hoa hồng thu hút khách bởi vẻ đẹp đơn sơ và với quan niệm Cát
tƣờng là loài hoa mang lại nhiều may mắn, nên nhu cầu sử dụng hoa Cát tƣờng
của thị trƣờng ngày một lớn và loài hoa có giá trị xuất khẩu cao [23].
Trƣớc đây hoa Cát tƣờng chủ yếu nhân giống bằng gieo hạt. Ƣu điểm
của phƣơng pháp này hệ số nhân giống cao chủ động về giống, nhƣng dễ thất
thoát, tỷ lệ nảy mầm thấp, cây sinh trƣởng phát triển chậm, cây nảy mầm từ
hạt cho thấy mức độ biến dị cao.
Các phƣơng pháp nhân giống hoa Cát tƣờng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

Góp phần bổ sung nguồn các kết quả khoa học về quá trình nhân giống
cây hoa Cát tƣờng giống trắng viền tím bằng kỹ thuật nuôi cấy mô.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả đề tài là cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng, sản xuất thử
nghiệm của cây hoa Cát tƣờng giống trắng viền tím bằng kỹ thuật nuôi cấy
mô. Góp phần cung cấp cho ngành sản xuất hoa Việt Nam cây giống sạch
bệnh, chất lƣợng đồng đều.


3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây hoa Cát tƣờng
1.1.1. Nguồn gốc của cây hoa Cát tường
Cây hoa Cát tƣờng có nguồn gốc ở khu vực có khí hậu ấm áp vùng
Nam Mỹ, Mexico, Caribê. Loài hoa này đƣợc tìm thấy ở các đồng cỏ của tiểu
bang phía Bắc Mexico, Texas, Oklahoma, Kansas, Colorado, Wyoming và
Nam Dakota [5]. Những nƣớc tiên phong trong việc gây giống này là Nhật
Bản (Deng và Harbaugh, 2006). Từ cây hoang dại có hoa màu xanh tím, qua
quá trình lai tạo, chọn lọc giống hiên nay đã có nhiều giống thƣơng mại có
màu sắc khác nhau.Từnăm 1998, cây hoa Cát tƣờng đã đƣợc nhập vào Đà Lạt
để trồng và sản xuất hoa thƣơng phẩm, với diện tích đất trồng chƣa nhiều
(khoảng 10 ha), đến 2005 diện tích trồng hoa Cát tƣờng tăng lên khoảng 20
ha. Theo số liệu của UBND thành phố Đà Lạt, diện tích trồng hoa của thành
phố năm 2010 là trên 3.500ha, trong đó diện tích trồng hoa Cát tƣờng là
khoảng 100ha chiếm 2,86 . Nghề trồng hoa nói chung và hoa Cát tƣờng nói
riêng tại đây đã mang lại những thành công đáng kể cho các hộ, tuy nhiên
trong các năm qua đã phát sinh những vấn đề bất cập trong canh tác, ảnh
hƣởng đáng kể đến thu nhập của ngƣời trồng hoa. Do đó việc nghiên cứu
nhận dạng các nhân tố tác động lên thu nhập của các hộ trồng cát tƣờng có ý
nghĩa quan trọng trong việc ban hành những chính sách góp phần thúc đẩy sự

màu xanh tía và màu vàng.
Nhóm Candy: thích hợp cƣờng độ ánh sáng trung bình và quang chu kì
ngày ngắn hoa nở đồng loạt.
Nhóm Echo: phổ biến trong giống hoa Cát tƣờng, không thích hợp với
cƣờng độ ánh sáng quá cao hoặc quá thấp, thích hợp vụ đông xuân, phổ biến
trong giống nhƣ: xanh bóng, xanh tía, hồng, hồng tía, trắng tuyền.
Nhóm Mariachi: thích hợp trồng trong chậu, đặc điểm của giống này có
số cánh hoa nhiều,c ánh hoa mỏng hơn các giống khác nên nhìn rất đẹp, các màu
phổ biến là trắng, hồng, hồng nhạt, xanh.


5
+ Giống hoa đơn:
Nhóm Flamenco: thích hợp cƣờng độ ánh sáng cao và quang chu kì ngày
dài, các màu nhƣ: xanh bóng, hồng, vàng, trắng.
Nhóm Heidi: thích hợp với cƣờng độ ánh sáng trung bình và quang chu
kì ngày ngắn,có nhiều màu để chọn.
Nhóm Laguana: là nhóm thích hợp với cƣờng độ ánh sáng cao và quang
chu kì ngày dài có hai màu: xanh đậm và xanh tía.
Nhóm Malibu: thích hợp với cƣờng độ ánh sáng trung bình và trong
mùa xuân và mùa thu có nhiều màu: hoa cà, xanh đậm, trắng, hồng, trắng
viền xanh.
Nhóm Yodel: thân hoa dài khoảng 45 - 50cm, có nhiều màu là xanh đậm,
xanh, hoa cà, hồng phấn, hồng, trắng.
1.1.3. Đặc điểm thực vật
Theo N. O. Anderson (2007) [25], cây hoa Cát tƣờng có những đặc
điểm thực vật sau:
Rễ: thuộc loại rễ cọc, có nguồn gốc từ mầm rễ của hạt, rễ phát triển theo
chiều sâu, ít phát triển theo chiều ngang. Do vậy, cây có khả năng chịu hạn cao,
rễ cây Cát tƣờng rất nhậy cảm với tác động bên ngoài. Ở giai đoạn bên ngoài

1.1.4. Yêu cầu ngoại cảnh cây hoa Cát tường
Nhiệt độ: cây sinh trƣởng phát triển tốt ở nhiệt độ ban ngày từ 18 20°C, nhiệt độ ban đêm từ 15 - 18°C. Hầu hết Cát tƣờng cho ra hoa vào
khoảng nhiệt độ từ 15 - 28°C. Nhiệt độ thấp hơn 15°C làm trì trệ quá trình
phát triển của cây [16]. Vào ban ngày khi nhiệt độ cao hơn 28°C sẽ làm cho
hoa nở sớm, rút ngắn thời gian sinh trƣởng của hoa và cho hoa kém chất
lƣợng [36]. Tùy theo từng chủng loại giống mà có yêu cầu về nhiệt độ và
quang chu kì khác nhau


7
Ánh sáng: cƣờng độ ánh sáng thích hợp cho cây hoa Cát tƣờng sinh
trƣởng và phát triển là từ 70.000 - 80.000lux. Do vậy về mùa xuân hay mùa
hè có cƣờng độ ánh sáng cao thƣờng phải che lƣới đen cho hoa. Cây hoa Cát
tƣờng thƣờng thích hợp vào thời vụ dài ngày có số giờ chiều sáng trong ngày
tối ƣu là từ 14 - 16 giờ trong ngày thì cho chất lƣợng hoa cao nhất, nếu muốn
tăng năng suất và hiệu quả cao ta nên tuân thủ những điều kiện trên.
Độ ẩm: ngoài ánh sáng độ ẩm có vai trò quan trọng rất cần thiết cho sự
sinh trƣởng của hoa Cát tƣờng, tuy nhiên độ ẩm quá cao và duy trì trong thời
gian dài thì cây dễ bị nhiễm một số loại bệnh nguy hiểm có trong đất nhƣ
bệnh lở cổ rễ (Rhizoctonia solani), bệnh đốm lá, bệnh héo lá vàng
(Fusariumsolani), bệnh thối đen rễ (Pythium spp).
Độ ẩm khoảng 70

đƣợc xem là lí tƣởng nhƣng sau khi nụ đầu tiên

đƣợc hình thành thì việc giảm độ ẩm xuốn dƣới 70% sẽ làm gia tăng chất
lƣợng của hoa, độ pH thích hợp trong khoảng 6,0 - 6,8.
Đất: cây Cát tƣờng cây sinh trƣởng và phát triển tốt trên những đất có
hàm lƣợng dinh dƣỡng cao, nhiều mùn và rễ thoát nƣớc, đặc biệt các loại đất
có chứa nhiều canxi.

hoa sớm khi thân cây còn ngắn, năng suất và chất lƣợng hoa đều giảm.
Giai đoạn 5 (81 - 150 ngày): đây là giai đoạn sản xuất hoa cắt cành,
giai đoạn này cần tạo điều kiện thích hợp để cây sinh trƣởng phát triển tốt
nhất thì cây mới cho năng suất và chất lƣợng hoa cao [38].
1.1.6. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng
Không chỉ hấp dẫn ngƣời tiêu dùng bởi màu sắc rực rỡ, phong phú,
hình dáng hoa đa dạng, hoa Cát tƣờng còn có thân cứng, có độ bền hoa lâu,
hoa có thể trồng ở trong và ngoài nhà lƣới nên hoa Cát tƣờng đƣợc sử dụng
dƣới nhiều hình thức khác nhau nhƣ dùng để cắm lọ, trồng chậu, trồng bồn,
bó làm hoa cƣới... Bên cạnh việc phục vụ nhu cầu giải trí thƣởng thức… hoa
Cát tƣờng còn mang lại nguồn lợi kinh tế khá cao. Thực tế ở Đà Lạt, từ 800 m


9
trồnghoa Cát tƣờng, trừ chi phí còn thu về hơn 300 triệu đồng. Ông Trần Huy
Đƣờng là chủ trang trại 7 ha hoa với 40 nhân công, hàng năm sản xuất cho thị
trƣờng hơn 5 triệu cành hoa các loại với doanh thu hơn 15 tỷ đồng/năm, trong
đó diện tích trồng hoa Cát tƣờng chỉ chiếm một nửa diện tích trồng hoa tại
trang trại, nhƣng thu nhập từ hoa Cát tƣờng đạt 2/3 doanh thu hoa hàng năm
của trang trại [38].
1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa Cát tƣờng trên thế giới và Việt Nam
1.2.1. Tình hình sản xuất hoa Cát tường trên thế giới
Hoa Cát tƣờng là loại hoa cắt hàng đầu cùng với các loại hoa đã đƣợc
thị trƣờng ƣa chuộng nhƣ hoa hồng, hoa cúc, hoa cẩm chƣớng... vì hoa Cát
tƣờng đẹp, đa dạng về màu sắc và hình dáng. Bên cạnh đo hoa Cát tƣờng còn
đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ cây trồng chậu hay trồng bồn. Hoa Cát tƣờng bắt
đầu đƣợc sử dụng ở Nhật Bản từ năm 1933 và đến nay nó trở thành một loại
hoa cắt cành số một với trên 129 triệu cành đƣợc bán năm 2001. Diện tích
trồng hoa Cát tƣờng ngày càng tăng nhƣ Nhật Bản chỉ từ năm 1990 diện tích
trồng Cát tƣờng khoảng 219 ha thì đến năm 2004 diện tích trồng đã tăng gấp

nói chung và hoa Cát tƣờng nói riêng rất lớn, nhƣng thực tế diện tích trồng
hoa Cát tƣờng còn rất khiêm tốn khoảng 0,2 ha (Số liệu thống kê của Viện Di
truyền Nông nghiệp năm 2009) trong khi điều kiện khí hậu, đất đai Hà Nội
chƣa hoàn toàn phù hợp cho sự sinh trƣởng, phát triển của Cát tƣờng. Ngƣời
dân có khả năng đầu tƣ thâm canh để phát triển giống hoa mới này, đây là
những điều kiện cơ bản quyết định sự thành công trong việc phát triển cây
hoa Cát tƣờng tại Hà Nội.
Nƣớc ta có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, nhiều vùng miền có đất đai phì
nhiêu, màu mỡ phù hợp với sự phát triển của hoa và cây cảnh, nhà nƣớc cũng
rất quan tâm, đầu tƣ theo hƣớng công nghiệp hóa của nghành trồng hoa. Tuy
nhiên thì diện tích trồng hoa cây cảnh còn quá thấp, tập trung chủ yếu ở vùng


11
hoa truyền thống nhƣ trên. Hoa Cát tƣờng là loại hoa mới, màu sắc đẹp nên
đƣợc thị trƣờng trong và ngoài nƣớc ƣa chuộng. Hiện nay, Nhật Bản là thị
trƣờng tiêu thụ, xuất khẩu hoa cắt cành lớn nhất của Việt Nam, chiếm 90%
tổng kim ngạch xuất khẩu của cả nƣớc [8].
Tại phía Bắc hai vùng trồng hoa Cát tƣờng đầu tiên là Tây Tựu, Mê
Linh. Hầu hết là hộ dân mua cây giống từ Đà Lạt, tìm hiểu kỹ thuật trồng
hoặc mua hạt giống bán trên thị trƣờng về tự gieo cấy. Nguồn cấp giống chƣa
đủ cùng với khí hậu miền Bắc không đƣợc thuận lợi cho sự phát triển tốt nhất
của hoa, bởi vậy chất lƣợng và sản lƣợng hoa còn chƣa cao, chỉ đáp ứng nhu
cầu trong nƣớc, chƣa có khả năng xuất khẩu. Tuy nhiên, đánh giá sơ bộ kết
quả sản xuất hoa Cát tƣờng trong vài vụ theo ngƣời dân cho thấy hiệu quả
kinh tế bƣớc đầu đạt cao gấp 1,5 - 2 lần so với trồng hoa cúc, hoa hồng [32].
1.3. Tình hình nghiên cứu hoa Cát tƣờng trên thế giới và Việt Nam
1.3.1. Nghiên cứu hoa Cát tường trên thế giới
Các nghiên cứu về nuôi cấy mô cây hoa Cát tƣờng đƣợc các nhà khoa
học trên thế giới đã nghiên cứu từ lâu và đã thu đƣợc nhiều thành công. Vật

chồi/mẫu còn môi trƣờng MS + BA 0,8 mg/l +α-NAA 0,04 mg/l cho 7,4
chồi/mẫu. Theo, M. Gong (2008) cũng ghi nhận, môi trƣờng ½ MS + IBA
0,25 mg/l cho tỷ lệ cây tạo rễ tái sinh và số rễ cao nhất [22].
Theo, Y. Zheng (2009), cho rằng môi trƣờng MS+ 1 mg/l BA + 0,15
mg/l α- NAA là thích hợp tạo chồi bất định từ lá với 74,5% lá tạo chồi, trên
môiMS bổ sung IBA 0,5 mg/l thì tỷ lệ tạo rễ 90% [28].
K. Y.Paek và cs (2000) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của Cytokinin, auxin
và than hoạt tính đến khả năng sinh trƣởng và đặc tính của chồi ngọn hoa Cát
Tƣờng. Khi sử dụng BA và kinetin ở nồng độ cao (13,32 - 22,2 và 13,94 23,23 µM) cho tỷ lệ hình thành chồi tốt nhƣng tỷ lệ chồi bị thủy tinh hóa cao.
Tăng nồng độ IAA và IBA sẽ thuận lợi cho quá trình hình thành rễ, trong khi


13
tăng nồng độ axit naphthaleneacetic thì lại ảnh hƣởng bất lợi đến quá trình
hình thành rễ. Cả rễ và chồi đều sinh trƣởng tốt trong điều kiện cân bằng than
hoạt tính. Tỷ lệ tái sinh và chồi có số lá lớn nhất là sau 4 tuần kể từ khi đƣa
cây ra khỏi môi trƣờng MS có bổ sung 4,44 mM BA + 1,47- 4,92 mM [20].
Ngoài các chất điều hòa sinh trƣởng ánh sáng ảnh hƣởng đến sự phát
sinh hình thái của các mô nuôi cấy. Ánh sáng là yếu tố quan trọng trong sự
sinh trƣởng của thực vật, tác động đến quá trình quang hợp phát sinh hình thái
của cây và có nhiều tác giả nghiên cứu quá trình sinh trƣởng của cây dƣới các
nguồn chiếu sáng khác nhau trong nuôi cấy mô.
D.T. Nhut và cs (2003) đã chứng minh đƣợc cây dâu tây in vitro phát
triển tốt nhất khi đƣợc nuôi cấy với nguồn chiếu sáng đèn LED (70

ánh

sáng LED đỏ + 30% ánh sáng LED xanh) với cƣờng độ chiếu sáng là 60
µmol/m2.s [14].
M. Tanaka và cs (1998) đã chứng minh đƣợc sự sinh trƣởng của

Các kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc giúp các nhà nghiên
cứu và sản xuất hoa Cát tƣờng nƣớc ta kế thừa kinh nghiệm, tiết kiệm đƣợc
thời gian và kinh phí để đem lại hiệu quả cao trong việc nhân giống và trồng
cây hoa Cát tƣờng trong điều kiện Việt Nam.
1.3.2. Nghiên cứu hoa Cát tường ở Việt Nam
Ở Việt Nam, Cây hoa Cát tƣờng đƣợc một số nghiên cứu công bố
nhƣ sau:
Nguyễn Sĩ Tuấn và cs (2006) đã nghiên cứu sự tái sinh chồi và rễ trực
tiếp từ mô lá của cây hoa Cát tƣờng nuôi cấy mô in vitro. Việc nghiên cứu hệ
thống tái sinh ở cây hoa Cát tƣờng một loài hoa có giá trị kinh tế cao đã mở ra
triển vọng cho việc nhân giống nhanh và cung cấp một quy trình tái sinh tần
số cao phục vụ các nghiên cứu chuyển gen. Lá của cây hoa Cát tƣờng đƣợc
cắt ngang làm đôi có kích thƣớc khoảng 0,5 x 1cm; lát mỏng cắt ngang lá có
kích thƣớc 1mm và các đoạn rễ có nguồn gốc từ lá đƣợc nuôi cấy trên môi
trƣờng MS có bổ sung BA, IBA, GA3. Tần số tái sinh chồi và số chồi trên mỗi
mảnh lá đạt cao nhất trên môi trƣờng MS có bổ sung 2,0 mg/l BA. Sự tái sinh
cả chồi và rễ đạt đƣợc kết quả tối ƣu trên môi trƣờng bổ sung 2,5 mg/l BA và


15
1,0 mg/l IBA. Khi cấy lên môi trƣờng MS không bổ sung chất điều hòa sinh
trƣởng thực vật, chồi táisinh từ các mảnh lá có sự phân đốt rất ngắn. Sự tái
sinh chồi từ lớp mỏng ngang lá đạt tần số tái sinh cao nhất (100% với 5,6 chồi
trên mẫu cấy) trên môi trƣờng MS có bổ sung 2,0 mg/l BA và 0,3 mg/l GA 3
hoặc 2,5 mg/lBA; 1,0 mg/l IBA và 0,3mg/l GA3, chồi tái sinh từ các mảnh lá
có sự hình thành thân chính phân đốt. Sự tái sinh chồi từ các đoạn rễ in vitro
đạt 100

trên môi trƣờng MS bổ sung2,5 mg/lBA, 1,0 mg/l IBA và 0,3 mg/l