BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG

CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
TRONG VIỆC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CDH1
TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ DẠ DÀY
LAN TỎA DI TRUYỀN

CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ

HÀ NỘI- 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG

CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
TRONG VIỆC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CDH1
TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ DẠ DÀY
LAN TỎA DI TRUYỀN
Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Tạ Thành Văn

truyền là một trong những yếu tố nguy cơ quan trọng. Hiện nay khoa học đã
tìm ra đột biến dòng mầm của gen CDH1, một trong những gen hay gặp nhất,
chiếm 30% số trường hợp mắc ung thư dạ dày di truyền.
Bài chuyên đề sau đây sẽ hệ thống hóa các phương pháp sinh học phân
tử đã và đang được sự dụng để đánh giá đột biến gen CDH1 trong bệnh ung
thư dạ dày di truyền.
1. Tổng quan về sinh học phân tử
1.1. Định nghĩa
Sinh học phân tử là một ngành trong lĩnh vực sinh học tập trung nghiên
cứu về các thành phần, cấu trúc và tương tác của các phân tử trong tế bào và
vai trò của các yếu tố này trong sinh lý bình thường của con người cũng như
trong các bệnh lý như ung thư.
1.2. Lịch sử
Ngành sinh học phân tử (SHPT) bắt đầu phát triển ra từ những năm
1930. Nhưng chỉ đến những năm 1950 thì ngành SHPT mới thực sự bùng nổ.
Trong khoảng 3 thập kỉ này, các nghiên cứu đều tập trung vào cơ chế tự nhân
lên của DNA và giải thích các hoạt động như mã hóa thông tin. Tuy ngành
này đã phát triển từ trước đó, nhưng thuật ngữ này chỉ được chính thức sử
dụng từ năm 1938 bởi nhà khoa học người Mỹ Warren Weaver, giám đốc của


6

Quỹ Rockefeller về khoa học tự nhiên [1]. Ban đầu thuật ngữ sinh học phân
tử chỉ bắt nguồn từ ý tưởng là đưa vật lý và hóa học để giải thích về các hiện
tượng cuộc sống. Bằng việc định nghĩa cuộc sống qua cơ chế lý hóa học,
ngành SHPT đã tập trung nguồn lực vào vấn đề liên quan đến đại phân tử.
Để sinh học phân tử phát triển, rất nhiều các công cụ nghiên cứu của các
lĩnh vực khác được đưa vào như vật lý, toán học, hóa học cũng nhưg các
ngành liên quan đến cuộc sống (gen, mô phôi, sinh lý, vi sinh…) Thực sự,

2003: hoàn thành Dự án giải mã bản đồ gen người
2015: phương pháp giải trình tự gen mới (next gen sequencing) giúp
giảm giá thành giải mã toàn bộ hệ gen xuống dưới 1000 đô la Mỹ
1.4. Ứng dụng sinh học phân tử trong ngành ung thư
Ung thư là một trong những vấn đề được quan tâm và dồn rất nhiều
nguồn lực để nghiên cứu trong những thập kỉ gần đây. Với sự phát triển của
SHPT, con người đã hiểu được nhiều các vấn đề hơn và đã ứng dụng được sự
tiến bộ của ngành SHPT trong đẩy lùi căn bệnh này. SHPT đã đóng góp vào
phát triển những các tiến cận mới trong dự phòng, chẩn đoán và điều trị. Ví
dụ như trong ung thư biểu mô tuyến đại tràng, tỉ lệ sống sau 5 năm giảm từ
90% khi khối u con khu trú xuống hơn 60% khi đã di căn vùng và chỉ còn
khoảng 5% khi đã di căn xa. Nhờ có SHPT mà một số bệnh nhân có yếu tố
gia đình được đánh giá và phát hiện đột biến gen ức chế hoặc sinh ung thư,
giúp phát hiện sớm các trường hợp có nguy cơ cao và làm tăng thời gian sống
của bệnh nhân [3]


8

Hình 2. Tỉ lệ sống sau 5 năm của các giai đoạn trong ung thư đại tràng [3]
Các liệu pháp điều trị cũng được hưởng lợi từ sự phát triển của SHPT.
Bên cạnh các biện pháp điều trị truyền thống như hóa trị, xạ trị và phẫu thuật,
liệu pháp gen cũng là một xu hướng mới được xây dựng nhờ sự hiểu biết về
các cơ chế sinh ung thư của các gen bất thường. Một trong những thành tựu
nổi bật có thể kể đến là việc sử dụng trastuzumab, một chất kháng thể đơn
dòng gắn vào receptor HER2 - một yếu tố gặp ở 25% số bệnh nhân ung thư
vú, giúp cải thiện tiên lượng sống của bệnh nhân [4, 5]


9

tục

tại

website


10

Không phải cứ xuất hiện đột biện gen CDH1 sẽ biểu hiện bệnh. Nguy cơ
mắc tích lũy UTDD tính đến 80 tuổi là 70% ở nam và 56% ở nữ. Bên cạnh
đó, có thể các trường hợp có đột biến gen nhưng là lành tính, không có khả
năng gây bệnh [9]. Các dạng đột biến thường gặp là cắt đoạn protein (bao
gồm đột biến dịch khung và đột biến vô nghĩa, đột biến chỗ nối) chiếm 75%.
Còn lại 25% là đột biến sai nghĩa gây ảnh hưởng đến chức năng. Phương
pháp phân tích cơ bản có thể phát hiện được phần lớn các dạng đột biến của
gen CDH1. Tuy nhiên vẫn có tỉ lệ nhất định trường hợp không phát hiện được
đột biến khi sử dụng các phương pháp phân tích phổ thông mà cần những
phương pháp phân tích khác bên cạnh PCR thông thường để phát hiện ra
bệnh.
2.2. Tổng quan các phương pháp phân tích, cách tiếp cận chẩn đoán gen
CDH1
Bên cạnh yếu tố lâm sàng, các công cụ sinh học phân tử là điều rất cần
thiết để xác định chính xác các bất thường của hệ gen. Phát hiện đột biến gen
CDH1 và nguyên nhân gây bệnh CDH1 cần cách tiếp cận đa mô thức và vẫn
chưa có giải pháp tối ưu để đánh giá tổng thể [10, 11]. Mỗi phương pháp có
ưu nhược điểm riêng, tùy từng trường hợp mà có thể đánh giá lựa chọn
phương pháp phù hợp. Các yếu tố cần được cân nhắc để đánh giá là khả năng
áp dụng và hạn chế của các phương pháp phân tích, khả năng kinh tế, tính
chất của nghiên cứu... Ngoài ra, do yêu cầu của từng cách tiếp cận và đặc

biến gây bệnh. Tuy vậy vẫn còn đến 50-70% số trường hợp được chẩn đoán là
HDGC nhưng chưa phát hiện được các gen gây bệnh. Đây là khoảng trống mà
khoa học vẫn chưa tìm ra. Vì vậy các nhà nghiên cứu vẫn cần tiếp tục tìm ra
các cơ chế mới và xác định được các gen gây bệnh.
Bảng 1. Ý nghĩa của các phương pháp đánh giá đột biến gen CDH1 [9]
Gene
CDH1

Phương pháp đánh giá

Tỉ lệ mang đột biến
gen được phát hiện

Giải trình tự gen thông thường
Phân tích đột biến mất/thêm đoạn gene

30%-50%
4%

Chưa rõ NA
3. Các kĩ thuật liên quan đến gen CDH1 và bệnh HDGC
3.1. Lựa chọn mẫu bệnh phẩm
Thông thường, các nghiên cứu có thể sử dụng nhiều dạng mô để phân
tích như máu, mẫu mô (tươi hoặc đúc trong khối nến paraffin), nước bọt, tóc
hoặc vị trí trừ da. Tuy nhiên, HDGC là một bệnh hiếm gặp, cần thu thập mẫu
trong thời gian dài và quy mô lớn. Vì vậy, việc sử dụng mô tươi là điều khá
khó khăn. Do đó bệnh phẩm được sử dụng trong các nghiên cứu thường là mô
đã được đúc trong khối nến parafin (từ mảnh sinh thiết tại vị trí tổn thương
hoặc biểu mô dạ dày bình thường), mẫu máu (có thể là mẫu mới hoặc đã được
lưu trữ) và nước bọt [15-18]. Các mẫu mô này sau đó sẽ tiến hành qua các

lượng nhỏ DNA mẫu thì phương pháp này có độ chính xác rất cao. Ngoài ra
thời gian thực hiện nhanh, giá thành rẻ, dễ áp dụng rộng rãi cho nhiều nghiên
cứu nên được sử dụng trong việc phát hiện đột biến gen CDH1 [15, 23-25].
Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số nhược điểm như cần có đoạn mồi
đặc trưng và dễ bị ngoại nhiễm. Một lưu ý nữa trong nghiên cứu gen CDH1 là
phương pháp này cũng không thể dùng được để phát hiện các đột biến mất
đoạn/nhân đoạn lớn, gặp trong 4-5% số trường hợp được chẩn đoán HDGC.

Hình 5. Quá trình nhân đoạn gen trong kĩ thuật PCR
3.2.2. RT-qPCR
Bên cạnh kĩ thuật PCR thông thường, RT-qPCR cũng là một phương
pháp hay được sử dụng trong các nghiên cứu về gen CDH1. Chúng thường
được sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của E-cadherin – protein do gen


15

CDH1 mã hóa [20, 26]. Người mang đột biến gen CDH1 có sự giảm mức độ
biểu hiện của E-cadherin và sinh ra ung thư. Trong kĩ thuật này, vật chất di
truyền được sử dụng là mRNA, thường lấy từ mẫu máu/ mô ngấm parafin của
bệnh nhân. Sau đó mẫu bệnh phẩm được xử lý, sử dụng enzym sao chép
ngược (reverse transcriptase) để tạo cDNA, nhân đoạn cDNA mới tạo, gắn
huỳnh quang hoặc đầu dò đặc hiệu và tiến hành phân tích định lượng (hình 6).
Có thể tham khảo kết quả phân tích của một nghiên cứu trong biểu đồ 2. Theo
đó, những người mang đột biến gen mầm có mức độ biểu hiện thấp hơn
khoảng 3 lần so với những người bình thường, sự khác biệt có ý nghĩa thống
kê. Ngoài ứng dụng trên, RT-qPCR cũng được một nghiên cứu sử dụng để đánh
giá giá trị của đột biến sai nghĩa, đột biến vị trí cắt và đột biến vùng intron trong
quá trình phiên mã [11, 18].


Hình 8. Quy trình của một phản ứng MLPA
Biểu đồ 3 thể hiện kết quả nghiên cứu về mất đoạn gen CDH1 của tác
giả Olivera. Khi đối chiếu với nhóm chứng, kết quả cho thấy ở bệnh nhân này
đã có mất đoạn gen ở exon 14,15 và 16.


19

Biểu đồ 3. Kết quả phân tích MLPA [29]
Ưu điểm của kĩ thuật này là có thể so sánh với nhóm chứng và phát hiện
được hiện tượng xóa/thêm đoạn lớn. Tuy nhiên do tính chất của kĩ thuật này
mà việc phát hiện chính xác điểm gây đột biến khó chính xác. Ngoài ra kết
quả của phương pháp cũng không giúp khẳng định nguyên nhân gây hiện
tượng lặp đoạn nằm ở cấu trúc nào của DNA [28].
3.2.4. Multiplex PCR
Multiplex PCR là kĩ thuật chuyên sâu với đặc trưng là khả năng nhân lên
nhiều đoạn gen cùng một lúc với chỉ một lượng mẫu bệnh phẩm ban đầu
(hình 8). Nếu như PCR thông thường thì chỉ có thể nhân từng đoạn gen trong
một lần thực hiện kĩ thuật thì Multiplex PCR có thể nhân rất nhiều đoạn gen
phục vụ cho nghiên cứu lớn. Nhờ kĩ thuật này mà chi phí phân tích hệ gen
giảm đi đáng kể so với việc PCR từng đoạn gen đơn lẻ. Ngoài ra, những ưu
điểm quan trọng khác là giảm thời gian thao tác bằng tay, khả năng đối chứng
nội kiểm nhằm đánh giá chất lượng của PCR, xác định được chất lượng
mẫu… Tuy nhiên nhược điểm là phụ thuộc nhiều vào chất lượng của PCR
mastermix, khả năng nhân lên kém hơn và phụ thuộc vào chất lượng DNA.
Thông thường phương pháp này ít được sử dụng đại trà. Ứng dụng quan trọng
nhất của Multiplex PCR là giúp cho các nghiên cứu quy mô lớn cần phân tích
nhiều gen một lúc.



Polyacrylamide hoặc Agarose để giải trình tự gen (hình 9).

Hình 9. Kĩ thuật giải trình tự gen trực tiếp


22

Hình 10. Đột biến c.1212delC phát hiện bằng Direct sequencing [32]
Ưu điểm của phương pháp này là giá thành rẻ, dễ thực hiện và khả năng
phát hiện đột biến tốt. Chúng có nhược điểm là thời gian để nhận kết quả lâu,
có thể lên đến vài ngày tùy thuộc vào chiều dài đoạn gen. Ngoài ra, với các
mẫu mô được thu thập từ vị trí khối u thì độ đặc hiệu của phương pháp giảm
đi, dễ gây âm tính giả. Tuy vậy nhờ những ưu thế của phương pháp này mà
phần lớn các nghiên cứu về gen CDH1 nói riêng và gen nói chung mà chúng
vẫn là sự lựa chọn hàng đầu để phát hiện bất thường.
3.3.2. Bisulfite Sequencing
Một trong những cơ chế quan trọng khởi phát ung thư là sự thay đổi của
hệ epigenetic. Epigentic có thể hiểu đơn giản là “những thay đổi kiểu hình di
truyền ổn định ở chromosome mà không do thay đổi ở chuỗi DNA” [33].
Bình thường, epigenetic có khả năng methyl hóa DNA, thay đổi sau dịch mã,
tái cấu trúc nucleosome, điều hòa RNA không mã hóa…[34, 35]. Theo đó,
những người có biến đổi ở hệ này làm thay đổi biểu hiện của gen và mất cân
bằng hệ gen. Sự methyl hóa vùng promoter của gen có thể bật hoạt gen ức chế
sinh u, tạo điều kiện để khối u phát triển.
Một trong những phương pháp đánh giá tác động của hệ epigenetic là
bisulfite sequencing. Cơ chế của bisulphit sequencing là dùng bisulphite để


23


được áp dụng trong các nghiên cứu SHPT trong ung thư dạ dày [31, 39, 40].
Bên cạnh CDH1 thì còn nhiều gen gây HDGC chưa được tìm ra. WGS và
WES là một trong những phương pháp giúp các nhà khoa học tìm ra được
những khoảng trống đó. Tuy nhiên ưu điểm của NGS cũng chính là nhược
điểm của nó. Dữ liệu khổng lồ mà phương pháp này đưa ra gây khó khăn
trong việc phân tích kết quả, xác định đúng loại đột biến gây bệnh. Ngoài ra
giá thành cao cũng là một cản trở cho việc áp dụng rộng rãi phương pháp này
trong các nghiên cứu và thực hành lâm sàng.
Ngoài những đặc điểm kể trên thì riêng với WES còn một nhược điểm
nữa là không bao phủ hết toàn bộ các exon. Chỉ có khoảng 80-90% số exon
được giải mã nên có thể làm tăng nguy cơ xuất hiện âm tính giả. Ngoài ra
WES cũng không có khả năng phát hiện được hết các biến thể số lượng bản
sao (CNV) [41]. Khả năng ứng dụng rộng rãi cho các bác sĩ lâm sàng cũng là
một yếu tố cần phải lưu ý [42].


25

3.3.3.2. Pyrosequencing
Pyrosequencing là một kĩ thuật NGS với ứng dụng chính là phát hiện bất
thường của hệ epigenetics tương tự như kĩ thuật bisulfite sequencing. Tuy
nhiên, pyrosequencing được cho là phương pháp có độ tin cậy cao hơn.
Phương pháp này ứng dụng cảm ứng quang của protein luciferase tạo ra trong
quá trình tổng hợp. Ngoài ra, chúng còn ưu thế hơn ở khả năng phát hiện
methyl hóa DNA mà không cần tạo dòng DNA như bisulfite sequencing [43].
Tuy nhiên nhược điểm là phương pháp này tốn kém và chiều dài của trình tự
được phân tích ngắn.

Hình 13. Quy trình của kĩ thuật 454 Pyrosequencing