BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
* * * * * * *
NGUYỄN HUỲNH HOÀNG MINH ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ
THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY
* * * * * IDENTIFYING Phytophthora spp. BY MOLECULAR
TECHNOLOGIES

GRADUATION OF THESIS
MAJOR: BIOTECHNOLOGY

Professor: Student:
PhD. LE DINH DON NGUYEN HUYNH HOANG MINH
Bs. TRINH THI PHUONG VY TERM: 2002 - 2006

Nguyễn Huỳnh Hoàng Minh, Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. “
ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN
TỬ ”.
Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đôn
KS. Trịnh Thị Phương Vy
Nấm Phytophthora được xem là một trong những tác nhân nguy hiểm hàng đầu
cho nền kinh tế nông nghiệp nước ta hiện nay. Dựa trên một số kết quả đạt được từ
những nghiên cứu trước đây về hình thái và sinh thái của giống nấm này, chúng tôi đã
đề nghị qui trình định danh giống nấm này trên cơ sở cấu trúc di truyền của chúng.
Mục đích của đề tài bao gồm việc sử dụng kỹ thuật PCR, kỹ thuật giải trình tự nhằm
khuếch đại và xác định vùng trình tự đặc trưng ITS1- 5,8S- ITS2. Kết quả của đề tài
tạo cơ sở cho những nghiên cứu điều tra và kiểm soát mầm bệnh Phytophthora ở nước
ta.
Sau khi thực hiện toàn bộ qui trình, chúng tôi thu được một số kết quả sau:
- Sản phẩm khuếch đại trong vùng ITS1- 5,8S- ITS2 của hai mẫu nấm trên
tiêu Bà Rịa và sầu riêng Đồng Nai là 900 bp. Trong khi sản phẩm khuếch
đại của hai mẫu nấm trên địa lan cho band 800 bp hoặc 900 bp hoặc cả hai
band trên.
- Kết quả giải trình tự hai mẫu nấm trên địa lan cho thấy trình tự của toàn vùng
ITS1- 5,8S- ITS2 khoảng 800 bp. Trong đó vùng ITS1 khoảng 225 bp; vùng
5,8S là 160 bp và vùng ITS2 là 420 bp. vi
MỤC LỤC
o0o

Trang

Lời cảm ơn iv

2.2.7 Cao su 10
2.3 Các kỹ thuật phát hiện và định danh Phytophthora 11
2.3.1 Kỹ thuật quan sát hình thái trên môi trường nuôi cấy 11
2.3.2 So sánh sự tương xứng giữa sinh sản và sinh dưỡng 12
2.3.3 Kỹ thuật protein profile 12
2.3.4 Isozyme 13
2.3.5 Huyết thanh học và kit chuẩn đoán 13
2.3.6 Kỹ thuật RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism ) 14
2.3.7 Kỹ thuật probe acid nucleic, DNA fingerprinting 14
2.3.8 Sự lai DNA-DNA 15
2.3.9 Kỹ thuật PCR và RAPD 15
2.4 Một số công trình nghiên cứu định danh nấm Phytophthora 15
2.4.1 Một số công trình nghiên cứu ngoài nước 15
2.4.2 Công trình nghiên cứu trong nước 17
2.5 Một số lưu ý trước khi thực hiện thí nghiệm 18
2.5.1 Sơ lược về trình tự ITS 18
2.5.2 Danh mục các loài Phytophthora được tìm thấy ở Việt Nam 19
3. Vật Liệu và phương pháp 21
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 21
3.1.1 Thời gian thực hiện 21
3.1.2 Địa điểm thực hiện 21
3.2 Vật liệu và hoá chất 21
3.2.1 Tăng sinh và nhân sinh khối 21
3.2.2 Ly trích DNA 22
3.2.3 Điện di 22
3.2.4 Kỹ thuật PCR 23
3.3 Phương pháp nghiên cứu 23
3.3.1 Tăng sinh và nhân sinh khối 23
3.3.2 Ly trích DNA 24
3.3.3 Kỹ thuật PCR 26
x
Danh sách các bảng Bảng 2.1. Cây tiến hoá của nấm Phytophthora………………………………… 4
Bảng 2.2. Danh mục các loài nấm Phytophthora được tìm thấy ở Việt Nam 19
Bảng 3.1. Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 25 l 26
Bảng 3.2.Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 50 l 27
Bảng 3.3.Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR 27
Bảng 4.1. Các nguồn nấm trên ngân hàng gen được dùng để so sánh 37
Bảng 4.2. So sánh trình tự nucleotide vùng ITS của hai mẫu DL1, DL2 38
Bảng 4.3. Kết quả so sánh từng vùng trên đoạn ITS1- 5,8S- ITS2 40
Bảng 4.4. Trình tự vùng gen (ITS1-5.8S-ITS2) của mẫu Phytophthora địa lan 42 xi
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

bp: base pair
Kbp Kilobase pair
DNA: Deoxyribonucleic acid
dNTP: 3’- Deoxyribonucleoside- 5’-
triphosphate
dGTP: deoxyguanosine triphosphate
dCTP: deoxycytidine triphosphate
dATP: deoxyadenosine triphosphate
dTTP: deoxythymidine triphosphate
ETDA: Ethylenediamine tetraacetic acid

được một số loài.
Ngày nay, dựa trên những tiến bộ khoa học kỹ thuật mà đặc biệt là
những tiến bộ về các kỹ thuật sinh học phân tử ta có thể giải quyết những khó
khăn trên. Các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại với các kỹ thuật như: kỹ thuật
PCR, kỹ thuật sử dụng enzyme cắt, kỹ thuật đọc trình tự,…. tác động lên cấu
trúc phân tử DNA của các loài nấm từ đó cho phép việc định danh chúng một
cách chính xác hơn. Với sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và
được sự hướng dẫn của Tiến Sĩ Lê Đình Đôn, Kỹ Sư Trịnh Thị Phương Vy ( Bộ
môn Bảo Vệ Thực Vật- Khoa Nông Học). Chúng tôi đã thực hiện đề tài ”
ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC
PHÂN TỬ ” nhằm hoàn thiện qui trình định danh nấm Phytophthora bằng các
kỹ thuật sinh học phân tử.
2
1.2. Mục đích – yêu cầu của đề tài
1.2.1 Mục đích của đề tài
Định danh nấm Phytophthora.bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. Cụ thể
là sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS4 và ITS5 để khuếch đại vùng ITS1 và
ITS2 trong ribosomal DNA của nấm Phytophthora. Sau đó dùng kỹ thuật đọc
trình tự để định danh các mẫu nấm trên.
1.2.2 Yêu cầu của đề tài
- Tăng sinh, nhân sinh khối các mẫu nấm Phytophthora trên nhiều loại cây trồng
ở một số vùng khác nhau.
- Phát hiện đoạn gen ITS1- 5,8S- ITS2 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS4 và
ITS5.

đới thì P. palmivora, P. parasitica và P. citrophthora là đặc trưng ở vùng nhiệt đới và
cận nhiệt đới; P.infestans, P.syringae và P.fragariae xuất hiện phổ biến ở vùng ôn
đới. 4
Hình 2.1. Chu kì sống của Phytophthora
(SI-AMMOUR, 2002)

2.1.1. Cây tiến hóa của Phytophthora (Andre
’
Drenth, 2001)
Bảng 2.1. Cây tiến hoá của nấm Phytophthora

Ngành Lớp Bộ Họ Giống
Chromista Oomycetes Lagenidiales
Leptomitales
Saprolegniales Saprolegniaceae Achlya
Saprolegnia
Peronosporales Pythiaceae Pythium
Phytophthora
Peronosporaceae Bremia
Peronospora
Albuginaceae Albugo

2.1.2. Chu kì sống của phytophthora


nấm dị tản (Heterothallic)(có hai kiểu lai A1và A2) chẳng hạn như P.infestans. Số còn
lại là những loài nấm đồng tản (Homothallic) bao gồm cả P. sojae hoặc P. porri.
2.1.3. Phân lập Phytophthora từ các bộ phận nhiễm bệnh của cây
Các loài Phytophthora chỉ tấn công trên các bộ phận khỏe mạnh của cây bao
gồm cả rễ. Do đó, mầm bệnh có thể hiện diện khi không có dấu hiệu rõ ràng. Các loài
Phytophthora khó phân lập từ các mô hoại tử bởi vì các mô này thường che giấu nhiều
mầm bệnh thứ cấp. Sự phân lập thành công các loài Phytophthora từ mô bệnh bao
gồm sự lựa chọn cẩn thận các mô bị lây nhiễm mới nhất. Cho nên, muốn thu được
mẫu tốt nhất từ những bộ phận này ta nên lấy mẫu từ mép của một vết thương đang
phát triển nhanh. Mẫu mô lá hay thân lý tưởng được chọn cho việc phân lập nên chứa
cả phần bệnh và phần mô khỏe. Mô thu được sau đó được xử lý vô trùng bề mặt rồi
chuyển sang môi trường chọn lọc thích hợp (A. Drenth và B. Sendall, 2004).
6
2.1.4. Một số môi trƣờng phân lập Phytophthora từ mô bệnh
- Môi trường 3-P dùng để phân lập mô mới nhiễm bệnh .
- Môi trường 3-P + 10 mg/ml pimaricin dùng để phân lập trên mô cây già hay đất.
- Môi trường Hymexazol-25 và Hymexazol-50 hạn chế sự phát triển của Pythium
đồng thời cũng hạn chế sự phát triển của một số loài Phytophthora.
- Môi trường P10VP phân lập Phytophthora từ đất và mô bị bệnh.
- Môi trường P10ARP và P5ARP là những môi trường dùng để phân lập hầu hết các
loài Phytophthora.
2.1.5. Đặc điểm hình thái của giống Phytophthora
Ta có thể xác định một số loài Phytophthora thông qua một số đặc điểm hình
thái sau (A. Drenth và B. Sendall, 2004):

Pythiaceae và chúng có mối quan hệ di truyền rất gần nhau. Sự khác nhau giữa hai
giống này bao gồm sự khác nhau về cách tạo ra bào tử động: Ở Phytophthora bào tử
động được sản xuất bên trong túi bào tử. Ở Pythium, bào tử động phát triển bên trong
nang được sản xuất bởi túi bào tử. Đây là đặc điểm quan trọng nhất dùng để phân biệt
Phytophthora và Pythium. Các đặc điểm khác chỉ từ đặc điểm này mà ra.
2.2. Một số bệnh Phytophthora đƣợc nghiên cứu ở Việt Nam
Những thông tin chính quan tâm đến sự hiện diện, sự phân bố của bệnh
Phytophthora ở việt Nam được điều tra và kiểm soát bởi Viện Bảo Vệ Thực Vật Quốc
Gia ở Hà Nội. Từ những kết quả điều tra và những nghiên cứu ngoài đồng, 13 loài
Phytophthora đã được tìm thấy ở Việt Nam. Sau đây là những thông tin về bệnh
Phytophthora trên một số cây trồng chính tại Việt Nam theo ghi nhận của Thanh,
Ngo, Viên và Andre’ Drenth năm 2004.
2.2.1. Cà chua và khoai tây
Bệnh tàn lụi lá là bệnh chính trên nhóm cây trồng này. Được nghiên cứu ở
vùng đồng bằng sông Hồng trong những năm 1960. Tác nhân gây bệnh là
Phytophthora infestans và bệnh xuất hiện hàng năm từ tháng 12 đến tháng 3 khi điều
kiện khí hậu lạnh và ẩm; gây mất mùa 30 – 70%, trong trường hợp xấu bệnh gây mất
mùa toàn bộ (Vũ, 1973). Điều đáng lưu ý là phạm vi ảnh hưởng của bệnh cao hơn
mức trung bình ở những vùng đất sét. Bệnh dược khống chế bằng phun 1% Bordeaux.
Ngoài ra thuốc diệt nấm Maneb và Zineb 0,2 – 0,3% a.i. cũng được xem là có hiệu
quả phòng chống P. infestans cao.
2.2.2. Khoai sọ
Bệnh tàn lụi lá gây ra bởi P. colocasiae được xem là bệnh chính trên khoai sọ ở
Bắc Việt Nam. Bệnh được báo cáo đầu tiên bởi Roger (1951). Nhiệt độ ấm (24 –
30
0
C) và ẩm độ cao là yêu cầu cho bệnh lan rộng. Bệnh xuất hiện hằng năm, bắt đầu 8

P. palmivora là tác nhân gây bệnh ở sầu riêng, bao gồm thối rễ, loét thân, thối
trái và rụng lá. Nó được tìm thấy trong tất cả các vùng trồng sầu riêng ở những vùng
cả miền Nam và miền Trung Việt Nam. Trong năm 2001, bệnh đã ảnh hưởng đến cả
các vùng thấp trồng sầu riêng và đặc biệt nghiêm trọng ở tỉnh Quảng Nam. Trong 9
3075 cây trồng ở xã Quế Trung, có 2138 cây bị chết do P. palmivora, gây thiệt hại
kinh tế 15 tỉ đồng VND (1,5 triệu USD). Những nơi khác, bệnh đã được tìm thấy phổ
biến nhất ở Cái Bè, Tiền Giang, với 24,6% cây bị nhiễm bệnh. Tỷ lệ mắc bệnh có liên
quan với tuổi cây, những cây hơn 10 tuổi là mẫn cảm với bệnh nhất.
2.2.6. Mận
Trong những năm gần đây bệnh đốm đen trên mận (Prunus salicilas) đã làm
giảm lượng thu hoạch một cách đáng kể ở tỉnh Bắc Hà và Mộc Châu. Phytophthora
cactorum được nhận biết là tác nhân gây bệnh. Ở Bắc Hà vào tháng 3 năm 1996, bệnh
gây thiệt hại nghiêm trọng trên 300ha mận làm mất mùa 20%. Suốt những năm 1997
và 1998, bệnh lan rộng ít hơn nhưng mức độ tàn phá thì mãnh liệt hơn, với những
vướn bị đốm đen thì mất mùa trên 50%.
Triệu chứng bệnh trên mận là những điểm úng nước màu trắng xám trên trái
non, phát triển thành những đốm đen trũng với rìa mép màu nâu. Trong vài trường
hợp bệnh nặng, toàn bộ trái bị khô quắt lại và rụng khỏi cây. Những đốm trũng được
bao phủ bởi những sợi nấm trắng trong điều kiện ẩm ướt, P. cactorum được phân lập
từ những đốm đen trong điều kiện này.
Nhiệt độ mát (nhiệt độ ngày 14 – 18
0
C), chênh lệch nhiệt độ ngày đêm cao, ẩm
ướt và có sương mù được xem là điều kiện lý tưởng cho P. catorum lây nhiễm. Do vật
bệnh tăng nhanh vào tháng 3 và đầu tháng 4, chậm dần khi nhiệt độ tăng dần lên gần
cuối tháng. Và cây mận chưa trưởng thành mẫn cảm với bệnh đốm đen hơn cây mận
đã trưởng thành. Vào tháng 3 năm 1998, ở tỷ lệ bệnh trên cây mận hai năm tuổi là 2.3. Phát hiện và định danh Phytophthora
Hiện nay để phát hiện Phytophthora, người ta dựa trên nhiều kỹ thuật khác
nhau
2.3.1. Kỹ thuật quan sát những đặc điểm về hình thái của Phytophthora trên môi
trƣờng nuôi cấy
Đây được xem là kỹ thuật định danh cơ bản bởi vì nó xuất hiện sớm và được sử
dụng rộng rãi trong quá trình phân lập, định danh các loài nấm cũng như vi khuẩn gây
bệnh.
Những đặc điểm hình thái làm cơ sở để nhận biết nấm Phytophthora bao gồm:
hình dạng túi bào tử, chóp đầu và tính rụng; hình thái túi bào tử; sự hiện diện của bào
tử vách dày và sợi nấm trương phồng; sự tiếp xúc giữa túi đực và túi noãn và tổ chức
hữu tính là cùng tản hay khác tản
Hình 2.2. Một số bệnh do Phytophthora gây ra trên một số cây trồng;
(1) Loét thân cây ca cao do P.palmivora; (2) Thối rễ tiêu do P.capsici; (3) Tổn
thƣơng thân cà chua do P.infestans; (4) Thối nõn dứa do P.nicotianae