11
Môi trường thông thường dùng cho quá trình nhận biết Phytophthora: V-8
juice, cà rốt agar, lima bean agar.
Khi ủ ở nhiệt độ thích hợp, mẫu nấm nuôi cấy sẽ có những biểu hiện hình thái
đặc trưng cho loài. Đặc điểm sợi nấm, hình dạng tản nấm hoặc khả năng hình thành bộ
phận vô tính như túi bào tử, bào tử vách dày (chlamydospore) trên bề mặt môi trường
nuôi cấy là đặc điểm quan trọng để phát hiện Phytophthora.
Với kỹ thuật trên ta có thể phát hiện một số loài Phytophthora chẳng hạn: loài
P. capsici với dạng tản nấm đồng nhất, túi bào tử hình thành nhiều nhưng không có sự
hiện diện của bào tử vách dày (chlamydospore). Trong khi P. parasitica với dạng nấm
xòe ra, túi bào tử và bào tử vách dày (chlamydospore) hình thành phong phú trên môi
trường nuôi cấy.
Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian, công sức. Nó không phải là
giải pháp tốt cho những kiểm tra thường lệ trên một số lượng mẫu lớn (Drenth và
Irwin, 2001). Mục đích định danh muốn thực sự đạt hiệu quả cao, ta phải kết hợp đồng
thời kỹ thuật quan sát hình thái với các kỹ thuật hiện đại về sinh hoá hay sinh học
phân tử. Chúng tôi xin giới thiệu một số kỹ thuật phổ biến nhằm phát hiện và định
danh một số giống nấm gây bệnh thường gặp (James C. Correll. Genetic,
Biochemical, and Molecular Techniques for the Identification and Detection of
Soilborne Plant-Pathogenic Fungi)
2.3.2. So sánh sự tƣơng đồng về sinh sản và sinh dƣỡng
Kỹ thuật so sánh tính tương đồng về sinh sản thường được sử dụng để xác định
và mô tả mật độ lai của loài, đặc tính sinh học giữa các loài, bên trong loài. Kỹ thuật
so sánh tính tương đồng về sinh dưỡng thường được sử dụng để xác định các tiểu
quần thể clone hoặc các cá thể trong một loài. Hai kỹ thuật này khác nhau không
nhiều về di truyền và cơ chế.
Giới hạn của kiểm tra tính tương quan sinh sản bao gồm những điều sau: khó
khăn phải đối mặt trong việc tái sinh những điều kiện lai thích hợp trong môi trường
thuần khiết; tất cả những chủng kiểm tra thích hợp trong những quần thể lai khác nhau

chuẩn bị so với điện di bằng gel polyacrylamide và tinh bột
2.3.5. Huyết thanh học và kit chẩn đoán
Việc ứng dụng kháng thể trong việc kiểm tra và phát hiện nấm gây bệnh có
nguồn gốc từ đất đã ra đời 5 - 10 năm trước. Nhiều phương pháp thường được sử dụng
để sản xuất ra huyết thanh miễn dịch các loại bệnh cây do nấm gây ra mà không cần
phải hiểu biết về mặt di truyền của nguyên liệu nấm bệnh (vách tế bào, bào tử, các
protein hòa tan,…) đã tạo ra huyết thanh miễn dịch đa dòng đặc biệt. Vấn đề gặp phải 13
với kháng thể sử dụng là sự thiếu tính chuyên biệt và đặc hiệu trong hầu hết chất nền
là mô cây hay đất.
Kháng thể đơn dòng được chấp nhận như một dụng cụ chẩn đoán và phát hiện
ở mức độ loài và dưới loài. Kháng thể đơn dòng có thể ở cấp độ giống, loài, hay các
chủng đặc biệt.
Các kit chẩn đoán thường kiểm tra và phát hiện các mầm bệnh từ đất dựa vào
kỹ thuật kháng thể đơn dòng hay đa dòng. Những kit này có thể chứng minh rằng sự
cần thiết của các chẩn đoán nhanh và chính xác. Những phát hiện nhanh thường cần
thiết khi điều đó cần được cung cấp lời giải thích cho việc sử dụng các loại thuốc diệt
nấm. Các kit chuẩn đoán thông thường nhằm cung cấp hai mục đích: chẩn đoán và
nghiên cứu. Câu hỏi được đặt ra là các kit này có hiệu quả như thế nào khi quản lí
bệnh.
2.3.6. Phân tích đa dạng độ dài các đoạn đoạn đƣợc phân cắt (RFLP)
Phân tích RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) được dùng để
xác định mối quan hệ phân loài của nấm. Phản ứng RFLP bao gồm nhiều bước sau: ly
trích và tinh sạch DNA từ cơ quan hay genome; sử dụng enzyme cắt để phân cắt các
đoạn DNA; điện di phân tích các đoạn DNA trên gel agarose; thu hình các đoạn DNA
bằng cách nhuộm với ethidium bromide hoặc chuyển các đoạn DNA sang màng
nitrocellulose hay màng nylon (kỹ thuật Southern blot) và đánh dấu với các probe có
đánh dấu hay không đánh dấu phóng xạ lai với các các đoạn DNA. Blot sau khi lai

giữa các loài thường rất đáng kể.
2.3.9. Kỹ thuật PCR và RAPD
Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật nhân đoạn DNA dựa
vào các base trình tự. Kỹ thuật này thường dùng để xác đinh mối quan hệ phát sinh
loài giữa các loài và là kỹ thuật ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học (Amheim
và cộng sự, 1990; White và cộng sự, 1990). PCR bao gồm enzyme khuếch đại một
trình tự DNA đặc hiệu. Vùng thường được sử dụng để khuếch đại là vùng lập lại
không mã hóa ITS ( Internal Transcribed Spacer) trong RNA ribosome, vùng này có
giá trị thay đổi giữa các loài nấm và do đó có thể xác định mối quan hệ giữa các loài
(Bruns và cộng sự, 1992). Kỹ thuật này rất có giá trị bởi tính tiến hóa ở mức độ cao
của các loài và các chủng có thể được so sánh. PCR rất có giá trị trong việc xác định ở
mức độ loài và chủng. Nó phù hợp để xác đinh các nhóm, các chủng đặc biệt.
Gần đây, kỹ thuật khuếch đại các đoạn đa hình RAPD (Randomly Amplified
Polymorphic DNA) được phát triển (William và cộng sự, 1990). RAPD nhằm sử dụng
những cặp mồi khoảng 10 base để nhận ra nhiều đoạn DNA khác nhau trên toàn DNA
sinh vật (đoạn lớn nhất có kích thước khoảng 1kb). Sự xuất hiện, vắng mặt và sự khác
nhau về các band DNA cho phép xác định sự đa dạng giữa chúng. 15
2.4. Một số công trình nghiên cứu định danh nấm Phytophthora
2.4.1. Một số công trình nghiên cứu ngoài nƣớc:
Sử dụng cặp mồi ITS để khuếch đại vùng ITS trên nấm Phytopthora. Sản phẩm
PCR đem đi phân tích mối quan hệ di truyền với hơn 35 loài bằng ba enzyme cắt AluI,
TaqI, MspI hoặc được giải trình tự để so sánh với 17 loài nấm Phytophthora khác
bằng cách dùng phần mềm so sánh trình tự PHYLIP [7].
P. palmivora được phân lập từ cây cacao và cây dừa. P. capsici được phân lập
từ ca cao, tiêu đen và tiêu chuông đã được chọn lọc từ nhiều địa phương khác nhau
của Ấn Độ. Tác giả sử dụng cập mồi ITS1, ITS2 để khuếch đại vùng ITS của gen
rDNA bằng kỹ thuật PCR và phân tích AFLP. Dòng phân lập của P. capsici (P575) từ


vùng ITS của chúng. Cặp mồi CAPFW/CAPRV1 khuếch đại sản phẩm 452bp trong
khi cặp mồi CAPFW/CAPRV2 khuếch đại đoạn 595bp. Cặp mồi CAPFW/CAPRV2
trong PCR dùng để phát hiện đoạn gel của P.capsici trong cây được chủng bệnh. Kết
quả xuất hiện sau 8 giờ chủng bệnh trên mẫu gốc bị ảnh hưởng trong khi cây vẫn chưa
thấy sự biểu hiện bệnh của cây [8].
2.4.2. Nghiên cứu trong nƣớc
Sử dụng hai kỹ thuật mô tả hình thái và PCR định danh được một số loài nấm
như Phytophthora capsici gây bệnh trên hồ tiêu ở Bà Rịa Vũng Tàu, Phytophthora
parasitica gây bệnh trên sầu riêng Đồng Nai, Phytophthora palmivora gây bệnh trên
sầu riêng và lan Dendrobium ở Đắc Lắc và Tp. HCM [1].
2.5. Sơ lƣợc về trình tự ITS và danh mục các loài Phytophthora ở Việt Nam
2.6.1. Sơ lƣợc về trình tự ITS (Internal Transcribed Spacer)

Sự lựa chọn trình tự DNA dùng cho việc phát hiện đặc biệt giống Phytophthora
và các loài thuộc giống này giữ vai trò quan trọng trong quá trình tìm ra những trình
tự có tính ổn định cao. Các trình tự đó phải thể hiện sự khác biệt đặc biệt sao cho ta có
thể phân biệt được dòng phân lập ở cấp độ loài hay giống của chúng. Gen mã hóa
vùng ribosomal RNA trên sinh vật Eukaryote đảm bảo được chất lượng này. Chúng là
một phần thiết yếu của sự sống tế bào và các vùng biểu hiện mà vùng này có sự khác
biệt về sự thay đổi trình tự giữa các loài. Mặt khác, độ nhạy của các kiểm tra chẩn

P. infestans Khoai tây Tàn lụi lá 1951 Roger (1951)
Cà chua Tàn lụi lá
Cà trứng Tàn lụi lá
P.nicotianae Dứa Thối nõn 2001 Đặng Vũ Thị Thanh
và cộng sự (2004)
Thuốc lá Thân đen 1967 NIPP (1975)
Họ cam chanh Loét thân 2002 Đặng Vũ Thị Thanh
và cộng sự (2004)
P.palmivora Sầu riêng Tàn lụi lá 2000 Đặng Vũ Thị Thanh 18
và cộng sự (2004)
Dừa Loét thân 2002 Đặng Vũ Thị Thanh
và cộng sự (2004)
Cacao Thối trái 2002 Đặng Vũ Thị Thanh
và cộng sự (2004)
Caosu Tàn lụi lá 1965 Đặng Vũ Thị Thanh
Vệt đen và Hà Minh Trung (1999)
Rụng lá
P.durian Sầu riêng Loét 2002 Đặng Vũ Thị Thanh
và cộng sự (2004)
Phytophthora sp Cao su Loét thân 1965 Đặng Vũ Thị Thanh
và Hà Minh Trung (1999)
Phytophthora sp Ziziphus Thối trái 1997 Đặng Vũ Thị Thanh
và Hà Minh Trung (1999)
Phytophthora sp Nhãn Thối trái 1995 Đặng Vũ Thị Thanh
Tàn lụi lá và Hà Minh Trung (1999)
- Quá trình tăng sinh, nhân sinh khối được thực hiện tại Phòng thí nghiệm
Bệnh Cây – Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật – Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí
Minh.
- Quá trình chiết tách DNA và phản ứng PCR được thực hiện tại Phòng thí
nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật – Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh
– Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu và hóa chất:
Chúng tôi tiến hành tăng sinh nhân sinh khối 2 mẫu nấm Phytophthora phân lập
trên sầu riêng Đồng Nai, tiêu Bà Rịa và 2 mẫu nấm Phytophthora trên địa lan Đà Lạt
của kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy. Các mẫu nấm này đã được định danh bằng kỹ thuật
quan sát hình thái.
3.2.1 Phục hồi và nhân sinh khối
a. Vật liệu và hóa chất
Đường Glucose
Agar
Khoai tây
Cồn 70% và Cồn 96%
Cà rốt
CaCO
3

3.2.2 Ly trích DNA
a. Vật liệu và dụng cụ:
 Máy vortex
 Máy ủ nhiệt độ 60
0
C
 Máy li tâm Siqma
 Ống nghiệm(eppendorf) 1,5 ml


PGA.
Thành phần trong 1lít môi trường tăng sinh PGA ( Potato – Glucose Agar)
- Khoai tây 200gram
- Glucose 20gram
- Agar 15gram
- Nước cất vừa đủ 1000ml
Môi trường PGA được hấp tiệt trùng ở 121
0
C/ 1 atm / 20 phút, được đổ ra đĩa
petri. 21
Tiến hành cấy các dòng nấm Phytophthora từ các mẫu khác nhau vào các đĩa môi
trường PGA. Sau đó, các đĩa môi trường này được ủ ở nhiệt độ 25
0
C – 28
0
C.
Sau khoảng 3 – 4 ngày, khi tản nấm đã hình thành và có đường kính khá lớn ( 4
– 5 mm) ta tiến hành cấy mẫu nấm vào môi trường nhân sinh khối lỏng ( môi trường
cà rốt ).
Thành phần có trong 1l môi trường cà rốt
- Cà rốt 600gram
- CaCO
3
15gram
- Nước cất vừa đủ 1000ml
Cách thực hiện: Cà rốt gọt vỏ, rửa sạch, bào mỏng xay nhuyễn cùng với 700 ml
nước cất; hấp tiệt trùng 100

Có hai qui trình ly trích DNA được sử dụng 22
3.3.2.1 Qui trình 1
- Mỗi eppendorf ly trích chứa khoảng một phần ba eppendorf nấm.
- Cho vào mỗi eppendorf 750 l Lysis buffer.
- Ủ ở nhiệt độ 65
0
C trong 1 giờ.
- Cho thêm 500 l hỗn hợp Phenol /Chloroform/ Isoamyl alcohol (25:24:1), lắc
nhẹ dung dịch có màu trắng đục.
- Ly tâm 13000 rpm/ 15 phút/ 28
0
C, hút pha trên cho vào một eppendorf mới.
- Cho isopropanol vào theo tỉ lệ 2:1, dung dịch xuất hiện kết tủa.
- Ly tâm 13000 rpm/ 5 phút/28
0
C, thu nhận DNA cô đặc có màu trắng đục ở đáy
eppendorf.
- Rửa mẫu nhiều lần bằng Ethanol 70%.
- Hong khô mẫu.
- Hòa tan mẫu với lượng TE 0,5X hay nước cất hai lần vô trùng.
3.3.2.2 Qui trình 2
- Sử dụng mỗi eppendorf chứa khoãng một phần ba eppendorf mẫu.
- Cho vào mỗi eppendorf 750 l Lysis Buffer.
- Ủ ở 65
0
C trong một giờ.
- Cho thêm 500 l hỗn hợp Phenol /Chloroform/ Isoamyl alcohol (25:24:1), lắc

20 phút/ 250mA. Sau đó, miếng gel được nhuộm Ethidium Bromide trước khi đọc kết
quả trên máy Geldoc.
DNA tổng số thu được phải được pha loãng ở nồng độ thích hợp để tiến
hành phản ứng PCR. Nồng độ DNA chạy phản ứng PCR nằm trong một khoảng khá
rộng từ 3ng đến 100ng tùy thuộc mẫu DNA.
3.3.3 Kỹ thuật PCR
Hóa chất cần pha cho phản ứng PCR.Chủ yếu có 3 loại
- Pha dNTPs có nồng độ là 2,5mM.
- Pha loãng hai primer ITS4, ITS5 ra nồng độ 100pmol/ l.
- Pha loãng mẫu DNA sau cho lượng DNA < 100ngram/ l.
- Nhiệt độ bắt cặp Tm = 2*(A+T) + 4*(G+C).
- Trình tự cặp primer chạy PCR lần lượt là:
ITS4 ( 5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’)
ITS5 ( 5’ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’)

Bảng 3.1.Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 25 l
Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích
PCR buffer 10X 1X 2,5 l
MgCl
2
50mM 1,5mM 0,75 l
dNTPs 2,5mM 0,2mM 2 l
Primer ITS4 100pmol/ l 10pmol/ l 0,1 l
Primer ITS5 100pmol/ l 10pmol/ l 0,1 l
Taq DNA polymerase 5UI 0,5UI 0,1 l
DNA khuôn mẫu <100ngram 1 l 24
Nước cất vừa đủ
94
o
C
56
o
C
72
o
C
72
o
C
3 phút 1 phút
45 giây
1 phút
5 phút

Kiểm tra sản phẩm PCR :
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose nồng độ
1% - 1,5%.
Thành phần gel 1% chạy điện di:
Dung dịch TAE 0,5X 12,5ml
Agarose 1,25g
buffer), ủ hỗn hợp trên ở 60
0
C trong 15 phút.
- Ly tâm 3000 rpm/ 30 giây.
- Hút mẫu cho vào cột GFX, để mẫu ổn định trong 1 phút.
- Ly tâm 9000 rpm/ 30 giây.
- Thêm dung dịch wash buffer với lượng tương đương capture buffer cho vào.
- Ly tâm 9000 rpm/ 30 giây.
- Đặt cột vào eppendorf mới.
- Hút 15 l elution buffer nhỏ vào cột GFX, ủ khoảng 3 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 9500 rpm/ 2 phút, lấy cột GFX ra.
- Giữ mẫu tinh sạch ở 4
0
C.
Mẫu PCR tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. 27
Trình tự được giải trực tiếp bằng máy giải trình tự ABI TRISM 3100.
3.3.5. Xử lý kết quả giải trình tự:
Ta sử dụng một số phần mềm như sau:
- Sử dụng phần mềm Chromas145-95 để xử lý trình tự
- Phần mềm BLAST để so sánh trình tự với các loài Phytophthora đã được giải
trình tự trên ngân hàng gen.( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
- Phần mềm ClustalX để so sánh độ tương đồng của trình tự và vẽ cây sinh loài
bằng phần mềm Treeview.


kỹ thuật sinh học phân tử quan trọng. Do đó nó đóng vai trò thu nhận sản phẩm DNA
cho những phản ứng tiếp theo sau bao gồm kỹ thuật PCR và kỹ thuật giải trình tự.
Chúng tôi đã tham khảo qui trình ly trích của Lee và Taylor (1990) sau đó cải tiến
thêm một số bước cho phù hợp với mẫu nấm Phytophthora. Trong bước ly trích này
chúng tôi áp dụng 2 qui trình ly trích khác nhau đã được đề cập ở trên.
Kết quả điện di 100 V/ 15 phút/ 400 mA sản phẩm trên gel agarose 0,8% chúng
tôi thu nhận được ở hai qui trình ly trích có sự khác nhau khá rõ: 29
DNA tổng số
Hình 4.2. Sản phẩm của qui trình ly trích 2
Qui trình ly trích 1 cho kết quả ly trích chưa đạt được hiệu quả. Chúng tôi
không thu được DNA. Phần tạp còn quá nhiều Qui trình ly trích 2 đạt được nhiều hiệu
quả hơn. Sản phẩm DNA thu được ở dạng tinh sạch khá cao, loại bỏ được tạp nhiễm.

Sau khi hoàn thiện được quy trình phản ứng PCR đáng tin cậy cho mục đích
khuếch đại vùng ITS chúng tôi tiến hành những phân tích đồng thời thực hiện phản
ứng khuếch đại vùng ITS của dòng nấm Trichoderma làm đối chứng định danh nấm
Phytopthora. Chạy điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% trong 75 V/45 phút/
250 mA.
Sản phẩm DNA khuếch đại vùng lặp lại ITS có kích thước khoảng 900bp.
Trong bốn mẫu nấm phân tích chỉ có ba mẫu cho kết quả band 900bp. Trong cùng điều
kiện đó, phản ứng khuếch đại vùng ITS của nấm Trichoderma cho band có kích thước
khoảng 650 – 700bp. Kết quả này khá phù hợp với những nghiên cứu định danh nấm
Phytopthora trên vùng ITS (Cooke và Duncan, 1997; Trịnh Thị Phương Vy, 2005).
Tuy nhiên, kết quả PCR mẫu DL2 trái với kết quả định danh bằng kỹ thuật quan sát
hình thái. Kết quả định danh hình thái của kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy khẳng định mẫu
DL2 thuộc giống Phytophthora nhưng kết quả PCR trên vùng ITS cho band có kích
thước khoảng 800bp.


và ly trích lại hai mẫu này. DNA mẫu được pha loãng ở hai nồng độ 30ng và 10ng.
phản ứng PCR lặp lại với cùng điều kiện phản ứng trên hai mẫu ở hai nồng độ này.
Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho ta thấy rằng, sự phụ thuộc của sản phẩm PCR
vào nồng độ DNA mẫu.
900bp

Hình 4.4. Kết qủa phản ứng PCR
(1) TBR; (2) SRDN; (3) ladder; (4) DL1 ;
(5) DL2; (6) mẫu Trichoderma làm đối chứng