B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

NGUYN HI PHNG

xác định đa hình đơn nucleotide
a17893g
của gen xrcc3 trên bệnh nhân
ung th buồng trứng

LUN VN THC S Y HC

Hà Nội - 2017


B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

NGUYN HI PHNG

xác định đa hình đơn nucleotide
a17893g
của gen xrcc3 trên bệnh nhân
ung th buồng trứng
CHUYấN NGNH

Gen-Protein, PGS.TS. Trần Vân Khánh - Phó Giám đốc Trung tâm Nghiên
cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, những người Thầy đã truyền đạt
những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận
lợi để giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy, Cô Bộ môn Hóa sinh,
Trường Đại học Y Hà Nội đã dạy dỗ và truyền đạt những kiến thức quý báu
trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo
Sau Đại học, Trường Đại học Y Hà Nội. Khoa Sinh Hóa, Khoa Huyết Học,
Khoa Phụ 3 - Bệnh viện Phụ Sản Trung Ương đã giúp đỡ, động viên, khích lệ
tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.


Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến CN. Nguyễn Quý Hoài, CN. Vũ Thị
Hoài Thu, CN. Tạ Thành Đạt và CN. Trần Quốc Đạt cùng toàn thể các
anh, các chị đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập kỹ thuật, hoàn thiện quy
trình kỹ thuật nghiên cứu tại Trung tâm.
Cuối cùng, tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng và tình yêu
thương của Cha mẹ tôi, cùng sự ủng hộ của gia đình, bạn bè, đồng nghiệp,
những người đã luôn ở bên cạnh động viên, ủng hộ, giúp đỡ và tạo điều kiện
cho tôi và giúp đỡ tôi hoàn thiện luận văn này.
Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2017
Học viên

Nguyễn Hải Phương


LỜI CAM ĐOAN

Kính gửi : - Phòng quản lý đào tạo Sau Đại học - Trường Đại học Y Hà Nội.


PCR

Polymerase Chain Reaction

RFLP

Fragment Length Polymorphism

SNP

Single Nucleotide Polymorphism

XRCC

X-ray Repair Cross-Complementing


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
DANH MỤC CÁC BẢNG
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ



lại phân tử DNA, đảm bảo sự ổn định của phân tử [4]. Một giả thuyết được
đặt ra rằng vai trò của các SNP khác nhau trong XRCC3 quy định về khả năng


11

sửa chữa DNA khác nhau của cá thể. Và như vậy, mối liên quan giữa SNP với
nguy cơ sinh ung thư ở các cá thể khác nhau là không giống nhau.
Gen quy định tổng hợp nên protein XRCC3 nằm ở vị trí 14q32.3, gen dài
17,8 kbp, gồm 10 exon. Trong đó, vai trò của SNP A17893G tại vị trí intron 5
với bệnh lý ung thư buồng trứng đã được một số tác giả trên thế giới tiến hành
nghiên cứu [5], [6], [7]. Khi phân tích sự tương quan giữa các kiểu gen của
SNP A17893G với bệnh và một số yếu tố nguy cơ của bệnh, kết quả cho thấy
sự liên quan giữa SNP này với bệnh lý ung thư buồng trứng là có ý nghĩa
thống kê [5], [7].
Hiện nay tại Việt Nam, đa hình đơn nucleotide của gen XRCC3 trên bệnh
lý ung thư buồng trứng vẫn còn là vấn đề bỏ ngỏ, do đó nhóm nghiên cứu
thực hiện đề tài: “Xác định đa hình đơn nucleotide A17893G của gen
XRCC3 ở bệnh nhân ung thư buồng trứng” với hai mục tiêu:
1. Xác định tỷ lệ đa hình đơn A17893G của gen XRCC3 trên bệnh nhân
2.

ung thư buồng trứng và nhóm người bình thường tại Việt Nam.
Mối liên quan giữa đa hình đơn A17893G của gen XRCC3 với một
số yếu tố nguy cơ đến bệnh lý ung thư buồng trứng: độ tuổi phát
hiện bệnh, typ mô bệnh học, giai đoạn phát hiện bệnh.


12


tử cung và ung thư nội mạc tử cung. Vào cuối những năm 1990, tỷ lệ tử vong
do ung thư buồng trứng là 3,5/100000 phụ nữ. Nhưng đến năm 2012, tỷ lệ
này đã giảm xuống còn 3,2/100000 [10].
Tại Việt nam, vào năm 2000, tỷ lệ ung thư buồng trứng tại Hà Nội là
4,4/100000 dân và tại thành phố Hồ Chi Minh là 3,7/100000 dân [2]. Theo
Nguyễn Bá Đức, trong giai đoạn 2001 - 2004, tỉ lệ mắc ung thư buồng trứng
tại Hà Nội, Hải Phòng, Thái Nguyên, Thừa Thiên Huế và Cần Thơ lần lượt là
4,7; 2,5; 1,2; 2,1; 6,5 [11]. Đa số bệnh nhân đến khám đều ở giai đoạn muộn,
do vậy có hơn 60% các trường hợp đã tử vong sau 05 năm [12].
1.1.2 Các yếu tố liên quan
Nguy cơ mắc ung thư buồng trứng đã được chứng minh là có liên quan
đến nhiều yếu tố [13], [14], [15]. Các yếu tố nguy cơ về độ tuổi và di truyền
là quan trọng nhất [16]. Các yếu tố còn lại cũng góp phần làm tăng khả năng
mắc bệnh.
1.1.2.1 Độ tuổi
Tỉ lệ mắc ung thư buồng trứng tăng lên ở những phụ nữ cao tuổi [16],
[17]. Theo nghiên cứu của tác giả Yancik năm 1993, có hơn 48% các ca ung
thư buồng trứng xảy ra ở phụ nữ trong nhóm bệnh nhân trên 65 tuổi. Như
vậy, tỉ lệ mắc bệnh ở nhóm phụ nữ trên 65 tuổi cao hơn nhóm những phụ nữ
trẻ. Tỷ lệ mắc bệnh còn tăng theo độ tuổi và đạt mức cao nhất là 54/100000
trong nhóm tuổi 75 - 79 [18]. Tại Việt Nam, theo tác giả Võ Hoàng Nhân
(2010), nhóm tuổi 40 - 59 chiếm 55,3% tổng số bệnh nhân ung thư buồng
trứng [19]. Nghiên cứu của tác giả Vũ Hô và cộng sự (2010) cũng cho kết
quả tương tự: trong nhóm bệnh nhân ung thư buồng trứng, nhóm tuổi 40 - 59
chiếm đến 54,0%. Như vậy, độ tuổi thường gặp nhất của bệnh tại Việt Nam
là nhóm từ 40 - 59 tuổi [20].


14


buồng trứng và dữ liệu từ kết quả nghiên cứu bệnh lý ung thư buồng trứng ở
động vật với các mô hình rụng trứng khác nhau. Ở người phụ nữ, chu kỳ
rụng trứng hầu như liên tục từ lúc dậy thì đến khi mãn kinh. Các điều kiện
xã hội của cuộc sống hiện đại không chỉ làm cho phần lớn việc rụng trứng
không có mục đích mà còn khiến cho giai đoạn thai kỳ và cho con bú tức là
khoảng thời gian nghỉ ngơi sinh lý không rụng trứng trở nên ngắn hơn. Ở
các loài động vật có vú khác, sự rụng trứng có thể được giới hạn trong mùa
sinh sản và khả năng sinh sản thường được thực hiện đầy đủ nên cho phép
thời kỳ nghỉ ngơi không rụng trứng diễn ra đầy đủ hơn. Do đó rất hiếm có
sự xuất hiện của các khối u biểu mô buồng trứng ở những động vật này
[25]. Như vậy càng làm giảm quá trình rụng trứng, nguy cơ mắc bệnh cũng
càng thấp. Một số yếu tố làm ngừng quá trình rụng trứng như: mang thai,
cho con bú, dùng thuốc tránh thai sẽ làm giảm nguy cơ mắc bệnh. Còn các
yếu tố làm tăng quá trình rụng trứng như có kinh sớm, mãn kinh muộn sẽ
làm tăng nguy cơ mắc bệnh [26], [27], [28].
Theo các kết quả nghiên cứu, hầu hết các ca bệnh được phát hiện khi
bệnh nhân đã bước vào giai đoạn mãn kinh [16], [17]. Bản thân sự mãn kinh
không phải là nguyên nhân gây bệnh. Những lý do khiến cho phụ nữ thuộc
thời kì này gia tăng nguy cơ mắc bệnh là vì hai yếu tố chính: một là tăng phơi
nhiễm với hormon, như estrogen, làm tăng nguy cơ ung thư tử cung và ung
thư vú; hai là tăng số lượng trứng rụng, làm tăng nguy cơ ung thư buồng
trứng. Những người phụ nữ mãn kinh do phẫu thuật cắt tử cung và bảo tồn hai
buồng trứng đã làm giảm 30% nguy cơ phát triển ung thư buồng trứng sau đó.
Yếu tố độ tuổi ở những phụ nữ mãn kinh tự nhiên không liên quan liên quan
đến nguy cơ. Phụ nữ sử dụng estrogen mãn kinh cho thấy giảm 40 phần trăm
nguy cơ mắc bệnh.


16



-

hiện sớm ung thư buồng trứng đối với các phụ nữ có nguy cơ cao.
Chụp X-quang ngực thẳng, nghiêng để phát hiện di căn phổi.


17

-

Chụp khung đại tràng: đánh giá xâm lấn của các khối ung thư buồng trứng

-

vào lòng đại tràng.
Chụp bụng không chuẩn bị được chỉ định trong các trường hợp ung thư

-

buồng trứng nghi ngờ có biến chứng tắc ruột.
Chụp cắt lớp vi tính, chụp cộng hưởng từ cho phép đánh giá tổn thương
tốt hơn các phương pháp thông thường đặc biệt là những tổn thương
vượt quá tiểu khung, những trường hợp có tổn thương nghi ngờ mà
khôngxác định được một cách chính xác bằng siêu âm hoặc chụp X-

-

quang thường quy.
PET (Positron Emission Tomography) cho các trường hợp chưa có bằng


18

1.1.3.2. Chẩn đoán mô bệnh học
Chẩn đoán mô bệnh học là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán quyết định và
là cơ sở đến các nhà lâm sàng tiến hành lựa chọn phương pháp điều trị cho
người bệnh. Nguyên tắc khi sinh thiết để có thể lấy được chính xác mô u là
tránh lấy vào vùng hoại tử, lấy nhiều vùng khác nhau và sử dụng dung dịch
formol trung tính 10% để cố định bệnh phẩm ngay sau khi lấy ra khỏi cơ thể
trước khi gửi đến khoa Giải phẫu bệnh. Ung thư buồng trứng tiên phát có ba
loại chính:
-

Ung thư biểu mô buồng trứng (Epithelial ovarian cancer) chiếm 95% các ca
mắc bệnh [29]. Ung thư biểu mô buồng trứng được chia thành các type và
dưới type khác nhau dựa vào sự xuất hiện loại tế bào biểu mô có mặt trong

-

khối u.
Ung thư tế bào mầm (Ovarian germ cell cancer) có nguồn gốc từ những tế bào
mầm. Loại này thường hay gặp ở những phụ nữ độ tuổi thanh thiếu niên,

-

chiếm 2,6% các ca mắc ung thư buồng trứng nói chung [30].
Ung thư mô đệm - dây sinh dục (Ovarian sex cord - stromal cancer) chiếm 7%
tổng số ung thư buồng trứng [31], phát sinh từ mô đệm của buồng trứng, từ
nguồn gốc của dây sinh dục hoặc cả hai.
Hiện nay theo Bộ Y Tế [32], Việt Nam áp dụng phân loại mô bệnh học

Ung thư biểu mô tuyến xơ
Những ung thư tế bào sáng

-

Ung thư biểu mô tuyến
- Ung thư biểu mô tuyến xơ
Những ung thư tế bào chuyển tiếp

-

Ung thư biểu mô tế bào chuyển tiếp (không phải loại Brenner)
U Brenner ác tính
Ung thư biểu mô tế bào vảy
Ung thư biểu mô không biệt hóa
U tế bào steroid (Biệt hóa cao và ác tính)
U tế bào mầm ác tính: Bao gồm ung thư tế bào mầm nguyên thủy và u
quái không thành thục [27].
1.1.3.3. Chẩn đoán giai đoạn
Theo tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị các bệnh
sản phụ khoa” của Bộ Y tế ban hành theo quyết định số 315/QĐ-BYT ngày
29/01/2015 [32], Việt Nam phân loại các giai đoạn lâm sàng của bệnh ung thư
buồng trứng theo FIGO 2013 như sau:


20

Bảng 1.1 Phân loại ung thư buồng trứng theo FIGO 2013
Giai đoạn
Mô tả

căn phúc mạc với tế bào học hoặc giải phẫu bệnh khẳng định có lan
tràn đến phúc mạc ngoài tiểu khung và/hoặc di căn hạch lympho sau
phúc mạc.
IIIA1
Chỉ có hạch lympho sau phúc mạc dương tính (tế bào học hoặc giải
phẫu bệnh minh chứng).
IIIA1 (i) Đường kính lớn của hạch di căn ≤ 10mm.
IIIA1 (ii) Đường kính lớn của hạch di căn > 10mm.
IIIA2
Di căn vi thể phúc mạc ngoài tiểu khung (trên giới hạn của TK) cùng
với hoặc không có hạch sau phúc mạc dương tính.
IIIB
Di căn đại thể ở phúc mạc ngoài tiểu khung có đường kính lớn ≤ 2cm
cùng với hoặc không có hạch sau phúc mạc dương tính.
IIIC
Di căn phúc mạc ngoài tiểu khung, có đường kính lớn > 2cm cùng với
hoặc không có hạch sau phúc mạc dương tính (bao gồm khối u lan tới
vỏ của gan và lách, chưa lan đến nhu mô các cơ quan này).
IV
Di căn xa ngoại trừ di căn phúc mạc.
IVA
Tràn dịch màng phổi với tế bào học dương tính.
IVB
Di căn tới nhu mô và di căn cơ quan ngoài ổ bụng (bao gồm hạch bẹn
và hạch ngoài ổ bụng).


21

1.1.4 Điều trị

các tác nhân phá hủy DNA và đặc biệt là rất nhạy cảm với các tác nhân phá
hủy liên kết ngang của DNA, ví dụ như mitomycin C [35], [36]. Các nhà khoa
học cũng chỉ ra sự bất ổn định mang tính chất tự phát, đặc biệt là các khác biệt
ở nhiễm sắc thể xuất hiện với tần số cao,[34], [35], [36], [37].

Hình 1.1 Vị trí của gen XRCC3 trên nhiễm sắc thể số 14
(Nguồn: Genetic Home Reference [39]).
Năm 1995, Robert và cộng sự đã xác định được vị trí của gen XRCC3
trên bản đồ gen người bằng phương pháp lai tại chỗ huỳnh quang và Southern
Blot với phân tử DNA từ hai tấm bản sao lai độc lập [38]. Gen XRCC3 của
người nằm trên cánh dài nhiễm sắc thể số 14 tại vị trí 14q32.3 (tương ứng với
cặp nucleotide số 103697611 đến cặp nucleotide 103715486).

Hình 1.2 Vị trí của các exon trên gen XRCC3
(Nguồn: Genatlas [40]).
Gen có độ dài 17,8kbp, gồm 10 exon. Gen quy định tổng hợp nên phân
tử mRNA 2574 bp. Phân tử mRNA sau quá trình dịch mã sẽ tạo ra phân tử
protein XRCC3 cấu tạo bởi 346 acid amin với trọng lượng phân tử 37850Da.
1.2.2 Vai trò
Gen XRCC3 quy định tổng hợp nên protein XRCC3. Protein này là một
trong năm thành viên thuộc hệ gia đình protein liên quan đến RAD51. Bốn
protein còn lại trong hệ là RAD51B (RAD51L1), RAD51C (RAD51L2),


23

RAD51D (RAD51L3) và XRCC2. Mỗi protein có 25% trình tự amino acid
giống với RAD51 và với những thành viên còn lại [41]. Các protein này chia
thành hai phức hợp nhóm: nhóm BCDX2 gồm RAD51B, RAD51C, RAD51D
và XRCC2; nhóm CX3 gồm RAD51C và XRCC3.

25

vùng không liên tục và sắp xếp lại thường xuyên vùng gen trong khu vực
liên quan đến tái tổ hợp tương đồng. Những kết quả này chỉ ra rằng chức
năng XRCC3 không chỉ giới hạn để bắt đầu quá trình tái tổ hợp tương đồng,
mà còn kéo dài đến giai đoạn sau trong quá trình hình thành và giải quyết của
các khâu trung gian trong quá trình này, có thể bằng cách ổn định chuỗi kép
DNA. Các nghiên cứu sau này chứng minh rằng các khiếm khuyết trong quá
trình tái tổ hợp tương đồng có thể thúc đẩy sự bất ổn định của bộ gen không
chỉ thông qua thất bại để khởi động quá trình tái tổ hợp tương đồng (dẫn đến
sửa chữa không tương đồng), mà còn thông qua sự vận hành bất thường của
các khâu trung gian trong quá trình đó. Các tác giả cho rằng cả hai cơ chế này
đều có thể góp phần gây ung thư cho các tế bào [45].
Năm 2001, Jean và cộng sự tìm ra kháng thể trực tiếp kháng lại
RAD51C đồng kết tủa miễn dịch với XRCC2 trong một phức hợp nội sinh
với RAD51C trong dung dịch ly giải tế bào HeLa [46]. Gel lọc của phức gợi ý
rằng một cấu trúc dị dimer được hình thành giữa các protein. Bằng việc sử
dụng đồng kết tủa và nhiều xét nghiệm khác, Nan (2002) đã xác nhận sự
tương tác giữa các protein này. Họ cũng tìm thấy rằng RAD51 đồng kết tủa
với XRCC3, điều này cho thấy RAD51 có thể có mặt trong một phức hợp
trimeric của XRCC3, RAD51C, và RAD51 [47].
Năm 2008, Wilson đã chứng minh XRCC3, BRCA2, FANCD2 và FANCG
đã hình thành một phức hệ thông qua sự tương tác nhiều cặp với nhau sau khi
phosphoryl hóa FANCG. Họ đề xuất rằng một phức hợp được tạo bởi ít nhất 4
protein có vai trò trong việc thúc đẩy sửa chữa tái tổ hợp tương đồng của
DNA bị hư hỏng [48].
Sử dụng kỹ thuật phân tích Western blot, năm 2010, Sage nhận thấy mức
độ biểu hiện của RAD51, RAD51C và XRCC3 trong ty thể các dòng tế bào
của con người đã tăng lên để đáp ứng với stress oxy hóa và bức xạ ion hóa