ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------  -------

PHẠM THỊ BÍCH

PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN CXCL12
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Phạm Thị Bích

PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN CXCL12
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái


1.1.3. Các tác nhân gây ung thư đại trực tràng.....................................4
1.1.4. Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng [39]....6
1.2. CHỈ THỊ SINH HỌC TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG.......................8
1.2.1. Chỉ thị sinh học là gì...................................................................8
1.2.2. Một số biến đổi về gen liên quan đến ung thư đại trực tràng.....8
1.4. CHEMOKINE CXCL12 VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC
TRÀNG.......................................................................................................................16
1.4.1. Chemokine................................................................................16
1.4.2. Chemokine CXCL12 và thụ thể của nó CXCR4......................19
1.5. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH VÀ METHYL HÓA GEN CXCL12 Ở
BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG......................................................21
2.1. NGUYÊN LIỆU..................................................................................................23
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu...............................................................23
2.1.2. Hóa chất.....................................................................................23
2.1.3. Thiết bị......................................................................................24
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................................24
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô.................................................24


2.2.3. Khuếch đại gen CXCL12 bằng phương pháp PCR..................27
2.2.4. Phân tích RFLP.........................................................................28
2.2.5. Khuếch đại vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật
MSP................................................................................................................29
2.2.6. Điện di kiểm tra sản phẩm........................................................32
2.2.7. Kỹ thuật nhuộm bạc..................................................................33
2.2.9. Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê..........................34
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................35
3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PCR - RFLP...............................................................35
3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu.......................................35
3.1.2. Kết quả khuếch đại đoạn gen CXCL12 bằng PCR..................36


American Joint Committee on Cancer

APC

Adenomatous polyposis coli

APS

Ammonium persulfate

CEA

Carcinoembryonic antigen (kháng nguyên ung thư)

CIN

Chromosomal instability (sự bất ổn định nhiễm sắc thể)

CPG-CIMP

CpG island methylator phenotype

CRC

Colorectal cancer (ung thư đại trực tràng)

cs

Cộng sự


Loss of imprinting (sự mất dấu ấn)

MAPK

Mitogen activated protein kinase

MSI

Microsatellite instability (sự bất ổn định vi vệ tinh)

MSP

Methyl specific polymerase chain reaction (phản ứng
chuỗi trùng hợp đặc hiệu methyl)

NCBI

National Center for Biotechnology Information

PI3KCA

Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit


PCR- RFLP

Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length
Polymorphism



Tumor- lymph node- metastases (khối u-hạch-di căn)

UTĐTT

Ung thư đại trực tràng

NST

Nhiễm sắc thể


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1

Phân biệt hai khái niệm u lành tính và ung thư theo đặc điểm sinh học

Bảng 2

Các chemokine thuộc họ CXC

Bảng 3

Các thành phần của phản ứng PCR

Bảng 4

Các thành phần của phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzyme
FastDigest MspI


Bảng 12

Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu bệnh theo độ tuổi

Bảng 13

Tỷ lệ methyl hóa và không methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12
trên mô u và mô lân cận u

Bảng 14

Thống kê tỷ lệ methyl hóa trong vùng promoter của gen CXCL12 theo
các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1

Hình ảnh đại trực tràng và polyp đại tràng nội soi

Hình 2

Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng

Hình 3

Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ máu

Hình 4


đại trực tràng


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

MỞ ĐẦU
Ung thư trực tràng là bệnh lý hay gặp trong ung thư đường tiêu hóa, đứng
hàng thứ hai sau ung thư dạ dày và chiếm 1,4 % trong tổng số ung thư. Bệnh tiến
triển tương đối chậm, di căn muộn, nếu phát hiện sớm, điều trị kịp thời và triệt để
thì tỷ lệ sống trên 5 năm đạt 60-80% [26]. Tuy nhiên bệnh thường được phát hiện ở
giai đoạn muộn khi đã di căn hay biến chứng, do đó hiệu quả điều trị rất hạn chế.
Hàng năm, trên thế giới có khoảng 650.000 người được chẩn đoán mắc bệnh
ung thư đại trực tràng và có khoảng 150.000 người chết vì căn bệnh này, đây là loại
ung thư nguy hiểm đứng hàng thứ ba gây tử vong trên thế giới và đứng hàng thứ hai
gây ra tử vong tại Mỹ. Tại Việt Nam, bệnh này chiếm khoảng 15% trong số các loại
ung thư và đang gia tăng một cách rõ rệt. Gần đây, do sự thay đổi trong thói quen ăn
uống giàu chất đạm, ít chất xơ, lạm dụng thức ăn nhanh khiến ung thư đại trực tràng
ngày càng phổ biến. Tuổi mắc căn bệnh chết người này ngày càng trẻ hóa, nhiều
trường hợp mới 18 - 20 tuổi, thậm chí có trẻ mới 12 đã mắc ung thư đại trực tràng
[30].
Trên thế giới ung thư đại trực tràng luôn được các nhà sinh y học quan tâm,
có nhiều nghiên cứu genomics, transcriptomics, proteomics đã được tiến hành. Mục
tiêu của những nghiên cứu này nhằm tìm ra những chỉ thị sinh học cho việc chẩn
đoán bệnh sớm hơn để điều trị kịp thời. Tuy nhiên, đến nay, mới chỉ có
carcinoembryonic antigen (CEA) là chỉ thị sinh học thường dùng cho chẩn đoán
bệnh cho các bệnh nhân trong giai đoạn III, IV, nhưng chi phí cho xét nghiệm còn
rất tốn kém[38].Vì vậy, việc tìm ra những chỉ thị mới dễ nhận biết và có thể phát
hiện chính xác giai đoạn ung thư là cần thiết. Genomics và proteomics là những lĩnh



Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TÌM HIỂU VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.1.1. Khái quát về ung thư
Ung thư (u ác tính) là một loại bệnh của các tế bào, biểu hiện là sự phát triển
không bình thường của các tế bào, tăng sinh nhanh chóng về số lượng một cách
không kiểm soát được và tế bào không tuân theo các cơ chế kiểm soát và phát triển
của cơ thể [33]. Trong một số trường hợp, chúng di căn (lan tràn tới các cơ quan ở
xa) (bảng 1).
Bảng 1. Phân biệt hai khái niệm u lành tính và ung thư theo đặc điểm sinh bệnh học
U lành tính
- Tế bào biệt hóa cao
- Phân bào ít và chậm
- Không xâm lấn xung quanh
- Có vỏ bọc
- Không hoại tử
- Rất ít tái phát và ít ảnh hưởng tới cơ thể

U ác tính (ung thư)
- Tế bào ít biệt hóa
- Phân bào nhanh, không tuân theo sự kiểm
soát của chu trình tế bào
- Xâm lấn xung quanh
- Không có vỏ bọc

Hình 1.
Hình ảnh đại
trực tràng và
polyp đại tràng
nội soi [35]

1.1.3.
Các tác
nhân gây
ung thư đại
trực tràng
Các loại ung thư khác nhau có tác nhân gây bệnh khác nhau. Trong ung thư
đại trực tràng thì có rất nhiều tác nhân và các nghiên cứu cho thấy các tác nhân sau
đây có thể gây nguy cơ bị bệnh ung thư đại trực tràng:
• Polyp đại trực tràng là bệnh khá thường gặp, đây là những khối u lồi vào

4


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

trong lòng đại trực tràng, chúng được hình thành do sự tăng sinh quá mức của niêm
mạc đại trực tràng. Triệu chứng của bệnh thường nghèo nàn và không đặc hiệu.
Việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời, đặc biệt nếu xác định rõ và loại bỏ những
polyp bằng thủ thuật cắt polyp qua nội soi sẽ làm giảm thiểu đáng kể nguy cơ polyp
trở thành ung thư.
• Tác nhân lối sống: Những người có thói quen hút thuốc, hoặc có chế độ
ăn uống giàu chất mỡ và ít trái cây, rau quả sẽ có nguy cơ mắc bệnh ung thư đại

Phân loại Duke cho ung thư trực tràng
Năm 1932, Cuthbert E. Dukes, một bác sĩ giải phẫu bệnh ở bệnh viện
St.Mark, đã đưa ra một hệ thống phân loại giai đoạn cho ung thư trực tràng.
Phân loại được chia làm 3 giai đoạn:
- Dukes A: khối u giới hạn ở thành trực tràng.
- Dukes B: những khối u đã vượt thành trực tràng đến những cơ quan cạnh
trực tràng.
- Dukes C: những khối u đã di căn đến hạch lympho vùng.
Phân loại TNM (Tumor, Node, Metastasis)
Phân loại này được đưa ra vào năm 1954 bởi AJCC (American Joint
Committee on Cancer) và IUAC (International Union Against Cancer) dựa trên
những dữ kiện lâm sàng và bệnh học. Phân loại TNM thường dùng để dự báo tỉ lệ
sống sót 5 năm của bệnh nhân ung thư trực tràng.
Phân loại TNM cho ung thư đại trực tràng
U nguyên phát (T):
Tx – không xác định được u.
T0 – không có bằng chứng của khối u.
Tis – u tại chỗ (niêm mạc).
T1 – u xâm lấn lớp dưới niêm mạc.
T2 – u xâm lấn thanh mạc.
T3 – u xuyên qua thanh mạc vào lớp dưới thanh mạc hoặc vào các mô xung quanh
đại tràng hay trực tràng.
T4 – U xâm lấn trực tiếp các cơ quan khác hoặc xuyên vào lớp phúc mạc tạng.
Hạch lympho vùng (N):
Nx – không xác định được hạch.
N0 – không có hạch di căn.

6



• Giai đoạn III: Ung thư đã lan đến hạch bạch huyết nhưng chưa lan đến
những phần xa của cơ thể.
• Giai đoạn IV: Ung thư đã lan đến các phần xa của cơ thể thông qua hệ

7


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

thống bạch huyết, được gọi là di căn. Các cơ quan mà ung thư đại trực tràng
thường di căn đến là phổi và gan.
Tỉ lệ sống sót sau 5 năm của ung thư đại trực tràng: Giai đoạn I: 72%. Giai
đoạn II: 54% . Giai đoạn III: 39% . Giai đoạn IV: 7%.[39]
1.2. CHỈ THỊ SINH HỌC TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.2.1. Chỉ thị sinh học là gì
Chỉ thị sinh học (biomarker) là những phân tử chất được sử dụng như một
chỉ báo của một trạng thái sinh học. Đó là một đặc tính khách quan được đặc trưng
bởi các thông số như các chỉ số hóa sinh, miễn dịch… Do đó, nó được dùng để đánh
giá những quá trình sinh học bình thường, quá trình gây bệnh hoặc các phản ứng
dược của quá trình điều trị [18].
Trong ung thư, chỉ thị sinh học đóng một vai trò quan trọng, nó là công cụ
hữu hiệu, chỉ thị sinh học mới có độ nhạy và tính đặc hiệu cao sẽ giúp cho việc
kiểm soát ung thư tốt hơn, tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định nhanh chóng
các đáp ứng của khối u đối với liệu pháp điều trị mới. Ví dụ như đột biến dòng phôi
gen APC là một chỉ thị để chẩn đoán nguy cơ mắc polyp và sự phát triển tiếp theo
của ung thư biểu mô trực tràng, biểu hiện của β-catenin trong tế bào chất và nhân là
một chỉ thị để tiên lượng ung thư biểu mô thực quản. Tuy nhiên, rất ít các chỉ thị

bất hoạt gen APC gây hậu quả mất protein APC, dẫn đến làm tăng β-catenin của tế
bào, chất này sẽ xâm nhập vào nhân tế bào và điều hòa tăng sinh tế bào. Hậu quả là
các khối u hình thành trong lớp biểu mô ruột và có thể tiến triển thành ung thư. Vì
vậy, APC là yếu tố điều hòa âm tính của việc truyền tín hiệu β-catenin.
Ngoài ra, những đột biến làm mất chức năng của APC cũng dẫn đến sự bất
ổn định nhiễm sắc thể do APC liên kết với các vi ống làm chúng bị sai lệch [21].
TP53 là một gen ức chế khối u cực kì quan trọng với một số chức năng chủ
yếu như khởi động quá trình apoptosis, sửa chữa ADN bị lỗi và điều khiển chu trình
tế bào. Đột biến gen này dẫn đến sự biểu hiện bất thường của protein p53. Do đó,
khi p53 mất chức năng thì các tế bào sẽ tiếp tục phân chia mang theo các sai hỏng
ADN, tích lũy qua mỗi chu trình tế bào và đến một lúc nào đó tế bào không kiểm
soát được hoạt động phân bào nữa và chuyển sang trạng thái ung thư.
Một số gen gây ung thư như RAS và BRAF cũng đóng vai trò quan trọng
trong việc phát triển căn bệnh ung thư trong đó có: Đột biến RAS xảy ra ở 37% các
trường hợp mắc ung thư đại trực tràng và 13% đối với BRAF. Các đột biến RAS mà

9


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

phần lớn là ở KRAS đã làm hoạt hóa GTPase, vốn có vai trò dẫn tín hiệu trực tiếp
đến RAF. Các đột biến BRAF ảnh hưởng tới enzyme MAPK (mitogen activated
protein kinase) vốn có vai trò điều hòa một số hoạt động của tế bào (như phân bào,
tăng sinh, biệt hóa tế bào, chết theo chu trình) và sau đó điều khiển các lớp tín hiệu
dẫn tới con đường tín hiệu này bị hạn chế từ đó ảnh hưởng tới hoạt động của tế bào.
Các đột biến BRAF có thể phát hiện được ngay cả ở các polyp nhỏ và so với các đột
biến RAS thì chúng phổ biến hơn ở các polyp tăng sản, các u tuyến dạng khía và các

bệnh, liên quan tới sự tăng cường phiên mã của gen (như các gen gây ung thư).
Trong khi đó thì sự tăng cường methyl hóa ADN lại xảy ra tại các vị trí điều hòa
đặc hiệu ở các vùng promoter, dẫn tới sự ngăn cản phiên mã từ đó gây bất hoạt gen
(như ở các gen ức chế khối u). Chính sự tăng cường methyl hóa ADN này đã trở
thành một lĩnh vực được quan tâm lớn trong nghiên cứu ung thư hiện nay [12].
Ngoài ra, sự methyl hóa ADN còn đóng vai trò trung tâm trong sự đánh dấu của
gen, sự phát triển của phôi, sự im lăng NST X và sự điều khiển chu trình tế bào.
Đã có những bằng chứng chứng tỏ rằng sự methyl hóa bất thường là một
hiện tượng phổ biến trong ung thư và đó có thể là sự thay đổi sớm nhất trong sự
phát sinh ung thư .
Năm 2010, Kim và cs thuộc trường đại học y John Hopkins, Hoa Kỳ qua
việc tổng hợp từ hơn 40 bài báo khác nhau đã đưa ra một bản tổng hợp về tình trạng
methyl hóa của 59 gen khác nhau trên mô đại trực tràng, 19 gen được phân tích từ
mẫu huyết tương, huyết thanh hoặc mẫu phân. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ
methyl hóa là: 76,2% ở CXCL12, 32% ở E-Cadherin, 100% như ở Cyclin A1,…
Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho thấy có sự tăng cường methyl hóa cao ở các
gen của bệnh nhân ung thư đại trực tràng, trong khi đó tỷ lệ này rất thấp và gần như
là 0% ở người bình thường, điều đó cho thấy tình trạng tăng cường methyl hóa
ADN có thể là yếu tố quan trọng góp phần vào sự phát sinh ung thư đại trực tràng
[12]. Sự methyl hóa ADN có thể được phát hiện trong các ADN bắt nguồn từ mẫu
mô, mẫu phân hoặc dịch cơ thể.
Vì vậy, nếu các phương pháp nghiên cứu sự methyl hóa ADN khi được tối
ưu hóa về độ nhạy và độ đặc hiệu của nó sẽ giúp xác định chính xác những khác
biệt trong tình trạng methyl hóa ADN giữa bệnh nhân ung thư và người bình
thường, cho thấy rằng đây có thể là một công cụ hữu hiệu cho việc phát hiện sớm
bệnh và là một chỉ thị tầm soát mới cho ung thư đại trực tràng.
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN LIÊN

11


trong đó cũng làm thay đổi cấu hình sợi đơn. Khi điện di trên gel polyacrylamide
không biến tính, các cấu hình khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và phân
tách ra. Những yếu tố khác ảnh hưởng đến cấu hình sợi đơn như nhiệt độ, pH, đệm

12


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

chạy có thể được sử dụng để tăng khả năng phân tách. Nhìn chung, nhiệt độ và pH
thấp giúp duy trì cấu hình và dễ dàng phân biệt được các phân tử ADN có trình tự
khác nhau.
DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography)
Đây là phương pháp phân tích ADN dị sợi kép. Thay vì sử dụng gel và phân
tách ADN bằng điện di, ADN được phân tách bằng sắc ký HPLC. Các mạch ADN
được phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau
và hình thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác. Các phân tử
dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thường. DHPLC
là một kĩ thuật mạnh, đơn giản và mẫu được đưa vào tự động. Với những tiến bộ
gần đây trong việc phát triển phần mềm dự đoán đường cong biến tính, phương
pháp này có độ nhạy cao và khả năng tái sử dụng tốt.
Real Time PCR
Trong sinh học phân tử, đây là kĩ thuật PCR mà kết quả khuếch đại ADN
được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Kĩ thuật này cho phép phát
hiện và định lượng tuyệt đối số lượng bản sao của một hay nhiều trình tự cụ thể của
một mẫu ADN. Hai phương pháp để định lượng là nhuộm huỳnh quang không đặc
hiệu với trình tự ADN kép và lai sản phẩm với một đầu dò ADN đặc hiệu có gắn
huỳnh quang. Qua mỗi chu kì của phản ứng, lượng sản phẩm tăng lên dẫn đến sự

huỳnh quang, cho phép xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với
độ nhạy rất cao. Ưu điểm lớn nhất của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về
điểm đột biến như: loại đột biến, vị trí, hậu quả. Tuy nhiên nó có hạn chế là đòi hỏi
sản phẩm khuếch đại ADN phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt
tiền.
Kỹ thuật phân tích ADN microarray
Đây là một trong những kỹ thuật được ứng dụng hiệu quả trong nghiên cứu
genomics tìm các chỉ thị về gen. Phân tích ADN microarray có thể đo mức độ biểu
hiện ARN của hàng nghìn gen cùng một lúc, sự biểu hiện gen có thể được sử dụng
để phân biệt các dạng khối u cũng như có ý nghĩa trong chẩn đoán bệnh. Điều này
đã được chứng minh với ung thư vú và trong ung thư bạch cầu ác tính. Các mảnh
ADN trên các tấm kính mỏng được lai với các mẫu cADN, chúng có thể được
nhuộm huỳnh quang đỏ và xanh. Phụ thuộc vào mối tương tác của mẫu phân tích,
mỗi điểm trên kính có thể phát ra tín hiệu màu đỏ hoặc xanh. Các gen có thể được
tập hợp lại thành nhóm và có thể so sánh giữa các mẫu.

14