ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------  -------

PHẠM THỊ BÍCH

PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN CXCL12
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Phạm Thị Bích

PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN CXCL12
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

1.1.3. Các tác nhân gây ung thư đại trực tràng.............................................. 4
1.1.4. Các hệ thống phân giai đoạn ung thư đại trực tràng ............................ 6
1.2. CHỈ THỊ SINH HỌC TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG...................... 8
1.2.1. Chỉ thị sinh học là gì ....................................................................... 8
1.2.2. Một số biến đổi về gen liên quan đến ung thư đại trực tràng............... 9
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN LIÊN QUAN ĐẾN
BỆNH UNG THƯ…………………………………………………………………12
1 .4.CHEMOKINE CXCL12 VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC

TRÀNG

……………………………………………………………………

16

1.4.1. Chemokine .................................................................................................. 16
1.4.2. Chemokine CXCL12 và thụ thể của nó CXCR4 .......................................... 19
1.5. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH VÀ METHYL HÓA GEN CXCL12 Ở
BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ................................................... 21
Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP............................................... 23
2.1. NGUYÊN LIỆU ............................................................................................. 23
2.1.2. Hóa chất ........................................................................................... 23
2.1.3. Thiết bị............................................................................................. 24


2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 24
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô ......................................................... 24
2.2.2. Tách chiết ADN tổng số từ máu ....................................................... 25
2.2.3. Khuếch đại gen CXCL12 bằng phương pháp PCR ........................... 27
2.2.4. Phân tích RFLP ................................................................................ 28



BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN

Acid Deoxyribo Nucleic

AJCC

American Joint Committee on Cancer

APC

Adenomatous polyposis coli

APS

Ammonium persulfate

CEA

Carcinoembryonic antigen (kháng nguyên ung thư)

CIN

Chromosomal instability (sự bất ổn định nhiễm sắc thể)

CPG-CIMP



IUAC

International Union Against Cancer

HNPCC

Hereditary nonpolyposis colon cancer (ung thư ruột kết
không polyp di truyền)

LOI

Loss of imprinting (sự mất dấu ấn)

MAPK

Mitogen activated protein kinase

MSI

Microsatellite instability (sự bất ổn định vi vệ tinh)


MSP

Methyl specific polymerase chain reaction (phản ứng
chuỗi trùng hợp đặc hiệu methyl)

NCBI



TGF β

Transforming growth factor β (yếu tố tăng trưởng chuyển
hóa β)

TNF

Tumor necrosis factor (Yếu tố gây hoại tử khối u)

TNM

Tumor- lymph node- metastases (khối u-hạch-di căn)

UTĐTT

Ung thư đại trực tràng

NST

Nhiễm sắc thể


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1

Phân biệt hai khái niệm u lành tính và ung thư theo đặc điểm sinh học

Bảng 2


70 tuổi

Bảng 10

Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu đối chứng và mẫu bệnh theo vị
trí khối u

Bảng 11

Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu bệnh theo giới tính

Bảng 12

Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu bệnh theo độ tuổi

Bảng 13

Tỷ lệ methyl hóa và không methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12
trên mô u và mô lân cận u

Bảng 14

Thống kê tỷ lệ methyl hóa trong vùng promoter của gen CXCL12 theo
các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1

Hình ảnh đại trực tràng và polyp đại tràng nội soi

Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 1 băng 302bp

Hình 9

Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ mô

Hình 10 Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm MethPrimer
Hình 11 Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm cpgplot
Hình 12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen CXCL12
Hình 13 Tỷ lệ methyl và unmethyl khảo sát trên 2 loại mô u và lân cận u
Hình 14 Hình ảnh điện di sản phẩm MSP của gen CXCL12 của bệnh nhân ung thư
đại trực tràng


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

MỞ ĐẦU
Ung thư trực tràng là bệnh lý hay gặp trong ung thư đường tiêu hóa, đứng
hàng thứ hai sau ung thư dạ dày và chiếm 1,4 % trong tổng số ung thư. Bệnh tiến
triển tương đối chậm, di căn muộn, nếu phát hiện sớm, điều trị kịp thời và triệt để
thì tỷ lệ sống trên 5 năm đạt 60-80% [26]. Tuy nhiên bệnh thường được phát hiện ở
giai đoạn muộn khi đã di căn hay biến chứng, do đó hiệu quả điều trị rất hạn chế.
Hàng năm, trên thế giới có khoảng 650.000 người được chẩn đoán mắc bệnh
ung thư đại trực tràng và có khoảng 150.000 người chết vì căn bệnh này, đây là loại
ung thư nguy hiểm đứng hàng thứ ba gây tử vong trên thế giới và đứng hàng thứ hai
gây ra tử vong tại Mỹ. Tại Việt Nam, bệnh này chiếm khoảng 15% trong số các loại
ung thư và đang gia tăng một cách rõ rệt. Gần đây, do sự thay đổi trong thói quen ăn
uống giàu chất đạm, ít chất xơ, lạm dụng thức ăn nhanh khiến ung thư đại trực tràng

- Xác định được sự phân bố của đảo CpG và mật độ nucleotide CpG trong
các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen CXCL12.
- Xác định được tình trạng methyl hóa của 1 đảo CpG thuộc vùng promoter
của gen CXCL12.
- Đánh giá mối liên quan giữa tình trạng methyl hóa gen CXCL12 với các đặc
điểm bệnh học lâm sàng của ung thư đại trực tràng ở người Việt Nam.
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc
thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TÌM HIỂU VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.1.1. Khái quát về ung thư
Ung thư (u ác tính) là một loại bệnh của các tế bào, biểu hiện là sự phát triển
không bình thường của các tế bào, tăng sinh nhanh chóng về số lượng một cách
không kiểm soát được và tế bào không tuân theo các cơ chế kiểm soát và phát triển
của cơ thể [33]. Trong một số trường hợp, chúng di căn (lan tràn tới các cơ quan ở
xa) (bảng 1).
Bảng 1. Phân biệt hai khái niệm u lành tính và ung thư theo đặc điểm sinh bệnh học
U lành tính
- Tế bào biệt hóa cao
- Phân bào ít và chậm

ung thư đường tiêu hóa tại các nước Âu Mỹ. Tại Việt Nam và các nước châu Á,
UTĐTT đứng thứ hai trong ung thư đường tiêu hóa sau ung thư dạ dày. Ở nước ta,
mỗi năm có khoảng hơn 7.300 người mới mắc và hơn 4.100 người tử vong do ung
thư đại trực tràng [34]. Ung thư đại trực tràng là ung thư biểu mô phổ biến hiện nay,
bao gồm ung thư đại tràng và ung thư trực tràng. Đại tràng là phần ruột lớn hình
chữ N gồm đoạn lên, đoạn ngang và đoạn xuống. Trực tràng là phần ruột thẳng nối
giữa đại tràng và hậu môn. Ung thư thường xảy ra ở đoạn nối giữa đại tràng và trực
tràng (hình 1). Ung thư đại tràng và ung thư trực tràng thường có liên hệ với nhau
và khó có thể xác định ung thư nào xảy ra trước, ung thư nào xảy ra sau, vì thế
chúng được gọi chung là ung thư đại trực tràng [35].

Hình 1. Hình ảnh đại trực tràng và polyp đại tràng nội soi [35]

1.1.3. Các tác nhân gây ung thư đại trực tràng
Các loại ung thư khác nhau có tác nhân gây bệnh khác nhau. Trong ung thư
đại trực tràng thì có rất nhiều tác nhân và các nghiên cứu cho thấy các tác nhân sau
đây có thể gây nguy cơ bị bệnh ung thư đại trực tràng:

4


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

 Polyp đại trực tràng là bệnh khá thường gặp, đây là những khối u lồi vào
trong lòng đại trực tràng, chúng được hình thành do sự tăng sinh quá mức của niêm
mạc đại trực tràng. Triệu chứng của bệnh thường nghèo nàn và không đặc hiệu.
Việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời, đặc biệt nếu xác định rõ và loại bỏ những
polyp bằng thủ thuật cắt polyp qua nội soi sẽ làm giảm thiểu đáng kể nguy cơ polyp

viên mắc bệnh và độ tuổi mắc bệnh. Thực tế, các nghiên cứu cho thấy phải có tới 20
đến 25% các bệnh nhân ung thư đại trực tràng có tiền sử gia đình mắc căn bệnh này.
1.1.4. Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng [39]
Phân loại Duke cho ung thư trực tràng
Năm 1932, Cuthbert E. Dukes, một bác sĩ giải phẫu bệnh ở bệnh viện
St.Mark, đã đưa ra một hệ thống phân loại giai đoạn cho ung thư trực tràng.
Phân loại được chia làm 3 giai đoạn:
- Dukes A: khối u giới hạn ở thành trực tràng.
- Dukes B: những khối u đã vượt thành trực tràng đến những cơ quan cạnh
trực tràng.
- Dukes C: những khối u đã di căn đến hạch lympho vùng.
Phân loại TNM (Tumor, Node, Metastasis)
Phân loại này được đưa ra vào năm 1954 bởi AJCC (American Joint
Committee on Cancer) và IUAC (International Union Against Cancer) dựa trên
những dữ kiện lâm sàng và bệnh học. Phân loại TNM thường dùng để dự báo tỉ lệ
sống sót 5 năm của bệnh nhân ung thư trực tràng.
Phân loại TNM cho ung thư đại trực tràng
U nguyên phát (T):
Tx – không xác định được u.
T0 – không có bằng chứng của khối u.
Tis – u tại chỗ (niêm mạc).
T1 – u xâm lấn lớp dưới niêm mạc.
T2 – u xâm lấn thanh mạc.
T3 – u xuyên qua thanh mạc vào lớp dưới thanh mạc hoặc vào các mô xung quanh
đại tràng hay trực tràng.
T4 – U xâm lấn trực tiếp các cơ quan khác hoặc xuyên vào lớp phúc mạc tạng.

6



Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

 Giai đoạn II: Ung thư đã lan đến các cơ quan khác ở gần đại trực tràng hoặc
trực tràng nhưng chưa lây lan đến các hạch bạch huyết.
 Giai đoạn III: Ung thư đã lan đến hạch bạch huyết nhưng chưa lan đến
những phần xa của cơ thể.
 Giai đoạn IV: Ung thư đã lan đến các phần xa của cơ thể thông qua hệ
thống bạch huyết, được gọi là di căn. Các cơ quan mà ung thư đại trực tràng
thường di căn đến là phổi và gan.
Tỉ lệ sống sót sau 5 năm của ung thư đại trực tràng: Giai đoạn I: 72%. Giai
đoạn II: 54% . Giai đoạn III: 39% . Giai đoạn IV: 7%.[39]
1.2. CHỈ THỊ SINH HỌC TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.2.1. Chỉ thị sinh học là gì
Chỉ thị sinh học (biomarker) là những phân tử chất được sử dụng như một
chỉ báo của một trạng thái sinh học. Đó là một đặc tính khách quan được đặc trưng
bởi các thông số như các chỉ số hóa sinh, miễn dịch… Do đó, nó được dùng để đánh
giá những quá trình sinh học bình thường, quá trình gây bệnh hoặc các phản ứng
dược của quá trình điều trị [18].
Trong ung thư, chỉ thị sinh học đóng một vai trò quan trọng, nó là công cụ
hữu hiệu, chỉ thị sinh học mới có độ nhạy và tính đặc hiệu cao sẽ giúp cho việc
kiểm soát ung thư tốt hơn, tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định nhanh chóng
các đáp ứng của khối u đối với liệu pháp điều trị mới. Ví dụ như đột biến dòng phôi
gen APC là một chỉ thị để chẩn đoán nguy cơ mắc polyp và sự phát triển tiếp theo
của ung thư biểu mô trực tràng, biểu hiện của β-catenin trong tế bào chất và nhân là
một chỉ thị để tiên lượng ung thư biểu mô thực quản. Tuy nhiên, rất ít các chỉ thị
phân tử hiện nay được ứng dụng thực tiễn trong lâm sàng vì sự hạn chế về độ nhạy
và tính đặc hiệu, do đó, cần phải phát triển nhiều hơn nữa các chỉ thị đáng tin cậy có
liên quan tới phần lớn các khối u để có thể sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán và điều
trị ung thư.

Ngoài ra, những đột biến làm mất chức năng của APC cũng dẫn đến sự bất
ổn định nhiễm sắc thể do APC liên kết với các vi ống làm chúng bị sai lệch [21].
TP53 là một gen ức chế khối u cực kì quan trọng với một số chức năng chủ
yếu như khởi động quá trình apoptosis, sửa chữa ADN bị lỗi và điều khiển chu trình
tế bào. Đột biến gen này dẫn đến sự biểu hiện bất thường của protein p53. Do đó,
khi p53 mất chức năng thì các tế bào sẽ tiếp tục phân chia mang theo các sai hỏng

9


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

ADN, tích lũy qua mỗi chu trình tế bào và đến một lúc nào đó tế bào không kiểm
soát được hoạt động phân bào nữa và chuyển sang trạng thái ung thư.
Một số gen gây ung thư như RAS và BRAF cũng đóng vai trò quan trọng
trong việc phát triển căn bệnh ung thư trong đó có: Đột biến RAS xảy ra ở 37% các
trường hợp mắc ung thư đại trực tràng và 13% đối với BRAF. Các đột biến RAS mà
phần lớn là ở KRAS đã làm hoạt hóa GTPase, vốn có vai trò dẫn tín hiệu trực tiếp
đến RAF. Các đột biến BRAF ảnh hưởng tới enzyme MAPK (mitogen activated
protein kinase) vốn có vai trò điều hòa một số hoạt động của tế bào (như phân bào,
tăng sinh, biệt hóa tế bào, chết theo chu trình) và sau đó điều khiển các lớp tín hiệu
dẫn tới con đường tín hiệu này bị hạn chế từ đó ảnh hưởng tới hoạt động của tế bào.
Các đột biến BRAF có thể phát hiện được ngay cả ở các polyp nhỏ và so với các đột
biến RAS thì chúng phổ biến hơn ở các polyp tăng sản, các u tuyến dạng khía và các
ung thư đại trực tràng phần đầu gần, và đặc biệt là ở các trường hợp ung thư có kiểu
hình methyl hóa đảo CpG - CIMP (CpG island methylator phenotype) [16]. Năm
2003, Shield và cộng sự khi nghiên cứu về gen KRAS (gen gây ung thư) cho thấy
đột biến này có vai trò chuyển ung thư đa u tuyến từ giai đoạn trung gian.