B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

NGUYấN THI THANH NGN

xác định đột biến gen smn1 và số lợng bản
sao gen smn2 bằng kỹ thuật mlpa trên bệnh
nhân thoáI hóa cơ tủy và các thành viên gia
đình
Chuyờn ngnh : Xột nghim Y hc
Mó s

: 8720601

CNG LUN VN THC S Y HC
Ngi hng dn khoa hc:
PGS.TS.TRN VN KHNH


HÀ NỘI - 2019
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Giải thích

BN

Bệnh nhân

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...........................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................3
1.1. Đặc điêm chung của bệnh SMA......................................................................3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh........................................................................3
1.1.2. Đặc điêm lâm sàng bệnh nhân SMA......................................................4
1.1.3. Đặc điêm cận lâm sàng bệnh nhân SMA................................................8
1.1.4. Chẩn đoán phân biệt SMA...................................................................10
1.1.5. Đặc điêm về tần số mắc bệnh SMA......................................................10
1.1.6. Di truyền học và ý nghĩa xác định phả hệ bệnh SMA..........................10
1.1.7. Nguyên tắc phòng và điều trị bệnh SMA..............................................11
1.2. Cơ chế phân tử và di truyền của bệnh SMA..................................................14
1.2.1. Cơ chế di truyền...................................................................................14
1.2.2. Các dạng đột biến cấu trúc gen SMN....................................................17
1.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen SMN1 và SMN2........18
1.3.1. PCR-RFLP...........................................................................................18
1.3.2. Kỹ thuật giải trình tự gen bằng máy tự động........................................19
1.3.3. Kỹ thuật MLPA....................................................................................19
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................22
2.1. Đối tượng nghiên cứu...................................................................................22
2.2. Địa điêm nghiên cứu.....................................................................................22
2.3. Thời gian nghiên cứu....................................................................................22
2.4. Phương pháp nghiên cứu..............................................................................22
2.4.1 Thiết kế nghiên cứu................................................................................22
2.4.2. Cỡ mẫu và kỹ thuật chọn mẫu...............................................................22
2.5. Sơ đồ nghiên cứu..........................................................................................23
2.6. Công cụ và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu.............................................23
2.6.1 Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu.........................................................23
2.6.2. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu.................................................25
2.7. Đạo đức nghiên cứu......................................................................................31

Hình 1.2: Mô hình điện cơ đồ...................................................................................9
Hình 1.3. Sơ đồ di truyền khi cả ba mẹ đều là người mang gen bệnh......................12
Hình 1.4: Nối hai phân tử mRNA mã hóa SMN......................................................14
Hình 1.5: Các gen SMN liên quan đến SMA..........................................................14
Hình 1.6: Sơ đồ khác biệt SMN1, SMN2................................................................15
Hình 2.1. Các giai đoạn của kỹ thuật MLPA............................................................27
Hình 2.2. Mẫu chứng nam bình thường...................................................................28
Hình 2.3. Kết quả MLPA người lành mang gen.......................................................28
Hình 2.4: Kết quả MLPA bệnh nhân........................................................................28
Hình 2.5: Kết quả MLPA bệnh nhân........................................................................29


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh thoái hóa cơ tủy (Spinal muscular atrophy: SMA) là một rối loạn thoái
hóa thần kinh, tự phát, đặc trưng bởi yếu cơ tiến triên. SMA được mô tả đầu tiên bởi
Werding vào năm 1891 và sau đó là Hoffman vào năm 1893. Đây là một trong
những bệnh lý thần kinh cơ do di truyền, phổ biến thứ hai ở trẻ em . Tần số mắc
bệnh cũng khá cao ước tính khoảng 1/6000 ÷ 1/10000 trẻ sinh sống và với tần suất
người lành mang gen đột biến 1/38÷ 1/50 ,,. Bệnh SMA gây thoái hóa tuần tiến tế
bào thần kinh sừng trước tủy sống dẫn đến suy yếu và thoái hóa đối xứng gốc chi,
trương lực cơ giảm, phản xạ gân xương giảm hoặc mất, lưỡi rung, biến dạng lồng
ngực và cứng khớp. Đây là một đột biến di truyền lặn nằm trên nhiễm sắc thê số 5,
cả bố và mẹ đều là người mang gen bệnh thì khi đó khả năng con sinh ra bị bệnh là
25% [5].
Gen SMN quy định tổng hợp protein SMN biêu hiện chủ yếu ở các tế bào thần
kinh vận động tủy sống (spinal motor neuron). Gen SMN có hai bản sao rất giống
nhau là SMN1 và SMN2. Cả hai gen SMN1 và SMN2 đều tổng hợp ra protein
tương ứng, tuy nhiên do sự khác nhau ở một vài nucleotid nên SMN1 tổng hợp

hiện được các bệnh nhân bị đột biến mất đoạn SMN1 đồng hợp tử mà không phát
hiện được kiêu gen dị hợp tử, do vậy đã bỏ sót bệnh nhân . Hiện nay, Multiplex
Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) là phương pháp được ưu tiên chọn
lựa trong chẩn đoán đột biến mất đoạn ngắn, lặp đoạn cũng như phát hiện kiêu gen
dị hợp tử với độ chính xác cao và cho kết quả nhanh chóng . Xuất phát từ thực tiễn
đó chúng tôi tiến hành đề tài với hai mục tiêu:
1. Xác định đột biến gen SMN1 bằng kỹ thuật MLPA trên bệnh nhân mắc
bệnh thoái hóa cơ tủy và các thành viên gia đình.
2. Xác định số bản copy của gen SMN2 bằng kỹ thuật MLPA trên bệnh nhân
mắc bệnh thoái hóa cơ tủy và các thành viên gia đình.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm chung của bệnh SMA
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh
Từ năm 1891 Guido Werdnig là một nhà thần kinh học người Australia, lần
đầu tiên mô tả đặc điềm lâm sàng bệnh thoái hóa cơ tủy của hai anh em bị bệnh ở
tuổi bú mẹ.
Cho đến năm 1893 Johan Hoffmann một nhà thần kinh học người Đức, cũng
mô tả biêu hiện lâm sàng của 4 bệnh nhân trong hai gia đình bị bệnh thoái hóa cơ tủy
Sau đó nhiều năm, Brandt (1949) nghiên cứu trên 112 bệnh nhân thuộc 70
gia đình và đưa ra kết luận đây là bệnh di truyền lặn NST thường . Sau nghiên cứu này,
nhiều công trình nghiên cứu được công bố sau đó cũng cho kêt luận tương tự
Kugelberg và Welander (1956) đã mô tả đặc điêm của 12 bệnh nhân mắc
bệnh thoái hóa cơ tủy thê III có độ tuổi từ 2 đễn 17 đều có khả năng đi lại được ít
nhất 8-9 năm sau khi triệu chứng đẩu tiên xuất hiện .
Dựa trên triệu chứng lâm sàng, Fried và Emery (1971) đã đưa ra thê bệnh

nghiệm trong chẩn đoán bệnh thoái hóa cơ tủy [18].
Ở Việt Nam cũng có nhiều nghiên cứu về mô hình bệnh tật di truyền như
nghiên cứu tại bệnh viện Nhi Trung Ương trong 10 năm SMA chiếm 2,99% của hệ
thống da cơ xương sụn (Phan Lương Quyết 2005)
Đến năm 2011, Lê Thị Hương Lan, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Tạ
Thành Văn thực hiện đề tài “Xác định đột biến xóa đoạn gen SMN1 gây bệnh thoái
hóa cơ tủy” đã làm rõ hơn vai trò của gen SMN1 đối với SMA, từ đó là nền tảng
cho việc sàng lọc và chẩn đoán SMA tại Việt Nam [32].
Những năm gần đây thì các nhà khoa học không những quan tâm đến gen
SMN1 và còn quan tâm đến nhiều gen khác có liên quan đến SMA
1.1.2. Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân SMA
1.1.2.1 Đặc điểm chung và phân loại
Bệnh thoái hóa cơ tủy có biêu hiện triệu chứng lâm sàng rất đặc trưng do tổn
thương tế bào thần kinh sừng trước tủy sống, làm cho trẻ có biêu hiện nhược cơ
sớm, không phát triên vận động, teo cơ và bệnh tiến triên nặng dần, mất khả năng
vận động, suy hô hấp và tử vong do mắc các bệnh nhiễm trung như viêm phổi. Tuy
vậy, bệnh này cũng dễ chẩn đoán nhầm với các bệnh lý về cơ do các nguyên nhân khác
nhau. Ngay bản thân bệnh thoái hóa cơ tủy, triệu chứng lâm sàng cũng khác nhau giữa
các thê lâm sàng do nguyên nhân gây bệnh khác nhau: đột biến gen khác nhau, loại đột
biến khác nhau cũng gây ra kiêu hình (phenotype) khác nhau trên lâm sàng.


5

Bệnh SMA là một bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thê thường nên bệnh có
tính chất gia đình, tỷ lệ bệnh giữa trẻ trai và trẻ gái ngang hàng nhau. Theo công bố
của Nguyễn Ngọc Cảnh năm 2005 thì tỉ lệ Nam trên Nữ là 1/1,5. Đây là một nghiên
cứu trong vòng 2 năm từ 2004 đến 2006 với số lượng 75 bệnh nhân tại Khoa nội
tiết chuyên hóa di truyền, bệnh viện Nhi Trung Ương. Nghiên cứu của
AHM.Lai(2005) tỷ lệ bệnh nhân SMA Nam trên Nữ là 1/1,3 .

ngón tay có thê có tự động run rất nhẹ. Do nhược cơ nặng nên hai chi dưới của trẻ
luôn trong tư thế giống như chân ếch, các cơ liên sườn yếu khiến trẻ phải thở gắng
sức bằng cơ hoành đưa đến suy hô hấp. Ngoài ra trẻ còn có biêu hiện khác như lồng


6

ngực bị lõm. Tuy nhiên trẻ không có rối loạn cơ tròn, không có rối loạn cảm giác.
Bệnh tiến triên nhanh dẫn đến nhực cơ toàn thân biêu hiện:
- Giảm trương lực cơ
- Giảm vận động : cổ không nâng được đầu ,trẻ không lẫy, không bò và không

đứng được dẫn đến không đi được theo tuổi
- Mất phản xạ gân xương
- Rung lưỡi
- Biến dạng lồng ngực kết hợp với bội nhiễm viêm phổi làm cho trẻ thường tử

vong trước hai tuổi, tỉ lệ tử vong chiếm 2/3 số bệnh nhân ở thế này
- Do ăn kém trẻ thường bị suy dinh dưỡng, viêm phổi do bị sặc, bội nhiễm vì

nằm lâu dẫn đến suy hô hấp. Đây là các biến chứng thường gặp của SMA thê I
SMA thê I chiếm tỉ lệ cao nhất trong ba thê thoái hóa cơ tủy nhưng do trẻ bị
mắc bệnh thê này thường tử vong sớm nên thực tế lâm sàng người ta hay gặp các
thê II và III nhiều hơn
1.1.2.3 Thoái hóa cơ tủy thể II
Chiếm 50% các thê bệnh cũng theo nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Khánh
2005 thì SMA thê II chiếm 40,5% . Bệnh xuất hiện muộn hơn, ngoài giai đoạn sơ
sinh, thường là 6-12 tháng hoặc giai đoạn bú mẹ, trẻ có thê bú được, nuốt được.
Đến 3 tháng tuổi trẻ vẫn lẫy được, 6 tháng tuổi thì ngồi được nhưng sau đó
thường không tự đứng và không đi được. Triệu chứng nhược cơ từ từ làm cho trẻ

- Trí tuệ bệnh nhân vẫn phát triên bình thường. Trẻ vẫn theo học được. Một số
bệnh nhân bệnh xuất hiện muộn, tiến triên chậm và nhẹ nên có thê sống đến tuổi
trưởng thành thậm trí đến 50 tuổi
1.1.2.5 Thoái hóa cơ tủy thể 0
Là thê bệnh nặng nhất, trẻ bị bệnh từ lúc còn trong bào thai nên gây ra thai
chết lưu. Thê này chỉ chiếm khoảng 1% trong các thê bệnh nhưng trên lâm sàng
thường không găp mà chỉ gặp những trường hợp khai thác có tiền sử gia đình đã hi
sinh con bị bệnh và chẩn đoán trước sinh xác định được mà thôi.


8

Hình 1.1: Teo cơ tủy sống (Spinal muscular atrophy). Tàn phế nặng, cơ yếu.
Bệnh nhân không kiểm soát được đầu
1.1.3. Đặc điểm cận lâm sàng bệnh nhân SMA
1.1.3.1 Xét nghiệm đo hoạt độ Creatine kinase (CK)
Enzyme creatine kinase phosphokinase (CPK) được K. Lohman phát hiện vào
năm 1934. Tại mô cơ vân, enzym này tập trung chủ yếu ở màng sợ cơ. Vai trò của
CK tham gia xúc tác cho việc tạo năng lượng giúp cho quá trình co cơ, duỗi cơ và
chuyên hóa các chất trong tế bào cơ.

Ở bệnh nhân SMA có CK tăng nhẹ hoặc không tăng (khoảng 50% có trường
hợp có ck tăng gấp 5 lần) bởi vì tổn thương cơ trong bệnh SMA với các bệnh lý do
tổn thương tại cơ khác như Duchenne Ck tăng rất cao. Nghiên cứu Nguyễn Ngọc
Khánh (2005) xét nghiệm hoạt độ CK bình thường ở 30 bệnh nhân chiếm 76,(%
hoạt độ CK tăng gấp 2 lần ở 9 bệnh nhân chiếm 23,1% .
1.1.3.2 Điện cơ đô
Hình ảnh bất thường trên bản ghi điện cơ ở bệnh nhân SMA
+ Ở trạng thái nghỉ có hiện tượng điện thế tự phát kiêu sóng nhọn dương và co
giật sợi cơ


1.1.5. Đặc điểm về tần số mắc bệnh SMA
Thoái hóa cơ tủy là một bệnh di truyền, do đột biến gen lặn nằm trên NST số 5.
Đây là một trong những bệnh lý thần kinh cơ di truyền hay gặp nhất chỉ đứng sau
loạn dưỡng cơ Duchenne với tần số mắc bệnh cũng khá cao ước tính khoảng
1/6.000 ÷ 1/10.000 trẻ sinh sống và với tần suất người lành mang gene đột biến
1/38÷ 1/50 ,. Theo một số tác giả khác như Mostaccilo ở Ý tỷ lệ bệnh này cao hơn
7,8/10.000 trẻ sống. Ở Hungary tỷ lệ bệnh là 1:10.000 trẻ sống (Creizel,1991). Năm
2007, theo Harvey.B.Sarnat thì tần suất này là 10-15/ 100.000 trẻ sống.
1.1.6. Di truyền học và ý nghĩa xác định phả hệ bệnh SMA
Thoái hóa cơ tủy là bệnh di truyền lặn đồng hợp từ nhiễm sắc thê số 5 nên có
thê gặp ở cả nam và nữ. Người bố và mẹ mang gen tuy không biêu hiện nhưng se
truyền gen bệnh cho con. Khi người con nhận một allele bệnh từ mẹ và một allele
bệnh từ bố thì se biêu hiện bệnh. Trong trường hợp cả bố và mẹ mang gen bệnh thì
khả năng con bị bệnh là 25%, con bình thường là 25% và 50% con mang gen bệnh.
Trong trường hợp bố hoặc mẹ lành , kết hôn với một người mang gen bệnh thì tỉ lệ
con lành và con mang gen bệnh là 50%
Genotype và Phenotype
Cha

Me

Aa
AA
Aa
aa
aa

Aa
Aa

nào . Đây là trường hợp đặc biệt và hiện tại không thê phát hiện bởi các phương
pháp định lượng gen .


11

Xác định phả hệ liên quan đến bệnh SMA nhằm tìm ra nguồn gốc lây truyền
gen bệnh. Tuy nhiên, trong trường hợp các gia đình không có tiền sử mắc bệnh thì có
thê là do đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử (de novo mutation). Tuy
nhiên các cặp cha mẹ này vẫn cần xét nghiệm gen đê xác định chính xác xem họ có
phải là người lành mang gen bệnh hay không đê có tư vấn di truyền thích hợp .
1.1.7. Nguyên tắc phòng và điều trị bệnh SMA
1.1.7.1. Phòng bệnh
a, Tư vấn di truyền:
Nguyên nhân gây tử vong chính trong thời kỳ sơ sinh đó chính là các bệnh lý di
truyền chiếm một tỉ lệ khá cao trong đó có bệnh thoái hóa cơ tủy. Trong trường hợp
cả bố và mẹ mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử có kiêu hình hoàn toàn bình
thường, thì khả năng con bị bệnh là 25%, con bình thường là 25% và 50% con
mang gen bệnh. SMA hiện nay vẫn đang là một thách thức trong vấn đề điều trị

Hình 1.3.Sơ đô di truyền khi cả ba mẹ đều là người mang gen bệnh
b, Chẩn đoán người lành mang gen bệnh:
Người mang gen bệnh về lâm sàng là đối tượng khó phát hiện do hoàn toàn
bình thường về kiêu hình. Hiện nay có rất nhiều phương pháp xác định người mang
gen thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử. Các nhà lâm sàng se khảo sát được cá


12

thê đó, gia đình (bố, mẹ, anh, chị, em...) có mang gen bệnh hay không. Từ đó, người

phục hồi chức năng phòng co rút cơ và cong vẹo cột sống.
Trong tương lai gần thì liệu pháp gen se được áp dụng đê điều trị cho những
bệnh nhân SMA. Hiện nay, các nhà khoa học đang nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm ra
liệu pháp gen phu hợp đê điều trị bệnh. Quá trình phiên mã và dịch mã hình thành
nên protein SMN, gồm hai gen SMN1, SMN2 đảm nhiệm. Trong đó, SMN2 chủ
yếu sản xuất ra một protein không hoàn thiện vì thiếu hụt Exon7 (chiếm 85%) và
chỉ rất ít lượng protein hoàn chỉnh được tổng hợp, gen SMN1 thì sản xuất ra một


13

protein hoàn chỉnh với đầy đủ các chức năng. Các nhà khoa học đang nghiên cứu
tác động vào cơ chế hoàn thiện mRNA exon7 của gen SMN2 đê làm gen này cũng
tổng hợp được protein hoàn chỉnh giống như gen SMN1.
Hiện nay các nhà khoa học còn thực hiện tác động vào exon 7 của gen SMN2
như thiết kế antisense oligonucleotid có thê ngăn chặn quá trình ức chế exon 7 và
tăng cường hoàn thiện exon này (Hua và cộng sự 2010).
Dựa vào cơ chế hoàn thiện của phân tử mRNA, các nhà khoa học cũng nghiên
cứu đê cắt nối hai phân tử mRNA thành một phân tử mRNA thành một phân tử
hoành chỉnh (Trans-splicing)

Hình 1.4: Nối hai phân tử mRNA mã hóa SMN (Trans-splicing)
Các Trans -splicing RNA (tsRNA HA) liên kết với nội sinh SMN pre-mRNA
(exon 6 đến 8)
1.2. Cơ chế phân tử và di truyền của bệnh SMA
1.2.1. Cơ chế di truyền
Người ta phát hiện ra 4 gen liên quan đến bệnh thoái hóa cơ tủy, mỗi gen
gồm hai bản sao có trình tự tương đối giống nhau: Suvival Motor Neuron (SMN1,
SMN2), Neuroral Apotosis Inhibitory Potein Gene (NAIP và ΨNAIP); Basal
Transciption Factor Subunit p44( p44t và p44c), H4F5c và H4F5T

gen SMN1 mới gây bệnh thoái hóa cơ tủy. Khoảng 94% bệnh nhân thoái hóa cơ tủy
có đột biến xóa đoạn exon 7, exon 8 và khoảng 5-6% có đột biến trên gen SMN1.
Tuy đột biến điêm chiếm tỷ lệ thấp nhưng hầu hết các đột biến này không tập trung
vào một số vị trí đặc hiệu mà nằm rải rác khắp chiều dài của gen. Đây là một trong
những trở ngại rất lớn cho các nhà khoa học khi họ phân tích các dạng đột biến này.
Protein SMN được tìm thấy ở khắp cơ thê, với hàm lượng cao ở tế bào neuron vận
động tủy sống. Protein SMN rất quan trọng trong việc duy trì một loại tế bào thần
kinh đặc biệt gọi là neuron vận động (motor neuron) có trong sừng trước tủy sống.
Khi hàm lượng protein này tạo thành không đủ do đột biến xảy ra trên gen SMN1 se
gây bệnh SMA. Những người đột biến mất gen SMNl có mức độ protein SMN rất
thấp. Tuy nhiên, có sự tương quan trực tiếp giữa số lượng bản sao gen SMN2 và
mức độ biêu hiện của SMN protein. Số lượng bản sao SMN2 càng nhiều thì lượng
protein SMN được sản xuất cũng nhiều hơn và bệnh cũng nhẹ hơn. Năm 1996,
người ta phát hiện protein SMN có khả năng gắn với heterogencous nuclear
ribonucleoproteins (hnRNPs) và trú ngụ trong các cấu trúc dạng dấu chấm trong


16

nhân tế bào HeLa. Những cấu trúc này thường cũng được tìm thấy với các thê cuộn
(coiled bodies) và được gọi là gem (Gemini of coiled bodies)
Thê cuộn (coiled bodies hay còn gọi là cajal bodies) có rất nhiều trong các
nhân tố tham gia vào quá trình phiên mã và các quá trình hình thành nhiều loại
RNA người ta kết luận rằng protein SMN giữ vai trò quan trọng trong quá trình tạo
RNA. Các nghiên cứu của các phòng thí nghiệm Dreyfuss và Fischer đã đưa ra
rằng protein SMN tồn tại trong tế bào dưới dạng một thành phần của phức hợp lớn
bao gồm ít nhất 6 protein tương tác với nhau được gọi là là gemin 2-7.Phức hợp này
được công nhận là có chức năng lắp ráp giúp tăng cường tương tác giữa protein gắn kết
RNA (RNA binding protein) với trình tự đích của chúng. Phức hợp này được cho là
mang lại cho các RNA có đặc tính chuyên biệt của snRNAvà cho phép chúng kết hợp

xếp cạnh intron 6, exon 8 của gen SMN1và gen SMN2 mang hẩu hêt trình tự của
gen SMN1. Ngoại trừ, trình tự exon 8 của gen SMN2 (người mang gen lai này là
người không mắc bệnh). Các giả thuyết giải thích cho việc hình thành gen lai gồm
tái tổ hợp không đều, mất đoạn bên trong nhiễm sắc thê (intraChromosomal
deletion) và hoán chuyên gen.
1.2.2.2. Đột biến nho
Một số ít trường hợp mắc bệnh SMA là do đột biến dị hợp tử kết hợp nghĩa
là một bản sao gen SMN1 trên một nhiễm sắc thê bị mất đoạn exon 7, còn bản sao
trên gen SMN1 trên nhiễm sắc thê còn lại bị đột biến nhỏ. Khoảng 6% bệnh nhân
SMA không bị mất đồng thời hai bản sao gen SMN1. Ở những bệnh nhân này có
những đột biến nhỏ (suthe hoặc non-deletion mutations) trên gen SMN1, trong đó tỉ
lệ cao nhất ở bệnh nhân type III và thấp nhất ở bệnh nhân thê I. Các nhà nghiên cứu
đã tìm thấy khoảng 40 đột biến nhỏ trên gen SMN1, trong đó các đột biến nhỏ xảy
ra thường xuyên nhất trên exon 6 và exon 3. Hai đột biến có tần số cao nhất là nhất
là đột biến chuyên nghĩa (missense) Y272C(815A->G, và đột biến dịch khung
813ins/dup 11(768-778dup TGCTATGCTT)
1.2.2.3. Đột biến mới
Đột biến mới có thê xảy ra trong quá trình giảm phân tạọ giao tử. Gen SMN1
có tỷ lệ đột biến mới cao do đó tần số dị hợp tử mang gen SMN1 cao trong quần


18

thê. Tỷ lệ đột biến mới xảy ra trong quá trình tạo giao tử của người cha là 2,11x10 4
có tần số cao hơn của mẹ là 4,15 x105.
Có 3 nguyên nhân gây đột biến mới
+ Trao đổi chéo không đều giữa các NST tương đồng
+ Mất đoạn bên trong NST
+ Hoán vị gen
1.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen SMN1 và SMN2

mang gen bệnh trong các bệnh lý di truyền . MPLA là kỹ thuật cho phép phát hiện
các tổn thương gen một cách chính xác và nhanh chóng. Ưu điêm của phương pháp
này là thực hiện thời gian ngắn (2-3 ngày), cần thê tích nhỏ, thao tác đơn giản và
cho phép phân tích cung lúc nhiều mẫu. Trong bệnh thoái hóa cơ tỷ người ta thường
sử dụng kỹ thuật này đê phát hiện người lành mang gen bệnh
Nguyên tắc phản ứng MLPA
Trong phản ứng MLPA, vấn đề thiết kế các probe gắn đặc hiệu với các đoạn
DNA đích đóng vai trò cực kỳ quan trọng. Thông thường, mỗi probe chứa 2 phân tử
oligonucleotid có kích thước khác nhau-Phân tử oligonucleotid ngắn gồm hai đoạn:
+ Đoạn 1 có trình tự nucleotid đặc hiệu với đoạn DNA đích và se lai với DNA
đích khi tiến hành phản ứng lai. Đoạn này có khoảng 21 – 30 nucleotid nằm ở đầu
3’ của probe.
+ Đoạn 2 nằm ở đầu 5’, chứa khoảng 19 nucleotid. Trình tự nucleotid của
đoạn này giống nhau cho tất cả các probe. Đây là vị trí gắn với mồi Y đê khuếch đại
probe khi tiến hành phản ứng PCR.
-Phân tử oligonucleotid dài gồm 3 đoạn:
+ Đoạn 1’ chứa 25 – 43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích ở đầu tận 5’
+ Đoạn 2’ gồm 36 nucleotid ở đầu 3’, trình tự nucleotid giống nhau cho tất cả
các probe. Đây là vị trí gắn với mồi X đặc hiệu đê khuếch đại probe
+ Đoạn 3’ còn gọi là đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm giữa hai đoạn 1’ và 2’,
cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid. Trình tự nucleotid không đặc hiệu với DNA
đích nên nó không gắn vào DNA đích. Chiều dài đoạn Stuffer khác nhau ở các
probe, vì vậy các probe khác nhau se có chiều dài khác nhau. Do đó, sản phẩm
khuếch đại của các probe se được phân tách bằng cách điện di.
Trong mỗi phản ứng chứa các probe nội chuẩn, khi probe nội chuẩn lên đỉnh
tương ứng là điều kiện đảm bảo độ tin cậy khi nhận định kết quả. Ngoài ra chúng