SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
---------------&---------------

Chuyên đề 06:

Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa cao bán thành phẩm

Phục vụ đề tài:
“NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA CỐM
“TIỀN LIỆT HC” TRONG ĐIỀU TRỊ PHÌ ĐẠI LÀNH TÍNH TUYẾN
TIỀN LIỆT TRÊN THỰC NGHIỆM VÀ LÂM SÀNG”
Mã số: 01C-80/08-2013-2

Chủ nhiệm đề tài:

TS. Nguyễn Thị Thu Hà
PGS.TS. Nguyễn Nhược Kim

Nhóm nghiên cứu chuyên đề:

PGS. TS. Hoàng Minh Chung
PGS. TS. Nguyễn Mạnh Tuyển

Hà Nội, 2013


2

MỞ ĐẦU
Để có qui trình bào chế ổn định, sản phẩm làm ra đạt tiêu chuẩn thì

những bài thuốc mà dược liệu có chất chuẩn để có thể đối chiếu được là được
khuyến khích. Tuy nhiên việc sử dụng chất chuẩn làm đối chiếu đối với dược
liệu cũng cần phải có điều kiện khắt khe còn đối với bài thuốc có nhiều vị
thuốc thì hiện nay gần nhưu chưa thực hiện được ở các cơ sỏ sản xuất với
nhiều yếu tố khách quan và chủ quan.
Vì vậy việc sử dụng tiêu chí sao cho có kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện
được ở tuyến cơ sở hiện nay đang là phổ biến.
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số chỉ tiêu cần thiết cho cao thu được từ
dịch chiết toàn phần của bài thuốc, từ đó đề xuất tiêu chuẩn cho sản phẩm
trung gian của của bài thuốc Tiền liệt HC có thể áp dụng được vào thực tế.
Mục tiêu của chuyên đề:
1. Nghiên cứu một số chỉ tiêu của cao « Tiền liệt HC ».
2. Đề xuất TCCS cho cao bán thành phẩm « Tiền liệt HC ».

I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU


4
1.1. CAO THUỐC (Extracta)
1.1.1. Định nghĩa
Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy
định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung
môi thích hợp.
Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy khô và chia nhỏ
đến kích thước thích hợp). Đối với một số dược liệu đặc biệt có chứa men làm
phân hủy hoạt chất cần phải diệt men trước khi đưa vào sử dụng bằng cách
dùng hơi cồn sôi, hơi nước sôi hoặc bằng phương pháp thích hợp khác.
Cao thuốc được chia làm 3 loại:
Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử
dụng trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản

Ở tốc độ chậm: Không quá 1 ml dịch chiết/ phút,
Ở tốc độ vừa: 1 - 3 ml dịch chiết/ phút
Ở tốc độ nhanh: 3 - 5ml dịch chiết/ phút .
Để riêng phần dịch chiết đầu đậm đặc bằng 4/5 lượng dược liệu đem
chiết. Sau đó cô các phần dịch chiết tiếp theo trên bếp cách thuỷ hoặc cô dưới
áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60 ºC cho đến khi loại hết dung môi. Hoà
tan cắn thu được vào trong dịch chiết đầu đậm đặc và nếu cần, thêm dung môi
vào để thu được cao lỏng đạt tỷ lệ quy định. Cao lỏng có khuynh hướng bị
lắng cặn vì vậy để cao lỏng ở chỗ mát trong thời gian ít nhất 3 ngày, rồi lọc.
Cao đặc và cao khô: Dịch chiết được cô đặc đến khi độ ẩm còn lại không
quá 20%. Trong trường hợp điều chế cao khô, tiếp tục sấy khô để độ ẩm còn
lại không quá 5%. Để đạt đến thể chất quy định, quá trình cô đặc và sấy khô
dịch chiết thường được tiến hành trong các thiết bị cô dưới áp suất giảm ở
nhiệt độ không quá 60oC. Nếu không có các thiết bị cô đặc và sấy dưới áp
suất giảm thì được phép cô cách thủy (không được cô trực tiếp trên lửa) và
sấy ở nhiệt độ không quá 80oC.


6
Trường hợp muốn thu cao thuốc có tỷ lệ tạp chất thấp, phải tiến hành
loại tạp chất bằng các phương pháp thích hợp tuỳ thuộc vào bản chất cuả
dược liệu, dung môi và phương pháp chiết xuất.
Có thể cho thêm chất bảo quản hoặc các chất trơ để làm chất mang hay
để cải thiện các tính chất vật lý. Đối với cao khô có thể sử dụng các bột trơ
thích hợp hay cao khô của dược liệu sử dụng để điều chỉnh nồng độ hoạt chất
đến tỷ lệ quy định.
1.1.3. Yêu cầu chất lượng của cao
Mỗi loại cao cần phải đạt các yêu cầu theo quy định trong chuyên luận
riêng nhưng với tất cả các loại cao thì cần đạt các yêu cầu chung sau đây:
Độ tan: Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã sử dụng để điều

chất hoặc của hợp chất nhận dạng được quy định theo từng chuyên luận riêng,
tên và nồng độ của chất bảo quản thêm vào. Khi hoạt chất chưa biết, tỷ lệ giữa
dược liệu và sản phẩm cuối cùng phải được nêu rõ. Đối với cao đặc và cao
khô, loại và số lượng tá dược thêm vào cũng được nêu ra. Trong trường hợp
này, % của cao tự nhiên cũng phải được ghi rõ.
1.2. Một số quy định trong xây dựng tiêu chuẩn
1.2.1. Các chất đối chiếu (ĐC)
Chất đối chiếu là chất đồng nhất đã được xác định là đúng để dùng trong
các phép thử đã được quy định về hoá học, vật lý và sinh học. Trong các phép
thử đó các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất
cần thử. Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng.
Chất đối chiếu được dùng trong các phép thử sau:
Định tính bằng phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại.
Định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến,
quang phổ huỳnh quang.
Các phép thử định tính tạp chất và định lượng bằng phương pháp sắc ký.


8
Định lượng bằng phương pháp vi sinh vật.
Các phép chuẩn độ đo thể tích, phân tích trọng lượng.
Các phép thử sinh học.
Một số phép thử khác có hướng dẫn trong các chuyên luận riêng.
Cách sử dụng chất đối chiếu
Để đáp ứng mục đích sử dụng, chất đối chiếu phải được bảo quản, theo
dõi và sử dụng đúng. Theo qui định thông thường, chất đối chiếu phải được
đựng trong bao bì gốc, kín, có nhãn rõ ràng, được thường xuyên bảo quản ở
nhiệt độ thấp, tránh ánh sáng và ẩm; nếu cần có điều kiện bảo quản đặc biệt
khác thì có hướng dẫn trên nhãn.
Trước khi mở bao gói để dùng, chất đối chiếu cần được để một thời gian để

sản lượng hoặc quyết định các đặc tính như dạng tinh thể, độ tinh khiết, tính
hoà tan của sản phẩm. Vì vậy, đôi khi dung môi là yếu tố quyết định trong quy
trình tổng hợp. Quy định này không đề cập đến các dung môi dùng có cân
nhắc kỹ lưỡng như một chất phụ gia, hoặc đến các solvat. Tuy nhiên hàm
lượng dung môi trong các sản phẩm loại này phải được xác định và chứng
minh hợp lý.
Vì các dung môi tồn dư không có tác dụng điều trị, các dung môi này
phải được loại bỏ đến mức tối đa để đạt được các yêu cầu kỹ thuật của sản
phẩm, việc thực hành tốt sản xuất (GMP) hoặc các yêu cầu chất lượng khác.
Dược phẩm phải chứa một mức dung môi tồn dư không được cao hơn các dữ
liệu an toàn. Phải tránh dùng một số dung môi có độc tính không thể chấp
nhận được (dung môi nhóm 1, Bảng 10.14.1-1), trừ khi lợi ích của việc sử
dụng chúng được xác định chắc chắn. Một số dung môi có độc tính ít nguy
hiểm hơn (dung môi nhóm 2, Bảng 10.14.1-2) cũng cần phải dùng hạn chế, để
bảo vệ người bệnh khỏi tác dụng độc hại. Tốt nhất phải dùng các dung môi ít
độc (dung môi nhóm 3, Bảng 10.14.1-3).
a. Phạm vi áp dụng
Các dung môi tồn dư trong dược chất, tá dược và dược phẩm thuộc phạm
vi áp dụng của quy định này. Vì thế phải thực hiện phép thử tìm các dung môi


10
tồn dư trong quá trình sản xuất hay tinh chế để kiểm soát sự hiện diện của
chúng. Chỉ cần kiểm tra đối với các dung môi đã được sử dụng hay được sản
sinh ra trong quá trình sản xuất hoặc tinh chế các dược chất, tá dược hoặc
dược phẩm đó. Mặc dù các nhà sản xuất có thể chọn phương pháp xác định
hàm lượng dung môi tồn dư trong sản phẩm, ta vẫn có thể tính hàm lượng đó,
đi từ hàm lượng dung môi tồn dư trong các thành phần dùng để sản xuất ra
sản phẩm đó. Nếu kết quả tính toán bằng hoặc thấp hơn giới hạn cho phép đã
được khuyến cáo trong bản quy định này, thì không cần tiến hành thí nghiệm

1: Các dung môi cần tránh dùng
Các chất gây ung thư cho người hay có khả năng gây ung thư cho người
rõ rệt. Các chất nhiễm độc môi trường.
Nhóm 2: Các dung môi cần hạn chế dùng
Các chất gây ung thư trên động vật không độc cho gen hoặc các tác nhân
có thể gây độc không hồi phục như độc tính trên thần kinh hoặc gây quái thai.
Các dung môi nghi có độc tính quan trọng, nhưng hồi phục được.
Nhóm 3: Các dung môi độc tính thấp
a. Các dung môi có độc tính thấp trên người: Không cần xác định liều
gây tác hại cho sức khoẻ.
Các dung môi nhóm 3 có liều phơi nhiễm được phép mỗi ngày (PDE)
bằng hoặc lớn hơn 50 mg/ngày.
b. Phương pháp xác định giới hạn phơi nhiễm
Phương pháp dùng để xác định liều phơi nhiễm được phép mỗi ngày của
các dung môi tồn dư được giới thiệu trong chú thích 3. Tóm tắt các dữ liệu về
độc tính dùng để thiết lập liều phơi nhiễm được phép mỗi ngày được công bố
trong Pharmeuropa Vol 1, No 1, Supplement April/1997.
c. Cách xác định giới hạn dung môi nhóm 2
Có hai cách có thể áp dụng để xác định giới hạn cho các dung môi nhóm 2.


12
Cách 1:
Có thể dùng hàm lượng (nồng độ) giới hạn tính theo phần triệu (ppm)
ghi trong Bảng 10.14.1-2. Các nồng độ này được tính theo công thức (1) với
lượng chế phẩm dùng mỗi ngày cho là 10 g.
1000 x PDE
Nồng độ (phần triệu) =

(1)

tồn dư mô tả trong dược điển. Ngoài ra, nhà sản xuất có thể tự do chọn lựa
một quy trình phân tích có hiệu lực thích hợp nhất để áp dụng riêng. Nếu chỉ
hiện diện dung môi nhóm 3 thôi, có thể dùng một phương pháp không đặc
hiệu như phương pháp giảm khối lượng do sấy khô (Phụ lục 9.6).
C. Giới hạn dung môi tồn dư
* Dung môi phải tránh sử dụng: Thường không dùng trong YHCT
* Dung môi phải hạn chế sử dụng: Thường không dùng trong YHCT
* Dung môi có độc tính thấp
Các dung môi nhóm 3 (có trong Bảng 10.14.1-3) có thể coi như ít độc và
có nguy cơ thấp đối với sức khoẻ con người. Nhóm 3 bao gồm các dung môi
không nguy hiểm đối với sức khoẻ con người ở hàm lượng thường được chấp
nhận trong dược phẩm. Tuy nhiên chưa có các nghiên cứu về độc tính trường
diễn và về khả năng gây ung thư của nhiều dung môi thuộc nhóm này. Các dữ
liệu hiện có cho thấy các dung môi này tỏ ra ít độc trong các cuộc nghiên cứu
cấp diễn hoặc ngắn hạn và cho kết quả âm tính với những thử nghiệm độc tính
trên di truyền. Do đó, coi như được phép dùng các dung môi này với lượng 50
mg mỗi ngày hoặc thấp hơn (tương ứng với hàm lượng 5000 ppm hoặc 0,5%
tính theo cách 1) mà không cần phải thuyết minh. Có thể dùng ở mức cao hơn,
miễn là thực tế có liên quan đến khả năng sản xuất và thực hành sản xuất tốt.
* Dung môi chưa có đủ thông tin về độc tính
Các dung môi trong Bảng 10.14.1-4 có thể cũng được các nhà sản xuất
dược chất, tá dược hoặc dược phẩm quan tâm. Tuy nhiên, chưa có các dữ liệu
đầy đủ về độc tính của chúng để làm cơ sở cho việc xác định liều phơi nhiễm
được phép mỗi ngày (PDE). Khi sử dụng các dung môi này trong sản xuất,


14
nhà sản xuất phải giải trình rõ ràng sự tồn dư của các dung môi này trong sản
phẩm của mình.
Bảng 10.14.1-3: Các dung môi nhóm 3, phải được giới hạn vì GMP hoặc


2- Methyl-1-propanol

Dimethylsulfoxid

Pentan

Ethanol

1- Pentanol

Ethyl acetat

1- Propanol

Ethyl ether

2- Propanol

Ethyl format

Propyl acetat

Acid formic

Tetrahydrofuran

II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Nguyên liệu

12
12
20

1.2. Dung môi, hóa chất
Hóa chất: acid sulfuric (TT), ethanol 96 %
1.3. Máy móc - trang thiết bị
- Máy chiết, cô dưới áp xuất giảm.
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
Máy xay
Máy tạo hạt
2. Phương pháp (theo phụ lục DĐVN IV)
- Phương pháp chiết bằng cách nấu dược liệu với nước
- Phương pháp hóa thực vật


16
III. KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC
3.1. Nghiên cứu tính chất của cao
Công thức pha chế cao
Vị thuốc
Đào nhân
Hoài sơn
Lệ chi hạch

Số lượng (kg)
5,0
6,0
6,0


70,0lit

Dược liệu được chế biến, chiết, loại tạp và cô dưới áp suất giảm theo quy
trình được cao đưa vào nghiên cứu
* Tính chất: Cao có màu nâu, mùi thơm dược liệu, vị hơi đắng.
* Độ tan: Cao tan hoàn toàn trong nước khi hòa tan 10 g cao vào 20 ml

nước ấm. Khi hòa tan dịch đồng nhất, không có váng thuốc, không có cặn bã
dược liệu và vật lạ.
* Mất khối lượng do làm khô: Lấy 1g cao, sấy khô ở nhiệt độ 105 0C
trong khoảng 5 giờ, cân. Sau đó sấy thêm 1 giờ trong tủ sấy cân lại. Làm 3 lần
liên tiếp như vậy. So sánh khối lượng cân được của lần sau với lần sấy trước
đó không quá 0,5 mg. Kết quả cao có hàm ẩm 25, 5 %.
3.2. Nghiên cứu một số chỉ tiêu định tính


17
Các cao được đưa vào nghiên cứu bao gồm: Cao trước loại tạp chiết
bằng phương pháp thủ công (cao 1); Cao sau loại tạp chiết bằng phương pháp
thủ công (cao 2) và cao sau loại tạp chiết, cô dưới áp suất giảm (cao 3).
3.2.1. Nghiên cứu thành phần Flavonoid trong các cao
Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,3 g cao các loại, thêm 10ml nước cất
nóng; để nguội. Lắc dịch chiết nước với ether dầu hỏa (3x15ml) để loại một
số tạp chất. Loại bỏ lớp Ether. Lắc tiếp với EtOAc (3x15ml). Lọc lấy dịch
chiết EtOAc, cô trên cách thuỷ đến 1ml được dung dịch chấm sắc ký.
Tiến hành: Chấm riêng biệt 20 µl mỗi dung dịch cao lên bản mỏng từ
trái qua phải là cao 1, cao 2 và cao 3. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi
được khoảng 10 cm, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng.
Triển khai 3 hệ dung môi sau:
1. CHCl3 : MeOH tỷ lệ (9 : 1).

19
Thuốc thử: Dung dịch vanilin - acid sulfuric (TT): Trộn đồng lượng
dung dịch vanilin 1% trong ethanol 96% và dung dịch acid sulfuric 5% trong
ethanol 96%. Pha trước khi dùng.
Tiến hành:
Dung dịch đối chiếu: 2g Ngưu tất cắt nhỏ +30ml Ethanol 96%, cách
thủy 60 phút (bổ sung dung môi để luôn đủ khoảng 30 ml), lọc, cô dịch đến
5ml, thêm 5ml HCl 10%, hồi lưu cách thủy 60 phút, cô dịch còn 5ml thêm
5ml nước, chiết bằng cloroform (2 lần x 10ml), gộp dịch, rửa nước 2 lần x
10ml, cô cách thủy đến cắn, hòa cắn với 1 ml methanol được dung dịch chấm
sắc ký.
Dung dịch thử: Lấy khoảng 2g cao mỗi loại, thêm 5 ml nước cho tan
hoàn toàn, thêm 5 ml acid hydrocloric 10%, hồi lưu cách thủy 60 phút, cô
dịch còn 5ml thêm 5ml nước, chiết bằng cloroform (2 lần x 10ml), gộp dịch,
rửa nước 2 lần x 10ml, cô cách thủy đến cắn, hòa cắn với 1 ml methanol được
dung dịch chấm sắc ký.
Tiến hành: Chấm riêng biệt 20 µl mỗi dung dịch thử và đối chiếu lên
bản mỏng. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 10 cm, lấy bản
mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng.
Phát hiện: Soi ở đền tử ngoại rồi phun thuốc thử hiện màu, sấy 100 105 oC đến khi hiện rõ vết.
Kết quả:
Thuốc thử hiện màu ở ánh sáng thường, có 3 vết, 1 vết rõ, 2 vết nhạt (a)
Ở bước sóng 254, có 3 vết tương đương nhau giữa dược liệu và các cao (b)
Ở bước sóng 366,1 vết tương đương rõ, còn lại vết dược liệu hơi nhạt (c)


20

a


hồi n-Butanol. Cắn thu được hòa tan trong 1 thể tích nhỏ methanol. Nhỏ từ từ
dung dịch này vào một thể tích aceton gấp 10 – 15 lần, xuất hiện tủa. Để
lắng, lọc, rửa tủa.
Sấy tủa đến khối lượng không đổi. Cân tủa và tính hàm lượng cắn toàn phần
trong chế phẩm theo theo công thức : C (%) =

m
x100
M

Trong đó :
C : Hàm lượng % cắn toàn phần.
m : Khối lượng cắn trong phân đoạn n-BuOH (g)
M : Khối lượng cao đem định lượng (g)
Kết quả: Hàm lượng cắn trung bình của 3 cao là


22
Cao 1: 3,25 %
Cao 2: 3,18 %
Cao 3: 3,75 %
3.4. Giới hạn nhiễm khuẩn
Thử theo Phụ lục 13.6 Thử giới hạn nhiễm khuẩn cao không có
Salmonella, Escherichia coli, Staphylococcus aureus và Pseudomonas
aeruginosa.
Giới hạn nhiễm khuẩn:
- Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được: Không quá 2.103 CFU/ g.
- Tổng số nấm mốc, nấm men sống lại được: Không quá 30 CFU/ g.
- Tổng số Enterobacteria: Không quá 50 CFU/ g
3.5. Đề xuất tiêu chuẩn cho cao


1.4.

Độ trong: Khi hòa tan 1 g cao vào 5 ml nước phải trong không được

lắng cặn, hoặc có bã dược liệu.
1.5.

Định tính: Thể hiện phép thử định tính Hoài sơn, Ngưu tất, Hoài sơn.

1.6.

Định lượng: Hàm lượng chất chiết được trong n – BuOH không nhỏ

hơn
1.7.

Giới hạn nhiễm khuẩn
- Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được: Không quá 2.103 CFU/ g.
- Tổng số nấm mốc, nấm men sống lại được: Không quá 30 CFU/ g.
- Tổng số Enterobacteria: Không quá 50 CFU/ g
- Không được có Salmonella, Escherichia coli, Staphylococcus aureus
và Pseudomonas aeruginosa.

2. PHƯƠNG PHÁP THỬ
2.1.Tính chất: Bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu.
2.2.Hàm ẩm: Thực hiện theo DĐVN IV, phụ lục 9.6 “Mất khối lượng do làm khô.
2.3.Độ hòa tan: Lấy khoảng 1 g cao hòa vào 5 ml nước phải tan hoàn toàn.




b.

Cách thử

Dung dịch đối chiếu: Lấy khoảng 2 g Ngưu tất cắt nhỏ, thêm 30 ml
ethanol 96%, đun sôi cách thủy 60 phút (chú ý bổ sung ethanol trong quá trình
đun) (hoặc đun sôi hồi lưu cách thủy 40 phút). Lọc, cô cách thủy dịch lọc đến
còn khoảng 5 ml thêm 5 ml acid hydrocloric 10%, chuyển vào bình nón nút
mài, đun sôi hồi lưu cách thủy 60 phút, cô dịch chiết còn khoảng 5 ml (nếu
cần), chuyển sang phễu chiết với nước 5 ml, chiết với cloroform (2 lần x 10
ml). Gộp các dịch chiết cloroform, rửa với nước 2 lần x 10 ml, cô dịch
cloroform cách thủy đến cạn. Hoà cắn với 1 ml methanol làm dung dịch đối
chiếu.
Dung dịch thử: Lấy khoảng 2g cao mỗi loại, thêm 5 ml nước cho tan
hoàn toàn, thêm 5 ml acid hydrocloric 10%, hồi lưu cách thủy 60 phút, cô
dịch còn 5ml thêm 5ml nước, chiết bằng cloroform (2 lần x 10ml), gộp dịch,


25
rửa nước 2 lần x 10ml, cô cách thủy đến cắn, hòa cắn với 1 ml methanol được
dung dịch chấm sắc ký.
Tiến hành: Chấm riêng biệt 20 µl mỗi dung dịch thử và đối chiếu lên
bản mỏng. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 10 cm, lấy bản
mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, triển khai thêm lần nữa.
Phát hiện: Phun thuốc thử hiện màu, sấy 100 - 105 oC đến khi hiện rõ
vết.
Kết quả: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử có vết cùng màu sắc và vị trí
với vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
2.5.2. Hoài sơn