ĐẠI

HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN BÍCH HẠNH

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM
ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA
CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HOÀNG LIÊN
(COPTIS CHINENSIS FRANCH)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2017


ĐẠI

HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN BÍCH HẠNH

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM
ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA
CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HOÀNG
LIÊN (COPTIS CHINENSIS FRANCH)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
(NGÀNH DƯỢC HỌC)

A
ACh
AChE
ACTI
BuOH

DA
Độ hấ
Acety
Enzym
Acety
Butan


CV

Hệ số

DTNB
EtOAc
EtOH
HCl
HPLC

Acid
Ethyl
Ethan
Acid
Sắc k
Chrom

Tên bả
Thành p

Bảng 3.2

Giá trị I
chân gà


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch).....................................4
Hình 1.2. Công thức cấu tạo một số chất trong thân rễ Hoàng liên.....................7
Hình 1.3. Các vị trí hoạt động của enzym AChE................................................14
Hình 2.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn dược liệu Hoàng liên...............................20
Hình 2.2. Quá trình phản ứng diễn ra trong phương pháp đo quang sử dụng
thuốc thử Ellman................................................................................................. 21
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình thử nghiệm tác dụng ức chế AChE in vitro...............23
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE in vitro .. 25

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym AChE của các
phân đoạn dịch chiết cây Hoàng liên chân gà.....................................................29
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym AChE của
Berberin clorid.....................................................................................................29
Hình 3.3. Đồ thị Lineweaver-Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH..............31
Hình 3.4. Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH để xác định hằng
số ức chế Ki.........................................................................................................31


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

3.2. Kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE.............................. 30
3.3. Bàn luận.................................................................................................. 32
3.3.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in
vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch) 32
3.3.2. Về kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym
Acetylcholinesterase của phân đoạn dịch chiết Hoàng liên.........................33
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.......................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO


MỞ ĐẦU
Cuộc sống hiện đại ngày càng phát triển cùng với đó cũng là sự gia
tăng của bệnh suy giảm trí nhớ - đặc biệt là Alzheimer không chỉ ở người cao
tuổi mà thậm chí người trẻ tuổi cũng mắc phải. Năm 2012, Tổ chức y tế thế
giới đã cảnh báo về mối lo ngại do bệnh này gây ra và đưa bệnh Alzheimer
vào vấn đề sức khỏe cộng đồng cần được ưu tiên [11]. Nghiên cứu cho thấy
có khoảng 35 triệu người mắc bệnh Alzheimer, thống kê tại châu Á có khoảng
gần 13 triệu người mắc bệnh Alzheimer, dự đoán đến năm 2050 con số này có
thể tăng lên đến 62,8 triệu người. Việt Nam có khoảng hơn 9 triệu người bị sa
sút trí tuệ mà dạng điển hình là Alzheimer. Đây được coi là căn bệnh nặng
nhất trong các nhóm bệnh sa sút trí tuệ, hiện nay là mối quan tâm hàng đầu
của những nhà lão khoa trên toàn thế giới cũng như ở nước ta khi tuổi thọ
trung bình ngày càng cao, số người mắc bệnh ngày càng nhiều [6].
Bệnh nhân bị Alzheimer sẽ bị giảm khả năng xét đoán, định hướng
không gian và thời gian, ngôn ngữ, tư duy nhận thức và hành động... ảnh
hưởng nặng nề đến chức năng và chất lượng cuộc sống, gây nhiều khó khăn
cho người bệnh, cho gia đình và xã hội.
Các thuốc điều trị Alzheimer chủ yếu gồm các thuốc ức chế
cholinesterase, thuốc kháng thụ thể N-methyl – D – Aspartat, thuốc tăng
cường hoạt tính serotonin. Ba nhóm thuốc này đa số là các thuốc tân dược, giá

Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá tác dụng ức chế
enzym Acetylcholinesterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên
(Coptis chinensis Franch)” với mục tiêu:
Mục tiêu 1: Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE của các phân đoạn
dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch).
Mục tiêu 2: Đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE của phân
đoạn dịch chiết.

2


CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) –
Họ Hoàng liên (Ranunculaceae)
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Hiện nay có rất nhiều loài Hoàng liên chân gà được đưa vào sử dụng và
nghiên cứu như Coptis chinensis Franch, Coptis teeta Wall, Coptis deltoidea
C.Y.Cheng et Hsiao, Coptis quinqueseeta. Họ Hoàng liên: Ranunculaceae.
Hoàng liên: Coptis chinensis Franch, là một cây thuốc thuộc loại quý
với nhiều tác dụng được dùng trong nhiều bài thuốc ở Việt Nam. Tên khác:
Hoàng liên chân gà, Xuyên liên, Phàng lình (H’Mông) [9]. Read Coptis
(Anh), Coptis savoyard (Pháp) [2,9] Gia liên (Trung Quốc) [9].
Hoàng liên: Coptis chinensis Franch là cây thân thảo, sống nhiều năm,
cao 10-25 cm. Thân rễ có màu vàng thường phân nhánh, lá có cuống dài mọc
tập trung ở gốc, lá dài và mảnh chia thành 3 thùy chính. Mép khía răng không
đều, thùy giữa gần giống tam giác cân xẻ thùy hình dạng lông chim, không
đều. Hai thùy bên giống nhau có cuống lá ngắn hơn thùy giữa. Lá có màu
xanh lục, nhẵn bóng, cụm hoa gồm 3-5 hoa mọc tụ trên 1 cuống chung dài
khoảng 25 cm. Hoa nhỏ có màu vàng, lá bắc nhỏ, bao hoa màu lục. Năm lá
đài có hình mác, 5 cánh hoa thon dài, hoa có khoảng 20 nhị. Lá noãn rời nhau


mát, nhiệt độ thấp khoảng 20-250C. Muốn trồng Hoàng liên, chọn các quả già
nhưng chưa nứt vỏ. Đem quả về phơi cho nứt vỏ, chọn các hạt mập chắc rồi
reo ngay tránh để lâu làm mất khả năng mọc của hạt. Nếu chưa gieo ngay cần
trộn ủ hạt với đất lẫn cát ẩm. Trong vòng 1 tháng phải đem trồng nếu để lâu
hạt sẽ không nảy mầm.



Thu hái
Thu hái Hoàng liên thường vào cuối thu đầu đông tháng 9-10, để chất
lượng dược liệu đạt cao nhất, để sang xuân chất lượng sẽ kém. Cây mọc từ 45 năm có thể được thu hoạch. Hoàng liên thu hái mang về rửa sạch, phơi hay
sấy khô là được [7].
1.1.3. Thành phần hóa học
Thân rễ Hoàng liên chứa hầu hết là các alkaloid (5 – 8%), trong đó chủ
yếu là berberin, worenin, jatrorrhizin, palmatin, coptisin, columbamin. Ngoài
ra còn có các alkaloid có nhân phenol, cũng như các alkaloid không có nhân
phenol.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phương pháp quang phổ tử
ngoại đã được dùng để xác định berberin hydrochlorid, palmatin clorid,
jatrorrhizin hydrochlorid, epiberberin, coptisin, columbamin và magnoflorin
trong các mô khác nhau (như phloem (libe), xylem (chất gỗ) và medulla (lõi))
và rizhome (thân rễ) của Coptis Chinensis Franch. Kết quả cho thấy khác biệt
đáng kể trong việc phân bố của 7 alkaloid trong các mô được kiểm tra, tổng
hàm lượng alkaloid trong xylem tương đối thấp so với hàm lượng trong
phloem, medulla và rhizome của Hoàng liên [47,48].
Berberin tinh khiết là dạng tinh thể kết tinh màu vàng, điểm nóng chảy
1450C, tan nhiều trong nước ở 200C, tan trong ethanol, ít tan trong clorofom,
benzen, không tan trong ether ethylic. UVmax 265, 243nm, pk = 2,47 [2-4].
Hàm lượng berberin trong Hoàng liên đạt 5-6% có khi tới 9% [9].

1.1.4. Bộ phận dùng
Thân rễ (Rhizoma Coptidis) là những mẩu cong queo dài 3-5 cm, rộng
0,2 - 0,5 cm. Có nhiều đốt khúc khuỷu và phân nhánh, trông giống hình chân
gà nên được gọi là Hoàng liên chân gà. Mặt ngoài màu nâu mang vết tích của
rễ phụ và cuống lá. Thể chất cứng rắn, vết bẻ ngang không phẳng. Phần gỗ
màu vàng tươi, vị rất đắng lưu vị lâu trong miệng [2,7,9].
1.1.5. Tác dụng dược lý


Tác dụng kháng khuẩn

Dịch chiết Hoàng liên và hoạt chất berberin đều có phổ kháng khuẩn rất
rộng. Nước sắc thể hiện tác dụng ức chế vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng
sau: Nồng độ 1:5120 có tác dụng với Shigella shiga; nồng độ 1: 2560 có tác
dụng với Shigella dysenteriae; nồng độ 1: 1640 có tác dụng với
Staphylococcus aureus [4,9].
Dung dịch berberin clohydrat được pha loãng tiến hành phản ứng in
vitro cho thấy: nồng độ 1:32000 có tác dụng ức chế đối với Vibrio cholerae;
nồng độ 1:16000 có tác dụng với Staphylococcus aureus; nồng độ 1:8000 có
tác dụng ức chế vi khuẩn đối với Shigella dysenteriae, Streptococcus viridans
[1,4,9].
Tiêm tĩnh mạch trên chó với berberin clohydrat liều lượng 19mg/kg đã
cứu sống được con vật bị nhiễm trùng huyết thực nghiệm gây ra bởi
Staphylococcus aureus [1,9].
Dịch chiết thô Hoàng liên có tác dụng ức chế ký sinh đường ruột
Blastocystis hominis rất mạnh với nồng độ 100 µg/ml [1].
Về cơ chế tác dụng kháng khuẩn: berberin có khả năng ức chế quá trình
phiên mã và dịch mã tạo ARN và protein ở vi khuẩn. Các chất vitamin B6,
nicotinamid, acid p – aminobenzoic đều có tác dụng đối kháng với berberin.
Có hiện tượng kháng thuốc xảy ra khi dùng dài ngày berberin sulfat trên các

Tác dụng kháng nấm, đơn bào gây bệnh

Hoàng liên có tác dụng kháng một số loài nấm gây bênh ngoài da với
dịch chiết nước từ dược liệu này pha loãng 1:30 đã chứng tỏ tác dụng.
Quan sát dưới kính hiển vi berberin với nồng độ 1:5000 cho chuột nhắt
trắng đã được gây nhiễm amip uống với liều lượng 50 mg/kg có tác dụng ức
chế sinh trưởng của amip gây bệnh.
Dịch chiết Hoàng liên cho thấy tác dụng chống đơn bào Trypanosoma
cruzi gây bệnh Chagas với IC50 khá thấp là 1,7 µg/ml; và không gây độc cho
tế bào [36].


Tác dụng trên đường tiêu hóa

Hoàng liên có tác dụng chống loét đường tiêu hóa. Nghiên cứu cho
chuột cống trắng uống dich chiết alkaloid của Hoàng liên có tác dụng ức chế
nhẹ loét dạ dày thực nghiệm do stress. Bằng đường tiêm dưới da trên chuột
cống trắng berberin có tác dụng ức chế hình thành vết loét và hiện tượng chảy
máu dạ dày trong mô hình gây loét do thắt môn vị [9].
Dịch chiết từ Hoàng liên có tác dụng làm tăng nhẹ sự phân tiết dịch
nước bọt, dịch vị, dịch mật và tăng cường hoạt động của ruột, dạ dày từ đó
kích thích tiêu hóa, có lợi cho đường tiêu hóa [4,7].

9


Nghiên cứu cho thấy, dịch chiết nước của thân rễ Hoàng liên có tác
dụng ức chế Helicobacter pylori (H.pylori), ngăn ngừa và phòng tránh các
bệnh liên quan đến loét dạ dày- tá tràng; có so sánh với berberin và dịch chiết
Hoàng bá (Cortex Phellodendri). Tác dụng ức chế enzym urease tiết ra bởi

Dịch chiết ethanol hoa cây Hoàng liên cho thấy khả năng làm tăng
lượng superoxid dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathion (GSH)
trong tế bào giúp trung hòa các gốc tự do có tác dụng chống oxy hóa mạnh cả
in vitro và in vivo [46].

10


Jatrorrhizin chứng tỏ khả năng chống oxy hóa do độc tính của hydrogen
peroxid gây ra ở tế bào não chuột thí nghiệm [39].


Tác dụng trên tim, hạ huyết áp

Tiêm dưới da dịch chiết nước của Hoàng liên hoặc berberin trên súc vật
thí nghiệm có tác dụng làm hạ huyết áp nhất thời; chế phẩm điều chế từ
Hoàng liên đã loại bỏ berberin cũng có tác dụng làm hạ huyết áp trên chuột
cống trắng [1].
Thành phần palmatin và coptisin trong dịch chiết Hoàng liên có tác
dụng bảo vệ và giảm tổn thương tế bào cơ tim thông qua việc làm bền vững ty
thể màng, giảm kích thước vùng bị nhồi máu, giải phóng malondialdehyd
(MDA), tăng superoxid dismutase (SOD) [28,49,52].


Tác dụng phòng xơ vữa động mạch, giảm béo phì

Trên thỏ thí nghiệm được nuôi bằng chế độ ăn uống có lượng
cholesterol cao, dịch chiết nước Hoàng liên dùng bằng đường uống có tác
dụng làm cho tỷ lệ cholesterol toàn phần/lipid trở về giá trị bình thường
[4,9,24].

tranh với giá trị IC50 là 126 µM. Trong khi palmatin không có khả năng ức
chế mặc dù nồng độ dùng là 200 µM [31,39].
Dịch chiết Hoàng liên cho thấy khả năng tăng tiết và tăng hoạt tính của
enzym tyrosin hydroxylase kích thích nơ-ron thần kinh trong mô hình in vitro
và in vivo ở bệnh Parkinson gây ra bởi MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6tetrahydropyridin)[41].
Trong mô hình gây stress oxy hóa tế bào thần kinh bằng tertbutylhydroperoxid (t-BOOH), dịch chiết nước Hoàng liên nồng độ 100 µg/ml
cho thấy khả năng tăng sự sống sót của tế bào, giảm tỷ lệ tế bào tự chết theo
chương trình (apoptosis) và tăng hoạt lực của ty thể trêng màng; tác dụng bảo
vệ tế bào thần kinh [40].
Hiện nay có một số nghiên cứu mới chứng minh tác dụng ức chế enzym
Acetylcholinesterase của dịch chiết toàn phần Hoàng liên in vitro cải thiện
tình trạng suy giảm trí nhớ và tiến tới điều trị bệnh Alzheimer [17,26].


Tác dụng chống ung thư

Hoạt chất berberin phân lập từ chiết xuất Hoàng liên cho thấy tác dụng
chống ung thư trên đích tác dụng ephrin-B2, ức chế tế bào khối u ZR-75-30
phát triển và dự di căn của chúng [43]. Trong nghiên cứu trên tế bào ung thư
tuyến tiền liệt in vitro, berberin cho thấy tác dụng ức chế sự ra tăng tế bào ưng
thư thông qua khả năng kích thích quá trình tế bào tự chết theo chương trình
apoptosis hoặc ngừng chu trình tế bào bằng cách ức chế tín hiệu của yếu tố
tăng trưởng biểu bì EGFR (epidermal growth factor receptor) [50].
Trong thành phần dịch chiết Hoàng liên chứa jatrorrhizin hydrochlorid
có tác dụng chống u ác tính trên da do có khả năng ức chế tăng sinh tân mạch
máu ở tế bào u ác tính di căn ở tế bào người C8161 in vitro [35].


Độc tính


xem là có liên quan đến sự tiến triển của bệnh viêm dây thần kinh và quá trình
sản sinh sợi amyloid, những đặc điểm điển hình được thấy trong tế bào não
của bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer [33].
1.2.1.2. Enzym Acetylcholinesterase
AChE, với vai trò thủy phân ACh, là một protêin có hình elip chứa một
rãnh sâu, được gọi là hẻm. Quá trình thủy phân ACh được xúc tác bởi AChE
diễn ra ở đáy của hẻm enzym theo cơ chế khá phức tạp. Ở đáy của hẻm, nơi
xảy ra sự thủy phân cơ chất ACh, có 4 vị trí hoạt động chính là vị trí este hóa,

13


vị trí oxy-anion, vị trí anion và túi acyl [27]. Những vị trí hoạt động này của
AChE được minh họa ở hình 1.3.

Hình 1.3. Các vị trí hoạt động của enzym AChE
AChE là một trong những enzym thủy phân nhanh nhất. Hoạt tính của
nó mạnh gấp khoảng 10 lần so với serin protease hoặc butyrylcholinesterase
(enzym thủy phân ACh chủ yếu ở tế bào thần kinh đệm) ở cùng điều kiện
nhiệt độ và pH [23].
1.2.1.3. Giả thuyết về vai trò hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer
AChE chủ yếu có mặt trong hệ thần kinh trung ương, xúc tác thủy phân
chất dẫn truyền ACh. Quá trình này cần thiết để chuyển tế bào thần kinh hệ
cholinergic từ trạng thái hoạt động sang tình trạng nghỉ [8,27]. Ở bệnh nhân
Alzheimer thấy có sự giảm trầm trọng nồng độ chất dẫn truyền thần kinh
ACh. Tình trạng này gây suy giảm khả năng nhận thức đối với người bệnh.
Giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic trong bệnh Alzheimer được đưa ra lần
đầu tiên vào năm 1982 bởi tác giả Whitehouse và cộng sự. Sau đó, giả thuyết
này nhanh chóng trở thành động lực cho quá trình nghiên cứu theo hướng cải
thiện chức năng hệ cholinergic trên bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer. Theo giả


Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzym
cholinesterase dựa vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm
1961[18,33]. Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ
xúc tác của cholinesterase tạo thiocholin. Thiocholin phản ứng với thuốc thử
DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic acid màu vàng. Hợp chất
này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 412
nm.
Sau đó, nhiều nghiên cứu sàng lọc về tác dụng ức chế AChE in vitro
khác tiếp tục được thực hiện. Tuy nhiên, so với phương pháp gốc được công
bố bởi Ellman, phương pháp được triển khai trong các nghiên cứu sau đó đều
có một số thay đổi về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, loại đệm sử dụng,

15


nồng độ dung dịch cơ chất và thuốc thử… cũng như tỷ lệ phối hợp của chúng
vào hỗn hợp phản ứng.


Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Trên cơ sở phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman, phương
pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) đã được phát triển. Ở phương pháp này, sau khi
bản mỏng được triển khai, hỗn hợp gồm dung dịch thuốc thử DTNB và cơ
chất ATCI được phun lên bản mỏng, sau đó mới phun dung dịch enzym.
Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền
vàng [10].
Một trong những hạn chế của phương pháp TLC là có thể gặp phải hiện
tượng dương tính giả, hiện tượng vết màu trắng xuất hiện trên bản mỏng

Giovanni S. [15]. Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu của tác giả
này có một số thay đổi so với phương pháp của tác giả Van Asperen về: nguồn
gốc và hoạt độ của enzym, hóa chất để bất hoạt enzym và nồng độ dung dịch
cơ chất.


Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Muối Fast Blue B cũng được sử dụng như một thuốc thử trong phương
pháp TLC để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro và được phát
triển bởi Marston năm 2002. Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng được
triển khai, dung dịch enzym được phun lên bản mỏng. Sau đó, hỗn hợp gồm
dung dịch cơ chất α-naphthyl acetat và dung dịch thuốc thử muối Fast Blue B
được phun lên bản mỏng. Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các
vết màu trắng trên nền màu tím sẫm [15].
Cũng giống phương pháp BTLC sử dụng thuốc thử Ellman, phương
pháp TLC sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B cũng có thể gặp phải hiện
tượng dương tính giả. Để loại trừ các vết dương tính giả, một bản mỏng đối
chiếu tương tự với bản mỏng thử được triển khai. Sau đó, các dung dịch αnaphthol và muối Fast Blue B được phun lên bản mỏng mà không có dung
dịch enzym. Nếu xuất hiện vết màu trắng thì vết đó là vết dương tính giả.
Bên cạnh 2 phương pháp được trình bày ở trên, phương pháp điện di
mao quản cũng đã được sử dụng để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế
AChE in vitro trong nghiên cứu của Tang Z. M. (2007) [38]. Tuy nhiên, mới
chỉ có rất ít nghiên cứu sử dụng phương pháp này được công bố. Lý do là bởi
phương pháp này đòi hỏi phải có trang thiết bị phù hợp với thao tác thử
nghiệm tương đối phức tạp. Ngoài ra, hạn chế về số lượng mẫu thử được đánh
giá ở mỗi lần thao tác máy cũng góp phần cản trở việc ứng dụng phương pháp
điện di mao quản trong nghiên cứu sàng lọc.
Như vậy, Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) có chứa một
lượng cao các alkaloid đặc biệt là berberin cho thấy tác dụng khả quan trên