BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

HOÀNG HẢI YẾN

GIÁ TRỊ CỦA PHƯƠNG PHÁP
GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI
PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THAI
BẰNG DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ

TIỂU LUẬN TỔNG QUAN

HÀ NỘI - 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

HOÀNG HẢI YẾN

GIÁ TRỊ CỦA PHƯƠNG PHÁP
GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI
PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THAI
BẰNG DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ
Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Huy Thịnh
Cho đề tài:
Nghiên cứu giá trị của phương pháp giải trình tự gen

: Crown–rump length

DNA

: Deoxyribonucleic acid

DS

: Down Syndrome

HCG

: Human chorionic gonodotropin

KS

: Klinefelter Syndrome

MPS

: Massively parallel sequencing

NGS

: Next Generation Sequencing

NIPS

: Noninvasive prenatal screening


1.1. Khái niệm:............................................................................................3
1.2. Các bất thường NST thường gặp.........................................................3
1.3. Các loại lệch bội NST thường gặp trong sàng lọc trước sinh..............5
1.3.1. Hội chứng Down............................................................................6
1.3.2. Hội chứng Patau ............................................................................8
1.3.3. Hội chứng Edwards........................................................................9
1.3.4. Hội chứng Turner ........................................................................11
1.3.5. Hội chứng Klinefelter..................................................................12
1.3.6. Hội chứng Jacobs.........................................................................14
1.3.7. Hội chứng trisomy X ..................................................................15
2. Các phương pháp sàng lọc trước sinh truyền thống lệch bội NST..........16
2.1. Sàng lọc trước sinh lệch bội NST......................................................16
2.2. Các phương pháp sàng lọc trước sinh truyền thống...........................16
2.2.1. Tính toán nguy cơ cho bệnh nhân................................................16
2.2.2. Tuổi mẹ và tuổi thai.....................................................................17
2.2.3. Ảnh hưởng của lần có thai trước đó.............................................20
2.2.4. Siêu âm hình thái.........................................................................20
2.2.5. Sàng lọc trước sinh bằng xét nghiệm hóa sinh............................21
2.3. Các phương pháp chẩn đoán trước sinh phát hiện bất thường NST......28
2.3.1. NST đồ - Karyotype.....................................................................28
2.3.2. Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang.........................................29
2.3.3. Kỹ thuật MLPA............................................................................29
2.3.4. Kỹ thuật CGH..............................................................................29
2.3.5. Kỹ thuật Array CGH....................................................................29
2.3.6. Kỹ thuật QF-PCR.........................................................................29


2.3.7. Kỹ thuật Prenatal-BoBs...............................................................30
3. Giải trình tự thế hệ mới............................................................................30
3.1. Các công nghệ giải trình tự NGS hiện nay........................................32

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Tỷ lệ lệch bội NST thường gặp .........................................................6
Bảng 2: Mô tả mối liên quan nguy cơ trisomy theo tuổi mẹ.........................17
Bảng 3: Ước tính nguy cơ trisomy 21 (1/số đưa ra trong bảng) trong mối liên
quan giữa tuổi mẹ và tuổi thai..........................................................18
Bảng 4: Ước tính nguy cơ trisomy 18, 13 (1/số đưa ra trong bảng) trong mối
liên quan giữa tuổi mẹ và tuổi thai...................................................19
Bảng 5. Các marker được sử dụng trong sàng lọc huyết thanh mẹ...............24
Bảng 6: Tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giả trong sàng lọc trước sinh
trisomy 21 .......................................................................................26
Bảng 7: Tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giả của sàng lọc trước sinh
trisomy 21 .......................................................................................27
Bảng 8: Tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giả lệch bội NST thai sử dụng
cffDNA ............................................................................................53


DANH MỤC HÌNH
Hình 1:

Karyotype của một người nam bình thường (nhuộm băng G).........4

Hình 2:

Tỉ lệ bất thường các NST được chẩn đoán khi trẻ
Hình 16: Sơ đồ tổng quát các bước giải trình tự cffDNA bằng NGS............37
Hình 17: DNA thai tự do trong huyết tương mẹ............................................40
Hình 18. Các phương pháp tiếp cận để xác định tỷ lệ cffDNA.....................43
Hình 19: Hai phương pháp sàng lọc lệch bội NST sử dụng cffDNA............49


1

MỞ ĐẦU
Dị tật bẩm sinh và rối loạn di truyền chiếm khoảng 3 – 5% trong tổng số
phụ nữ mang thai trên toàn thế giới [1]. Bất thường nhiễm sắc thể (NST)
chiếm tỷ lệ 1:150 trẻ sinh sống [2], là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong và
bệnh tật cho trẻ sơ sinh [3]. Chiếm khoảng 85% của những bất thường này là
do lệch bội NST 21, 18, 13 và NST giới tính gây ra hội chứng Down,
Edwards, Patau, Turner...., còn lại là một số bất thường về cấu trúc và vi mất
đoạn NST hiếm gặp khác [4].
Cho đến nay, trên thế giới vẫn chưa có biện pháp nào phòng ngừa tình
trạng thai mắc các hội chứng do bất thường NST. Chính vì vậy, việc phát hiện
sớm bất thường NST bằng sàng lọc, chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền
là việc làm hết sức cần thiết nhằm giảm tỷ lệ sinh con bất thường NST. Các
phương pháp sàng lọc trước sinh không xâm lấn cho bất thường lệch bội NST
bao gồm siêu âm hình thái và phân tích huyết thanh từ máu mẹ trong thai kỳ 1
và thai kỳ 2. Tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện lệch bội dao động từ 30-94% tùy thuộc
vào phương pháp sàng lọc được sử dụng [5]. Để chẩn đoán xác định thì các
thai phụ có nguy cơ cao sẽ được thực hiện các thủ thuật xâm lấn như sinh thiết
gai rau hoặc chọc hút dịch ối để khảo sát số lượng NST bằng các kỹ thuật
Karyotype, QF-PCR, FISH, MLPA và Prenatal BoBs. Các thủ thuật xâm lấn
này có thể gây mất thai với tỷ lệ là 0.11% đối với thủ thuật chọc hút dịch ối và
0.22% đối với sinh thiết rau thai [6]. Do đó, rất cần có những phương pháp
sàng lọc với tỷ lệ dương tính giả thấp đồng thời tỷ lệ phát hiện cao hơn, thai

NST là thành phần nằm bên trong tế bào có thể quan sát được ở kỳ giữa
của hoạt động nguyên phân, trong cấu trúc của NST chứa DNA, trên DNA
mang các gen quy định các đặc điểm cấu tạo của cơ thể.
Ở người bình thường, mỗi tế bào lưỡng bội (2n) mang 46 NST chia
thành 23 cặp giống nhau gọi là cặp NST tương đồng với mỗi cặp có 1 NST
nhận từ bố và 1 NST nhận từ mẹ, trong đó gồm 22 cặp NST thường có mặt ở
cả người nam và người nữ, 1 cặp NST giới tính khác nhau ở hai giới, ở người
nam cặp NST giới tính gồm 2 chiếc khác nhau ký hiệu là XY và ở người nữ
gồm 2 chiếc giống nhau được ký hiệu là XX.
Tinh trùng và trứng được hình thành qua quá trình giảm phân có bộ
NST đơn bội (n) với 23 NST trong đó mỗi cặp NST tương đồng chỉ còn lại 1
trong 2.
Các bất thường về số lượng hoặc cấu trúc của NST thường gây ra
những hậu quả nghiêm trọng như sảy thai, dị tật bẩm sinh, ung thư…
1.2. Các bất thường NST thường gặp
Các NST có thể bị bất thường về số lượng hoặc cấu trúc. Các biến đổi
này có thể thấy ngay khi sinh hoặc sau này do mắc phải trong quá trình ác
tính hoá của các tế bào u và là kết quả của các biến cố xảy ra trong phân bào
giảm nhiễm hoặc trong phân bào nguyên nhiễm. Sự bất thường này có thể xảy
ra ở một hay trên nhiều NST. Các bất thường được gọi là đồng nhất khi tất cả
các tế bào quan sát đều mang nó, và gọi là bất thường khảm khi chỉ một số tế
bào có bất thường này.


4
Các thuật ngữ mô tả bất thường NST:
- Karyotype (NST đồ): 46 NST trong bộ NST của người ở kỳ giữa của
nguyên phân (giai đoạn NST co ngắn lại tối đa) được chụp ảnh và sắp xếp lại.
Căn cứ theo kích thước các băng hiện trên NST, 22 cặp NST thường được sắp
theo thứ tự từ lớn tới nhỏ và đánh số từ 1đến 22. Cặp NST giới tính được sắp

trường hợp chuyển đoạn giữa NST số 22 và số 9 gây bệnh bạch cầu thể tủy mạn
tính (CML: chronic myelogenous leukemia), một dạng ung thư máu.
1.3. Các loại lệch bội NST thường gặp trong sàng lọc trước sinh
Các bất thường NST là nguyên nhân của 50% các trường hợp sảy thai
tự nhiên trong 3 tháng đầu thai kỳ và là nguyên nhân của 7% tử vong sơ sinh
và khoảng 0,6% trẻ lúc sinh phát hiện có bất thường NST. Tuy nhiên, chiếm
đến 85% các trường hợp bất thường về NST là lệch bội NST 21, 18, 13, X và
Y gây ra hội chứng Down, Edwards, Patau, Turner, Klinefelter…. Ngoài ra
còn có thể gặp một số hội chứng mất đoạn nhỏ NST như hội chứng Digeorge,
Cri du Chat, Prader-Willi/ Angelman, Williams- Beuren, 1p36... [4].
Trong một nghiên cứu phân tích tỷ lệ bất thường NST tại Châu Âu trên
10.323 thai phụ từ năm 2000-2006 cho thấy: Hội chứng Down chiếm tỷ lệ cao
nhất là 53%, tiếp đến là hội chứng Edwards là 13%, hội chứng Patau chiếm
5%, hội chứng Turner 8%, bất thường NST giới tính XXX, XXY, XYY chiếm
4%, còn lại là các bất thường hiếm gặp khác (Hình 2) [4].


6

13.00%
Trisomy 21

5.00%
4.00%

Trisomy 18

8.00%

53.00%

1:1000 trẻ trai
1:1000 trẻ trai

1.3.1. Hội chứng Down (Down Syndrome – DS)
Hội chứng Down là một bất thường chủ yếu gây ra do thừa 1 NST số 21
trong bộ NST, người bệnh có tới 47 NST do có 3 NST 21 (còn gọi là thể tam
nhiễm 21, trisomy 21) [15]. Sự bất thường này gây ra do rối loạn hoạt động
phân ly của cặp NST 21 trong quá trình phân chia tế bào (hình 4) [16]. Tuy
nhiên, cũng có một tỷ lệ nhỏ người mắc DS do đột biến cấu trúc liên quan đến
NST 21 [17] hoặc thể khảm (là cơ thể có mặt hai dòng tế bào khác nhau, ví dụ


7
cơ thể vừa có dòng tế bào bình thường 46 NST và dòng tế bào bất thường 47
NST do có 3 NST 21) [18].
DS là hội chứng hay gặp nhất với tần suất 1/700-1/800 trẻ sinh sống
[19], với tỷ lệ nam: nữ là 1,2-1,5:1. Tần suất sinh con mắc DS tăng theo tuổi
mẹ: nguy cơ 1/2000 khi mẹ 20 tuổi và tăng lên 1/100 khi mẹ ở tuổi 40 [20].
Bệnh được Seguin lần đầu mô tả năm 1846 với những đặc điểm hình thái với
tên bệnh “Furfurraceous Idiocy”. Đến năm 1866, John Langdon Down mô tả
một số bệnh nhân chậm phát triển tâm thần với những dấu hiệu hình thái đặc
trưng vào năm 1959, Leujeune và Turpin chứng minh được là do bộ NST có
47 NST, thêm 1 NST 21 [21],[22].

Hình 3: Trẻ có biểu hiện mặt DS và bàn tay rãnh khỉ

Hình 4: Karyotype 47,XY,+21

Trẻ mắc DS có khuôn mặt khá điển hình với mắt xếch, có nếp quạt ở góc
trong của mắt, gáy phẳng, cổ ngắn, tai nhỏ, lưỡi dày và thè ra, 50% trẻ này có

thai trisomy 13 bị sảy ngẫu nhiên trong thai kỳ. Hội chứng này được thấy ở nữ
nhiều hơn so với nam, tuy nhiên sự chênh lệch này không nhiều.

Hình 5: Trẻ mắc trisomy 13

Hình 6: Karyotype 47,XX,+13


9
Các trẻ mắc hội chứng Patau có nhiều biểu hiện dị dạng trên vùng mặt,
tật khe hở môi hoặc hàm, các khe hở thường ở cả 2 phía (hình 5), mắt nhỏ,
thừa ngón sau trục (thừa ngón út). 90% có dị tật tim ngoài ra còn có thể có
những dị dạng khác như thận đa nang, thận ứ nước, tử cung hai sừng.
Do có quá nhiều dị tật nặng nề, nên cơ hội sống của trẻ trisomy 13 rất
thấp, thời gian sống sót trung bình là 7 ngày, 90% bệnh nhân chết trong
năm đầu sau sinh, trong đó 40% là chết chu sinh.
Những trẻ sống sót đều chậm phát triển tâm thần nặng, thường động
kinh, kém phát triển thể chất. Chỉ có một trường hợp duy nhất sống đến 33
tuổi được thông báo. Trong số những trẻ còn sống sau sinh được nghiên cứu,
thời gian trung bình phải điều trị trong khoa hồi sức cấp cứu là 10,8 ngày;
dùng máy thở là 13,3 ngày, 23% phải phẫu thuật trong giai đoạn sơ sinh.
1.3.3. Hội chứng Edwards [26],[27],[30],[31]
Hội chứng Edwards là một bất thường NST chủ yếu gây ra do thừa 1
NST số 18 trong bộ NST, người bệnh sẽ có tới 47 NST do có 3 NST 18 (còn
gọi là thể tam nhiễm 18, trisomy 18) (hình 8).
Lần đầu tiên được một nhóm các nhà di truyền học người Anh đứng đầu
là Edwards mô tả đầy đủ năm 1960. Hội chứng Edwards là loại bất thường số
lượng NST được gặp phổ biến vào hàng thứ hai sau DS với tần số mắc bệnh
trên tổng số trẻ sinh sống khoảng 1/5000


Ford xác định bộ NST của những bệnh nhân này là 45,X. Nguồn gốc NST X


11
trong hội chứng Turner 45,X. Theo một nghiên cứu thì 75% NST X có nguồn
gốc là từ mẹ. Tần số xuất hiện hội chứng này là 1/5000 trong số trẻ gái sinh
sống. Khoảng 97% trường hợp thai mắc TS đã bị sảy thai ngẫu nhiên và ước
tính có khoảng 15% trường hợp sảy thai ngẫu nhiên liên quan đến hội chứng
này, chỉ một số nhỏ sống đến khi sinh.

Hình 9: Trẻ mắc hội chứng
Turner và karyotype 45,X

Hình 10: Trẻ mắc TS biểu hiện
cổ màng

Bất thường NST ở những người mắc hội chứng Turner khá đa dạng, chỉ
có khoảng 50% bệnh nhân có bộ NST với 1 NST X. Khoảng 50% ở dạng
khảm hoặc là 46,XX/45,X hoặc 1 NST X bình thường và 1 NST X bất thường
hình nhẫn hoặc NST đều nhánh dài của X, một số trường hợp khảm dưới
dạng 45,X/46,XY. Sự đa dạng này giải thích sự khác biệt rất lớn trong biểu
hiện kiểu hình của những người mắc hội chứng này.

Hầu hết các thai nhi mắc TS đều bị phù nghiêm trọng từ trong tử cung
gây tình trạng phù thai, biểu hiện này có thể được phát hiện ở thai kỳ 2 bằng
siêu âm. Sau sinh trẻ mắc TS có thể quan sát thấy tình trạng phù ở bàn tay,
bàn chân và vùng cổ với biểu hiện cổ màng (hình 10), đây cũng là các dấu
hiệu gợi ý chẩn đoán TS ở trẻ sơ sinh.
Ở tuổi thiếu niên, lùn là biểu hiện nổi bật. Ở tuổi trưởng thành nếu không
được điều trị người nữ mắc TS có biểu hiện điển hình với lỗ tai thấp, cổ rộng


13

Hình 11: Hội chứng Klinefelter và Karyotype 47,XXY
Trẻ sơ sinh mắc KS có biểu hiện như trẻ bình thường, do đó rất khó để
chẩn đoán trong giai đoạn này cũng như giai đoạn trước dậy thì. Người nam
mắc hội chứng này có xu hướng cao trên trung bình, tay và chân tay dài
không cân đối với cơ thể (hình 11).
Ở giai đoạn dậy thì: trong nhiều trường hợp người cao, chân tay dài,
nhưng cũng có trường hợp hình thái nam bình thường. Một triệu chứng
thường thấy là tinh hoàn không phát triển, mào tinh hoàn nhiều khi lớn hơn
tinh hoàn, khoảng 35-50% trường hợp có vú to (hình 11) và tăng nguy cơ bị
ung thư vú. Giới tính nam kém phát triển, không râu, ít lông mu, dương vật
bé, tình dục giảm. Tăng bài tiết FSH, bài tiết 17-cetosteroid bình thường hoặc
giảm. Bởi vậy, chẩn đoán hội chứng này thường ở giai đoạn dậy thì và trưởng
thành. Theo Simpson, hội chứng Klinefelter thường là vô sinh do vô tinh và
thiểu tinh nặng [36]. Tuy nhiên Krausz và Forti (2000) thấy ở một số ít bệnh
nhân Klinefelter thể khảm tinh hoàn vẫn có thể sinh tinh nên vẫn có khả năng
sinh sản nhưng thường là thiểu tinh nặng.
Mặc dù người nam mắc KS thường không bị chậm phát triển trí tuệ
nhưng cũng có thể có biểu hiện nhẹ khó khăn trong học tập.
1.3.6. Hội chứng Jacobs (47,XYY)
Hội chứng 47,XYY (Hội chứng Jacobs) được Evans và cộng sự phát
hiện năm 1977 khi phân tích định loại NST ở các bé trai sơ sinh. Tần số người


14
47,XYY trong quần thể là 1/1000 nam giới [38].
Trong số nam giới có karyotype 47,XYY (hình 12), một số có khả năng
sinh sản, tỷ lệ bệnh này nhiều hơn trong quần thể vô sinh nam. Có trường hợp

kinh nguyệt, mãn kinh sớm, tỷ lệ mắc bệnh tâm thần phân liệt cao. Những phụ
nữ trisomy X vẫn có khả năng sinh đẻ bình thường song nguy cơ bất thường
NST ở con cái cao hơn những người khác.
Các bất thường NST trên thường không thể điều trị khỏi, chính là gánh
nặng cho gia đình và xã hội. Biện pháp phòng ngừa tích cực nhất là sàng lọc
dựa trên tuổi mẹ, siêu âm, các marker sinh hóa… và chẩn đoán trước sinh
bằng các xét nghiệm di truyền.


16

Hình 13: Karyotype 47,XXX
2. Các phương pháp sàng lọc trước sinh truyền thống lệch bội NST
2.1. Sàng lọc trước sinh lệch bội NST
- Lệch bội NST là nguyên nhân chính gây tử vong chu sinh và tàn tật ở
trẻ em. Do đó, việc sàng lọc và chẩn đoán trước sinh phát hiện sớm các
bất thường này là việc làm hết sức cần thiết nhằm giảm tỷ lệ sinh con
bất thường NST.
- Sàng lọc trước sinh lệch bội NST là việc sử dụng các kỹ thuật trong
thời gian mang thai để phát hiện nguy cơ dị tật bẩm sinh.
2.2. Các phương pháp sàng lọc trước sinh truyền thống
Các phương pháp sàng lọc truyền thống nguy cơ cao bất thường NST là
sàng lọc dựa vào tuổi mẹ, siêu âm, xét nghiệm huyết thanh mẹ thai kỳ 1 và 2
như double test và triple test….
2.2.1. Tính toán nguy cơ cho bệnh nhân
Mỗi thai phụ đều có nguy cơ thai nhi bị bất thường NST. Trách nhiệm của
các nhà lâm sàng là đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến nguy cơ của thai bằng
cách sử dụng các phương pháp chính xác nhất giúp cho gia đình thai phụ đưa ra
quyết định đúng đắn trước khi thực hiện các xét nghiệm xâm lấn. Để tính toán
nguy cơ cho thai phụ, cần phải tính nguy cơ mắc bệnh (phụ thuộc vào tuổi mẹ và

45-49

Trisomy 21
1:1600
1:1400
1:1100
1:700
1:240
1:70
1:20

Trisomy 18
1:17000
1:14000
1:11000
1:7100
1:2400
1:700
1:650

Trisomy 13
1:33000
1:25000
1:20000
1:14000
1:4800
1:1600
1:1500

Bảng 3: Ước tính nguy cơ trisomy 21 (1/số đưa ra trong bảng) trong mối

24
827
969
1081
1406
25
795
933
1040
1352
26
756
887
989
1286
27
710
832
928
1206
28
655
768
856
1113
29
593
695
776
1008

36
165
193
216
280
37
128
150
168
218
38
98
115
129
167
39
75
88
98
128
40
57
67
74
97
41
43
50
56
73