1

MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài
PCV2 liên quan đến một số bệnh trên heo, gọi chung là các bệnh do circovirus trên
heo (Procine circovirus diseases - PCVDs) (Segalés và ctv, 2012). Trong đó, đáng lưu ý
nhất là hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa (postweaning multisystemic wasting
syndrome - PMWS) làm gia tăng tỉ lệ heo chết và loại thải, tăng tiêu tốn thức ăn và giảm
tăng trọng, vì thế gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi heo.
Các ca nghi ngờ PMWS trên heo được báo cáo đầu tiên ở Việt Nam vào cuối năm 2004
có liên quan đến việc gia tăng tình trạng còi cọc trên các đàn heo sau cai sữa (Lâm Thị
Thu Hương và ctv, 2005). Sự đa dạng di truyền của PCV2 không chỉ là mối quan tâm
về mặt dịch tễ, mà cả về hiệu quả bảo hộ của vắc-xin phòng bệnh do PCV2. Các nghiên
cứu về trình tự gen cho thấy, PCV2 lưu hành ở hầu khắp các tỉnh thành Việt Nam được
xếp vào genotype 2b, 2d và nhóm tái tổ hợp (Nguyễn Ngọc Hải và ctv, 2013; Huỳnh Thị
Mỹ Lệ và ctv, 2012; 2013; Phạm Hồng Quân và ctv, 2017). Tiêm vắc-xin PCV2 được
áp dụng rộng rãi ở Việt Nam, giúp cải thiện tăng trọng bình quân hàng ngày, giảm tỉ lệ
chết và loại thải, giảm lượng vi-rút bài thải cũng như giảm bệnh tích vi thể ở các mô
bạch huyết. Tuy nhiên, tất cả các loại vắc-xin này đều dựa trên genotype PCV2a, trong
khi đó PCV2 lưu hành ở Việt Nam chủ yếu thuộc genotype PCV2b, PCV2d và nhóm tái
tổ hợp. Takahagi và ctv (2010) cho rằng, genotype của PCV2 có thể ảnh hưởng đến hiệu
quả phòng PMWS bằng vắc-xin. Do đó, việc nghiên cứu chế tạo vắc-xin từ chủng
PCV2b, genotype lưu hành phổ biến ở Việt Nam là cần thiết, nhằm giúp chủ động nguồn
cung vắc-xin, góp phần hiệu quả trong phòng bệnh PMWS cũng như giảm giá thành
chăn nuôi. Để cùng giải quyết các vấn đề thực tiễn trên, đề tài: “Phân tích trình tự ORF2
của PCV2 từ heo nuôi ở một số tỉnh phía Nam và nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh
liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa” được tiến hành.
Mục tiêu của luận án
- Xác định genotype và đánh giá sự tương đồng di truyền của PCV2 lưu hành tại
một số tỉnh thành ở Việt Nam.
- Nghiên cứu chế tạo vắc-xin phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa.

(Sigma, Mỹ), sodium thiosulfate (Merck, Đức). Heo con 3 tuần tuổi từ một số trại heo
thương phẩm đã được kiểm tra âm tính với kháng nguyên PCV2, CSFV, PRRSV và
Mycoplasma hyopneumoniae (kiểm tra bằng phương pháp PCR, RT-PCR).
2.3 Nội dung nghiên cứu
(1) Khảo sát đa dạng di truyền của PCV2 tại một số tỉnh thành miền Nam Việt Nam.
(2) Khảo sát đặc tính sinh học của các chủng PCV2 phân lập. (3) Nghiên cứu chế tạo
vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu. (4) Khảo sát tính an toàn và hiệu lực của vắc-xin PCV2
vô hoạt nhũ dầu trong điều kiện phòng thí nghiệm.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phân tích di truyền của PCV2 tại một số tỉnh thành miền Nam Việt Nam
Tổng cộng 48 mẫu bệnh phẩm heo dương tính ADN-PCV2 được thu thập từ năm
2007-2016 từ 44 trại heo ở 13 tỉnh thành phía Nam Việt Nam. Mẫu bệnh phẩm được
bảo quản ở -700C. Xác định mẫu dương tính ADN-PCV2 bằng phương pháp PCR được
thực hiện tại NAVETCO. Gởi sản phẩm PCR để giải trình tự đoạn gen ORF2 PCV2
tại 1st BASE – Malaysia. Trình tự chuỗi nucleotide gen ORF2 của các chủng vi-rút thực
địa và các chủng vi-rút tham khảo được sắp xếp vào cột và so sánh tương đồng bằng
phần mềm BioEdit 7.2.5 (2013). Sử dụng phần mềm MEGA 5.2.2 (2012) theo phương
pháp Neighbor-joining (NJ) với bootstrap 1000 lần lặp lại để thiết lập cây phát sinh
chủng loại. Sử dụng phần mềm RDP phiên bản 4.39 (2015) và SimPlot phiên bản 3.5.1
(2003) để phân tích sự tái tổ hợp và ước đoán vị trí tái tổ hợp (recombinant breakpoint).
2.4.2. Khảo sát đặc tính sinh học của các chủng PCV2 phân lập
2.4.2.1. Phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15A
Phân lập PCV2 từ 21 mẫu bệnh phẩm (9 mẫu hạch, 9 mẫu phổi, 2 mẫu huyết thanh
và 1 mẫu lách) từ 48 mẫu dương tính ADN-PCV2 (đã được xác định genotype) bằng
cách nuôi cấy trên tế bào dòng PK15A theo quy trình được chuyển giao kỹ thuật từ
Phòng thí nghiệm sức khỏe động vật quốc gia Úc. Mỗi mẫu được tiếp đời 3 lần. Ở lần
tiếp đời thứ 3, mẫu được xác định dương tính bằng phương pháp PCR hoặc nhuộm
IPX, sau đó được xác định hiệu giá vi-rút. Chuẩn độ hiệu giá PCV2 phân lập trên môi



thu thập ở 28 ngày sau gây nhiễm với chủng NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) (số liệu thí
nghiệm chưa công bố); chống PCV2-Re: 3 mẫu huyết thanh lưu trữ từ thí nghiệm gây nhiễm
chủng NAVET-vietnam3/2004 trên heo của tác giả Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2008).
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm phản ứng trung hòa chéo giữa 3 chủng PCV2 phân lập
Vi-rút trung hòa
Mẫu huyết thanh heo
PCV2b
PCV2d
PCV2-Re*
Kháng PCV2b
Trung hòa
Trung hòa chéo
Trung hòa chéo
Kháng PCV2d
Trung hòa chéo
Trung hòa
Trung hòa chéo
Kháng PCV2-Re (2h)*
Trung hòa chéo
Trung hòa chéo
Trung hòa
* PCV2-Re (2h): recombinant (nhóm tái tổ hợp), 2h: theo phân loại mới của Franzo và Segalés (2018)

Thực hiện phản ứng trung hòa chéo giữa 3 chủng PCV2 phân lập thuộc genotype
PCV2b, PCV2d và PCV2-Re (2h) với các mẫu huyết thanh heo chứa kháng thể chống


4

lại PCV2b, PCV2d và PCV2-Re (2h), mỗi mẫu huyết thanh được thực hiện lặp lại 2

vòng 18 giờ sau khi chuẩn bị. PCV2 được vô hoạt bằng cách ủ với các nồng độ BEI
cuối cùng khác nhau 1 mM, 3 mM và 5 mM ở nhiệt độ 370C trong vòng 24 giờ. Thể
tích dịch vi-rút ở mỗi nồng độ BEI là 200 ml. Lấy mẫu kiểm tra hiệu giá vi-rút mỗi giờ
trong 10 giờ đầu vô hoạt. BEI được trung hòa bằng 0,1 mM sodium thiosulphate trong
vòng 2 giờ ở 370C. Vi-rút sau khi vô hoạt được trữ ở -700C. Xác định vi-rút đã được
vô hoạt hoàn toàn hay chưa bằng cách ủ 1 ml dịch vi-rút sau khi vô hoạt với tế bào
PK15A, đánh giá như trong quy trình phân lập PCV2. Thí nghiệm trên được thực hiện
lặp lại 2 lần. PCV2 được xem là đã vô hoạt hoàn toàn khi kết quả phân lập dịch vi-rút
sau khi bất hoạt ở 3 lần tiếp đời đều âm tính.


5

- Xác định khả năng bất hoạt hoàn toàn PCV2 thuộc các chủng khác nhau với nồng
độ BEI 3 mM
Nhằm xác nhận khả năng vô hoạt hoàn toàn các chủng PCV2 thuộc các genotype
khác nhau của BEI ở nồng độ thích hợp. Sau khi xác định được nồng độ BEI 3 mM có
thể vô hoạt hoàn toàn PCV2 chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), tiến hành vô
hoạt đồng thời các chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), NAVET-LongAn2/2012
(PCV2d) và NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)) ở nồng độ BEI 3 mM, nhiệt độ
370C trong vòng 24 giờ. Thể tích dịch vi-rút mỗi chủng là 200ml. Lấy mẫu kiểm tra hiệu
giá vi-rút mỗi giờ trong 10 giờ đầu vô hoạt. BEI được trung hòa bằng sodium
thiosulphate 1 M với thể tích bằng 10% thể tích BEI sử dụng, trong vòng 2 giờ ở 370C.
Vi-rút sau khi vô hoạt được trữ ở -700C.
2.4.3.2. Chế tạo vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu
Chế tạo vắc-xin vô hoạt nhũ dầu chứa kháng nguyên PCV2 chủng NAVETDongNai2/2009: Vi-rút sau khi vô hoạt (đã được kiểm tra vô hoạt hoàn toàn) được phối
trộn với nhũ dầu theo công thức nhũ của Công ty NAVETCO, mỗi liều vắc-xin (2 ml)
chứa lượng kháng nguyên vi-rút lần lượt là 4,5log10 hoặc 6,0log10 TCID50/liều (hiệu giá
vi-rút trước khi vô hoạt).
2.4.3.3. Tính an toàn và hiệu lực của vắc-xin vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm

Biểu hiện lâm sàng và thân nhiệt được theo dõi hàng ngày từ thời điểm trước tiêm
vắc-xin 3 ngày đến sau tiêm vắc-xin 28 ngày và sau công cường độc 28 ngày. Cân heo
lúc 0 và 28 dpv và 28 dpc. Kháng thể chống PCV2 được kiểm tra vào lúc 0, 7, 14, 21, 28
dpv và 7, 14, 21, 28 dpc. Tình trạng vi-rút huyết, số lượng bạch cầu, tình trạng bài xuất
vi-rút qua phân và dịch tiết mũi được kiểm tra vào lúc 0, 7, 14, 21 và 28 dpc. Bệnh tích
đại thể và vi thể: lúc 28 ngày sau công độc, chọn 2 heo có khối lượng cơ thể nhỏ nhất,
biểu hiện lâm sàng bất thường ở mỗi lô mổ khảo sát bệnh tích.
2.5 Kỹ thuật xét nghiệm
Phương pháp trung hòa và PCR phát hiện ADN-PCV2 được thực hiện dựa theo quy
trình của Fort và ctv (2007). Phương pháp phân lập và chuẩn độ PCV2 trên môi trường
tế bào PK15A và phương pháp IPMA để phát hiện kháng thể kháng PCV2 được thực
hiện theo quy trình của AAHL. Sử dụng kít thương mại Ingezim CIRCO IgG (Ingenasa,
Tây Ban Nha) để phát hiện kháng thể IgG kháng PCV2. Thực hiện quy trình phản ứng
theo hướng dẫn của nhà cung cấp.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân tích di truyền của các phân lập PCV2 tại một số tỉnh thành Việt Nam
3.1.1. Phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên ORF2 của PCV2
Kết quả phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên ORF2 của 48 mẫu PCV2 thu
thập từ năm 2007 đến 2016 từ 13 tỉnh thành Việt Nam (Hình 3.1) cho thấy, các mẫu
PCV2 được xếp vào PCV2b chiếm 50,00% (24/48), PCV2d chiếm 33,33% (16/48) và
PCV2-Re (2h) chiếm 16,67% (8/48), không có mẫu PCV2 nào được xếp vào genotype
PCV2a. Theo cách phân loại mới của Franzo và Segalés (2018) một số chủng PCV2
trước đây được xếp vào nhóm tái tổ hợp nay được xếp vào genotype PCV2h. Vì thế
trong phần trình bày này các chủng PCV2 trước đây được xếp vào nhóm tái tổ hợp mà
nay theo cách phân loại mới được xếp vào PCV2h sẽ được viết tắt là PCV2-Re (2h).
Sự phân bố theo thời gian và nguồn gốc địa lý của 48 mẫu PCV2 trong nghiên cứu
này được thể hiện qua Biểu đồ 3.1 và Biểu đồ 3.2. Qua đó cho thấy sự lưu hành phổ biến
của genotype PCV2b qua các năm khảo sát, đồng thời có sự xuất hiện và ngày càng trở
nên phổ biến của genotype PCV2d, đặc biệt là PCV2d-2. Có sự lưu hành cùng lúc nhiều
genotype trên cùng địa phương. Các nghiên cứu dịch tễ học trên toàn thế giới đã chứng

62
BinhDuong3/2009
PhuYen/2014
99
BinhDuong11/2015
NAVET-TpHCM8/2016
LamDong2/2013
NAVET-BinhDuong2/2009
JQ181591/isolate HB1-1/Vietnam/2011
PCV2b
TpHCM6/2010
AF055394/strain 48285/France
TpHCM7/2010
EU886637/isolate Aust3959/Australia/2007
DongNai6/2014
FJ598044/strain WuHan/China/2008
DongNai3/2012
BinhDuong4/2009
DongNai5/2014
TpHCM1/2010
KF871068/strain SNUVR000463/Korea
BinhDinh5/2013
AAHL-strain
DongNai4/2013
64
DongNai1/2009
BinhDuong5/2010
vietnam5/2007
LC004742/isolate ML-7/India/2013
76

HM038017/strain BDH/China/2008
JQ181600/isolate Han8/Vietnam/2011
KJ437506/strain SNUVR140004/Korea/2013
KX828231/isolate KU-1604/Korea/2016
64
96 KX828231/isolate KU-1604/Korea/2016
97 MH465453/strain GXLZ1208a/China/2012
MH465473/strain GXYL1208/China/2012
CanTho/2008
JX099781/isolate P477LG/Vietnam/2009
vietnam2/2006
HQ395058/strain 10QH/China/2010
99
KJ729072/isolate PCV2Izn-89-13/India/2013
KM042398/strain 549-QNa/Vietnam/2009
TpHCM4/2010
BinhDinh4/2013
PCV2-Re (2h)
NAVET-vietnam3/2004
BinhDinh2/2013
TpHCM2/2010
BinhDuong6/2012
BinhDinh3/2013
HM776443/isolate HUN-11/China/2009
vietnam1/2002
JQ181599/isolate Han6-13/Vietnam/2011
TpHCM5/2010
AF465211/strain SC/Taiwan/2002
89
AF055392/strain 1010 Stoon/Canada/1998


Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại của các chủng PCV2 dựa trên trình tự nucleotide ORF2 của 48
mẫu PCV2 trong nghiên cứu này, 5 phân lập PCV2 tham khảo () và 46 chủng tham khảo đăng ký trên
GenBank. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng phần mềm MEGA phiên bản 5.2.2 (2012) theo mô
hình Kimura-2 parameter, phương pháp Neighbor-joining (NJ) với bootstrap 1000 lần lặp lại.

7


8

mức độ trại cũng đã được Kwon và ctv (2017a) ghi nhận khi nghiên cứu sự đa dạng di
truyền và sự biến đổi genotype PCV2 xảy ra ở Hàn Quốc. Tuy nhiên, vấn đề này cần
được nghiên cứu thêm.
SỐ LƯỢNG
14

Biểu đồ 3.1.
Phân bố thời
gian của các
mẫu PCV2
thu thập ở
miền Nam
Việt Nam từ
năm
2007
đến 2016

12
PCV2b


1
2009

2010

2012

2013

3

2

3

1

0

5

2014

1

1

2015


0

6

1
2

7
5

2
1

1

1

3
1

1

1

1
NGUỒN GỐC

Biểu đồ 3.2. Phân bố địa lý của các mẫu PCV2 thu thập ở miền Nam Việt Nam từ năm
2007 đến 2016
3.1.2. Phân tích đa dạng di truyền của PCV2 dựa vào ORF2

N
A
89
R
L
L
90
S
T
T
131
T
T
P
134
T
N
T
151
T
T/P
T
169
S
R/G
S
190
T/A
T
S

về a-xít amin. So sánh tương đồng giữa các mẫu PCV2d-2 trong nghiên cứu này với
nhau và với một số chủng tham khảo trên thế giới cho thấy chúng tương đồng với nhau
rất cao (98,5 - 100% về nucleotide và 98,2 - 100% về a-xít a-min) và chúng tương đồng
với chủng BDH và chủng SNUVR130689, từ 99,0% - 99,8% về nucleotide và từ 99,1 100% về a-xít a-min. Mức độ tương đồng giữa các mẫu PCV2 được xếp vào genotype
PCV2-Re (2h) biến động từ 98,7% đến 100% về nucleotide và về a-xít a-min, các mẫu
PCV2 này tương đồng rất cao với phân lập HUN-11.
3.1.4. Phân tích sự tái tổ hợp
Kết quả phân tích bằng phần mềm RDP4 và SimPlot 3.5.1 cho thấy có sự tái tổ hợp
xảy ra trên 8 mẫu PCV2 thuộc genotype PCV2-Re (2h)), bao gồm các mẫu CanTho/2008,
TpHCM2/2010, TpHCM4/2010, TpHCM5/2010, BinhDuong6/2012, BinhDinh2/2013,
BinhDinh3/2013, BinhDinh4/2013, có bố mẹ giả định là chủng AY181946/strain


10

TJ/China/2002 (PCV2d) (major parent) và AF465211/strain SC/Taiwan/2002 (PCV2a)
(minor parent) với phần trăm tương đồng tương ứng là 95,7 – 96,3% và 95,1 – 96,2%.
Trong đó, 7/8 mẫu có vị trí tái tổ hợp bắt đầu ở nucleotide 96 và kết thúc ở vị trí 227 hoặc
238, riêng mẫu CanTho/2008 tuy có cùng bố mẹ nhưng vị trí tái tổ hợp khác biệt so với
các mẫu còn lại với điểm bắt đầu ở vị trí 677 và kết thúc ở vị trí 227 (vị trí trên gen ORF2).
Kết quả này cũng phù hợp với kết quả phân tích cây phát sinh chủng loại. Trong đó, mẫu
CanTho/2008 xếp trong nhóm PCV2-Re (2h) nhưng lại nằm ở 1 nhánh riêng biệt so với
các mẫu còn lại trong nhóm (Hình 3.1).
3.2. Kết quả phân lập PCV2 và đặc tính nuôi cấy của một số phân lập PCV2
3.2.1. Kết quả phân lập PCV2 từ các mẫu thực địa
Phân lập PCV2 từ 21 mẫu bệnh phẩm (9 mẫu hạch, 9 mẫu phổi, 2 mẫu huyết thanh
và 1 mẫu lách) từ 48 mẫu dương tính ADN-PCV2 (đã được xác định genotype ở phần
3.1) trên tế bào dòng PK15A. Kết quả sau 3 lần tiếp đời phân lập được 18/21 (85,71%)
mẫu dương tính PCV2 (Bảng 3.5). Trong các loại mẫu bệnh phẩm dùng phân lập PCV2
thì mẫu hạch đạt tỉ lệ phân lập dương tính cao nhất 100% (9/9) với hiệu giá vi-rút ở lần

4.0
3.5

3.0
0,01

0,02

0,05

0,1

1,0

MOI

Biểu đồ 3.4. Hiệu giá vi-rút theo hệ số MOI và thời gian thu hoạch của
chủng NAVET-DongNai2/2009. a, b, c: khác biệt thống kê với P < 0,05


11

Bảng 3.5. Kết quả phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15A
ST
T

Ký hiệu mẫu

Geno
type

BinhDuong3/2009
BinhDuong4/2009
NAVET-DongNai2/2009
TpHCM6/2010
BinhDinh5/2013
BinhDinh6/2013
NAVET-TpHCM8/2016
NAVET-LongAn2/2012
BinhDinh1/2013
LamDong1/2013
NAVET-NgheAn1/2015
NAVET-NgheAn2/2015
NAVET-BenTre/2014
CanTho/2008
TpHCM4/2010
BinhDuong6/2012
BinhDinh3/2013

2b
2b
2b
2b
2b
2b
2b
2b
2b
2b
2b
2d-2

Phổi

Loại heo
Sau cai sữa
Sau cai sữa
Sau cai sữa
Sau cai sữa
Sau cai sữa
Sau cai sữa
16 tuần
Sau cai sữa
Nái
Nái
Thai
Sau cai sữa
Thai
12 tuần
Sau cai sữa
Sau cai sữa
Cai sữa
Sau cai sữa
Sau cai sữa
1 tuần tuổi
Sau cai sữa

Triệu chứng
lâm sànga

Kết quả
phân lập

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

Hiệu giáb
(P3)
log10
TCID50/ml
1,67
3,67
1,67
3,67
4,50
1,67
1,67
1,67
4,00
5,50
1,67
1,67
5,50
5,00

bào đối chứng. Tuy nhiên, khi gây nhiễm vi-rút với hệ số MOI từ 0,05 trở lên
nhận thấy có sự thay đổi hình dạng ở các tế bào bị nhiễm vi-rút: tế bào có vẻ to
hơn, co tròn, đậm màu và có nhiều tế bào chết so với tế bào đối chứng không
nhiễm. Kết quả nghiên cứu này tương tự như báo cáo của Dvorak và ctv (2013)
khi gây nhiễm PCV2 trên dòng tế bào võng mạc bào thai heo VR1BL (porcine
fetal retina cell line). Như trình bày ở trên, hiệu giá vi-rút thu được ở các mức
MOI thấp cũng thấp hơn so với các mức MOI cao. Điều này cho thấy có mối
liên hệ giữa MOI và hiệu giá vi-rút thu nhận được và biểu hiện về hình dạng của
tế bào nhiễm. Có thể ghi nhận được bệnh tích tế bào ở hệ số MOI cao ( 0,1).
3.2.4. Khả năng nhân lên của PCV2 trên môi trường tế bào PK15A
Kết quả đường cong sinh trưởng các chủng NAVET-DongNai2/2009,
NAVET-LongAn2/2012 và NAVET-vietnam3/2004 trên tế bào PK15A với hệ
số gây nhiễm MOI = 0,1 (Biểu đồ 3.5). Trung bình hiệu giá vi-rút qua các thời
điểm thu hoạch khác nhau của chủng NAVET-vietnam3/2004 cao nhất (5,20 
0,31log10 TCID50/ml), kế đến là chủng NAVET-LongAn2/2012 (4,75  0,60log10
TCID50/ml) và thấp nhất là chủng NAVET-DongNai2/2009 (4,30  0,62log10
TCID50/ml) (P < 0,01). Ngoài ra, có sự khác biệt về trung bình hiệu giá vi-rút ở
các thời điểm thu hoạch khác nhau (P < 0,01). Phân tích đường cong sinh trưởng
cho thấy, thời điểm thu hoạch để đạt hiệu giá vi-rút cao nhất khác nhau tùy theo
chủng PCV2, cụ thể, đối với chủng NAVET-vietnam3/2004 là 72 giờ, chủng
NAVET-DongNai2/2009 là 84 giờ và chủng NAVET-LongAn2/2012 là 108 giờ


13

sau nhiễm. Từ kết quả nghiên cứu này giúp chọn lựa được thời gian thu hoạch
thích hợp cho từng chủng để đạt hiệu giá vi-rút tối ưu trong chế tạo vắc-xin.
Hiệu giá
(log10 TCID50/ml)



Biểu đồ 3.5. Đường cong sinh trưởng của các chủng NAVET-DongNai2/2009,
NAVET-LongAn2/2012 và NAVET-vietnam3/2004 trên tế bào PK15A
3.2.5. Tính ổn định
Trung bình chung qua 15 lần tiếp đời hiệu giá vi-rút của chủng NAVETLongAn2/2012 cao nhất (5,59  0,43log10 TCID50/ml) kế đến là chủng
NAVET-vietnam3/2004 (5,21  0,52log10 TCID50/ml) và thấp nhất là chủng
NAVET-DongNai2/2009 (5,15  0,38log10 TCID50/ml), không có sự khác biệt
về trung bình hiệu giá giữa 3 chủng này qua 15 lần tiếp đời (P > 0,05). Điều
này cho thấy 3 chủng này phát triển ổn định trên tế bào PK15A với hiệu giá 
5,0log10 TCID50/ml.
3.3. Sự tương đồng kháng nguyên giữa các phân lập PCV2 thuộc các
genotype khác nhau
Tương đồng kháng nguyên giữa các chủng PCV2 thuộc các genotype khác
nhau cũng được đánh giá thông qua giá trị R (%) được tính theo công thức của
Archetti và Horsfall (1950). Kết quả cho thấy giữa chủng NAVETDongNai2/2009 (PCV2b) và NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)) tương
đồng hoàn toàn về kháng nguyên với hệ số R là 104,20%. Hệ số R giữa chủng
NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) và chủng NAVET-LongAn2/2012
(PCV2d); giữa NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) và NAVET-vietnam3/2004
(PCV2-Re (2h)) tương ứng là 91,60% và 91,30%. Theo Giambrone và Solano
(1988), khi đánh giá sự tương đồng kháng nguyên giữa 2 chủng vi-rút dựa vào
giá trị R thì 2 chủng được xem là tương đồng về kháng nguyên (antigen identity)
với nhau khi R > 70%. Giá trị R tính từng cặp giữa các chủng PCV2 NAVETDongNai2/2009 (PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) và NAVETvietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)) đều > 70%. Kết quả trên cho thấy, cả 3 chủng


14

này tuy khác nhau về genotype nhưng tương đồng với nhau về kháng nguyên.
Ngoài ra, một số thí nghiệm tiêm vắc-xin và công cường độc cũng đã chứng
minh khả năng bảo hộ chéo giữa các genotype PCV2 (Opriessnig và ctv, 2014b,
Jeong và ctv, 2015; Huan và ctv, 2018). Tuy nhiên, cần nghiên cứu thêm về

So với kháng thể IPMA, kháng thể trung hòa có sự chuyển đổi muộn hơn. Bắt
đầu có sự chuyển đổi kháng thể trung hòa (neutralising antibody - NA) (VNT50)
từ 3,50 ± 0,55log2 ở 0dpc lên 6,6 ± 1,14log2 lúc 14 dpc và tăng lên đến 8,75 ±
0,50log2 ở 21 dpc trên nhóm heo thí nghiệm. Trong khi đó, các heo đối chứng có
kháng thể trung hòa giảm dần và âm tính lúc 21dpc (Bảng 3.13). Trên heo nhiễm
vi-rút cận lâm sàng thì kháng thể trung hòa chống PCV2 xuất hiện lúc 15 ngày
sau gây nhiễm thí nghiệm trở đi (Meerts và ctv, 2006; Fort và ctv, 2007).


15

Bảng 3.13. Diễn biến kháng thể chống PCV2 trên heo ở thí nghiệm 1
Lô

KH
heo

Chỉ tiêu

IPMA
1TN1 VNT50
OD IgG
IPMA
4TN1 VNT50
OD IgG
IPMA
5TN1 VNT50
TN1
OD IgG
(gây

KM: không mẫu

Trước khi
gây nhiễm
(10 tuần tuổi)
4,32
3
0,25
5,32
4
0,43
4,32
3
0,34
5,32
4
0,35
4,32
3
0,22
5,32
4
0,23
4,82 ± 0,55
3,50 ± 0,55
0,30 ± 0,09
10,64
9
1,17
10,64

0,87
5,32
4
0,18
6,04 ± 1,76
3,33 ± 0,52
0,30 ± 0,28
9,64
8
0,77
8,64
7
0,70
4,32
8
0,19
7,54 ± 2,83
7,67 ± 0,58
0,55 ± 0,32

7,64
6
0,28
5,32
7
0,18
8,64
5
0,36
KM

KM
KM
KM
KM
KM
KM
9,64
9
0,75
12,64
8
0,62
10,39 ± 1,50
8,75 ± 0,50
0,78 ± 0,26
8,64
2
0,74
KM
KM
KM
0
0
0,25
4,32 ± 6,11
1,00 ± 1,41
0,49 ± 0,34

Kết quả kiểm tra kháng thể IgG bằng phương pháp ELISA cho thấy có sự
gia tăng OD lúc 14 dpc ở lô thí nghiệm, với cùng chiều hướng tăng dần như

0
6,00
6,00
6,00
1
4,59
4,17
3,42
2
4,50
3,84
2,84
3
4,33
3,59
2,59
4
3,84
3,42
2,42
5
3,17
2,59
1,67
6
2,59
1,67
KPH
7
2,17



17

Kết quả kiểm tra khả năng vô hoạt vi-rút hoàn toàn: Ở nồng độ BEI 1 mM
sau 24 giờ vi-rút vẫn chưa được vô hoạt hoàn toàn, bằng chứng là sau 3 lần tiếp
đời dịch phân lập từ mẫu vi-rút thu 24 hpi ở lô có nồng độ BEI 1 mM dương tính
với ADN-PCV2 phát hiện bằng PCR và dương tính IPX khi nhuộm tế bào.
Ngược lại, ở nồng độ BEI 3 mM và 5 mM vi-rút được vô hoạt hoàn toàn.
3.5.2. Kết quả vô hoạt ba chủng PCV2 phân lập với nồng độ BEI 3 mM
Kết quả xác định, hiệu giá vi-rút giảm theo thời gian vô hoạt, với nồng độ
BEI 3 mM, ở nhiệt độ 370C, thời gian không phát hiện vi-rút nồng độ pha loãng
10-1 của hai chủng NAVET-DongNai2/2009, chủng NAVET-vietnam3/2004 là
7 hpi và 6 hpi đối với chủng NAVET-LongAn2/2012. Tốc độ bất hoạt tương
ứng với các chủng lần lượt là 0,71; 0,86 và 1,33log10 TCID50/giờ tương ứng với
các chủng NAVET-vietnam3/2004, NAVET-DongNai2/2009 và NAVETLongAn2/2012. Chủng NAVET-LongAn2/2012 có hiệu giá vi-rút trước khi vô
hoạt cao nhất, nhưng thời gian không phát hiện vi-rút nồng độ pha loãng 10-1
lại ngắn nhất, kết quả là tốc độ vô hoạt của chủng này cao nhất so với 2 chủng
còn lại. Điều này cho thấy đặc điểm đề kháng của PCV2 thay đổi tuỳ theo
chủng. Kết quả kiểm tra khả năng vi-rút bị vô hoạt hoàn toàn cho thấy ở nồng
độ BEI 3 mM, ở nhiệt độ 370C, sau 24 giờ có thể vô hoạt hoàn toàn 3 chủng
phân lập trên.
3.6. Kết quả đánh giá an toàn và hiệu lực của vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ
dầu thử nghiệm chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b)
3.6.1. Thí nghiệm 2
+ An toàn: Biểu hiện lâm sàng: Sau khi tiêm vắc-xin PCV2 thử nghiệm
(2ml/heo, chứa lượng kháng nguyên 4,5log10 TCID50/liều) 2 lần cách nhau 21
ngày, heo ở lô thí nghiệm và đối chứng (tiêm dịch chiết tế bào PK15A) đều ăn
uống bình thường. Thân nhiệt heo giao động từ 38,30C đến 40,50C. Trong đó,
heo 5TN2 sốt nhẹ (40,50C) ở thời điểm 1 ngày sau vắc-xin lần thứ nhất và 1

Sau tiêm vắc-xin lần 2 (ngày)

7

14

21

7

14

21

28

5,64
0
0,39
6,64
0
0,35
6,64
0
0,34

4,64
0
0,49
4,64

0
0,80
9,64
7
1,03

9,64
7
1,13
10,64
5
0,77
10,64
7
1,27

10,64
6
1,11
11,64
7
0,88
11,64
6
1,45

4,98 ± 0,58
0
0,43 ± 0,11


7
0,43

6,64
6
0,58
6,64
0
0.37

6,64
0
0,44
6,64
0
0,31

5,64
0
0,47
5,64
0
0,40

8,64 ± 0
8,00 ± 0
0,63 ± 0,07

8,14 ± 0,71
7,50 ± 0,71

𝐱̅ ± SD
14ĐC2

ĐC2
(đối
chứng)

15ĐC2

𝐱̅ ± SD

IPMA
VNT50
OD IgG
IPMA
VNT50
OD IgG
IPMA
VNT50
OD IgG
IPMA
VNT50
OD IgG
IPMA
VNT50
OD IgG
IPMA
VNT50
OD IgG
IPMA

9
0.62

9,64 ± 0
8,64 ± 0
9,00 ± 0
8,50 ± 0,71
0,83 ± 0,11 0,74 ± 0,17

10,31 ± 0,58 11,31 ± 0,58
6,33 ± 1,15
6,33 ±0,58
1,06 ± 0,26 1,15 ± 0,29


19

Tương tự kháng thể tổng cộng, cũng không có sự chuyển đổi kháng thể
trung hòa ở heo sau tiêm vắc-xin lần 1. Sau tiêm vắc-xin lần hai 7 ngày có
sự chuyển đổi kháng thể trung hòa ở lô tiêm vắc-xin và đạt 6,33  1,15log2
ở 21dpv (Bảng 3.17).Kết quả kiểm tra kháng thể IgG chống PCV2 cho thấy
ở lô tiêm vắc-xin bắt đầu có sự gia tăng trung bình mật độ quang (OD) ở 14
ngày sau tiêm vắc-xin (day post vaccination - dpv) lần một từ 0,33  0,10 (0
dpv) lên 0,43  0,11 (14 dpv), và tiếp tục tăng cao đến kết thúc thí nghiệm
(Bảng 3.18).
Giải thích kết quả đáp ứng kháng thể trong thí nghiệm 2 này sẽ được trình
bày chung trong thảo luận của thí nghiệm 3.
3.6.2. Thí nghiệm 3
+ An toàn: Từ 0 – 28 ngày sau tiêm vắc-xin, tất cả heo ở lô thí nghiệm
(tiêm vắc-xin PCV2 thử nghiệm, với liều 2 ml/heo, chứa lượng kháng nguyên


Bảng 3.20. Diễn biến kháng thể chống PCV2 trên heo ở thí nghiệm 3

Lô

KH
heo

1TN3

2TN3
TN3
(tiêm
vắcxin)

3TN3

4TN3

5TN3

7TN3

Chỉ
tiêu

Trước
tiêm vắcxin (4
tuần tuổi)



10,64

11,64

13,64

14,64

15,64

VNT50
OD IgG
IPMA
VNT50
OD IgG
IPMA
VNT50
OD IgG
IPMA
VNT50
OD IgG
IPMA
VNT50
OD IgG
IPMA
VNT50
OD IgG

4

0,27
6,64
4
1,09

5
0,75
964
4
1,73
9,64
4
1,51
8,64
3
0,97
9,64
4
0,50
7,64
4
1,61

6
1,07
10,64
5
1,92
9,64
6

2,03
12,64
10
2,30
13,64
8
1,93
11,64
9
1,19
13,64
9
2,08
13,64
9
2,44

9
2,07
13,64
9
2,21
13,64
10
1,80
15,64
9
1,50
15,64
11

1,87
15,64
9
1,28
15,64
12
2,03
15,64
11
2,16


21

KH
heo

Lô

TN3

𝐱̅ ± SD
6ĐC3

ĐC3
(đối
chứng)

8ĐC3


4,00±0,63a 5,50±0,55a

7,00±0,89a

8,67±1,03a

9,50±0,84a

9,83±1,17a

10,50±1,22a

OD IgG

0,35±0,07a

0,62±0,33a

1,18±0,51a 1,21±0,47a

1,14±0,43a

2,00±0,44a

1,99±0,28a

1,90±0,34a

1,89±0,32a


3
0,30
5,64
0
0,20
6,64
3
0,19

4,64
0
0,14
4,64
0
0,22
5,64
0
0,15
5,64
0
0,14

4,64
0
0,14
4,64
0
0,23
5,64
0


11,64
9
1,42
12,64
8
1,66
8,64
3
0,98
10,64
11
1,05

IPMA

6,64±0a

6,39±0,50a

5,89±0,50b 5,39±0,96b

5,14±0,58b

5,14±0,58b

8,39±1,50b

9,39±1,50b


0,18±0,04b

0,66±0,25b

0,86±0,31b

1,27±0,32b

a, b: khác biệt thống kê với P < 0,05

Sau tiêm vắc-xin (ngày)
7

14

5,64
2
0,18
5,64
2
0,28
5,64
0
0,17
6,64
0
0,17

21



cộng, kháng thể trung hòa và IgG chống PCV2 xảy ra vào thời điểm 14 dpc,
sau đó HGKT tiếp tục tăng nhưng không tăng nhanh và mạnh như trên lô
tiêm vắc-xin (Bảng 3.20).
Kết quả xử lý thống kê so sánh HGKT tổng cộng IPMA và OD (ELISA
phát hiện IgG) cho thấy, không có sự khác biệt về HGKT IPMA và OD giữa
lô thí nghiệm và lô đối chứng thời điểm 0 và 7 dpv (P > 0,05). Tuy nhiên, có
sự khác biệt rất có ý nghĩa về HGKT IPMA và OD phát hiện IgG giữa 2 lô
từ thời điểm 14 dpv đến kết thúc thí nghiệm lúc 28 dpc (P < 0,01). Ngoài ra,
không có sự khác biệt về trung bình hiệu giá kháng thể NA giữa lô tiêm vắcxin và lô đối chứng ở các thời điểm 0 dpv, 7 dpv và 28 dpc (P > 0,05). Các
thời điểm còn lại có sự khác biệt có ý nghĩa về trung bình hiệu giá kháng thể
NA giữa 2 lô (P < 0,05).
So sánh với thí nghiệm 2 thì ở thí nghiệm 3 này heo được tiêm vắc-xin 1
lần; vào 28 ngày tuổi có sự chuyển đổi kháng thể IgG, tổng cộng và kháng
thể trung hòa lần lượt vào các ngày 7, 14 và 21 dpv. Trong khi đó, ở thí
nghiệm 1, phải đến 7 ngày sau tiêm vắc-xin lần 2 mới xuất hiện sự chuyển
đổi kháng thể tổng cộng và kháng thể trung hòa. Điều này có thể do lượng
vi-rút kháng nguyên trong vắc-xin thử nghiệm ở thí nghiệm 1 chỉ có 4,5log10
TCID50/liều, trong khi đó ở thí nghiệm 2, vắc-xin thử nghiệm được chuẩn bị
với hàm lượng vi-rút kháng nguyên lên đến 6,0log10 TCID50/liều. Điều này
cho thấy lượng kháng nguyên có trong 1 liều vắc-xin có thể ảnh hưởng đến
đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vắc-xin PCV2.
Sự hiện diện của ADN-PCV2
Ở thời điểm trước tiêm vắc-xin và trước khi công cường độc tất cả heo ở
lô được tiêm vắc-xin và lô đối chứng đều âm tính với ADN-PCV2 trong
huyết thanh, mẫu ngoáy mũi và mẫu ngoáy trực tràng.
Sau công cường độc, ở nhóm heo được tiêm vắc-xin tình trạng vi-rút
huyết qua các thời điểm khảo sát như sau: 7 dpc với tỉ lệ 66,67% (4/6 heo),
đến 14 dpc không phát hiện sự hiện diện của ADN-PCV2 trong huyết thanh
(0/6 heo), 21 dpc là 16,67% (1/6 heo) và 28 dpc là 33,33% (2/6 heo) (Bảng

1TN3
2TN3
3TN3
4TN3
5TN3
7TN3
Tổng
(+)
6ĐC3
8ĐC3
9ĐC3
10ĐC3
Tổng
(+)

Sau công cường độc (ngày)
7
14
21
H M P H M P H M
- - - - - - - + + - - - + - + + - - + + - +
+ + + - + + - +
+ + + - + - - - - - - - - + +

0
H M
- - - - - - -

P H
- +


1

0

-

-

-

+
+
+
+

+
+
+
+

+
+
+
+

+
+
+
+

-

0

0

0 4

4

4 4

4

4 4

4

4 3

2

2

H: huyết thanh, M: ngoáy mũi, P: ngoáy trực tràng

Bệnh tích: Kết quả khảo sát bệnh tích đại thể cho thấy, heo 4TN3 và
7TN3 ở nhóm tiêm vắc-xin không có biểu hiện bệnh tích. Trong khi đó, heo
9ĐC3 ở nhóm đối chứng có các biểu hiện bệnh tích như hạch bẹn sưng, nhạt
màu, thủy thủng, hạch phổi sưng lớn xuất huyết, hạch màng treo ruột sưng,

Phân lập được 18 chủng PCV2 từ 21 mẫu bệnh phẩm dương tính PCV2 thu nhận từ heo có biểu hiện triệu chứng và bệnh tích bệnh do circovirus
(PCVD). Hiệu giá vi-rút phân lập đạt được dao động từ 1,67 đến 5,50log10
TCID50/ml ở lần tiếp đời thứ 3. Phân lập PCV2 từ mẫu hạch đạt tỉ lệ dương
tính cao hơn so với các loại mẫu bệnh phẩm khác.
PCV2 thuộc các genotype khác nhau như chủng NAVET-DongNai2/2009
(PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) và NAVET-vietnam3/2004
(PCV2-Re (2h)) có tương đồng kháng nguyên cao (R >70%).
Nghiên cứu thử nghiệm vắc-xin PCV2
Binary ethylenimine (BEI) với nồng độ 3 mM, ở nhiệt độ 370C có thể vô
hoạt hoàn toàn PCV2 sau 24 giờ, với tốc độ vô hoạt khác nhau tùy từng
chủng.
Có sự chuyển đổi kháng chống PCV2 trên heo ở thời điểm 14 - 21 ngày
sau tiêm vắc-xin vắc-xin vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm từ chủng phân lập
NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b).
Vắc-xin PCV2 thử nghiệm đạt yêu cầu về an toàn, có khả năng kích thích
đáp ứng miễn dịch cũng như bảo hộ heo về mặt lâm sàng chống lại PCV2b, làm
giảm sự nhân lên và bài thải PCV2 ở heo được tiêm vắc-xin và công cường
độc.
Đề nghị
Tiếp tục nghiên cứu đánh giá hiệu lực của vắc-xin vô hoạt nhũ dầu từ
chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) trong thực địa.
Nếu có điều kiện nên nghiên cứu khả năng gây đáp ứng miễn dịch trung
gian tế bào trên heo của vắc-xin vô hoạt nhũ dầu từ chủng NAVETDongNai2/2009 (PCV2b).
Tiếp tục nghiên cứu chế tạo vắc-xin PCV2 đa giá chứa cùng lúc nhiều
chủng PCV2 và nhiều genotype khác nhau.