Chuyên đề thực hành Hoá sinh học các hợp chất thiên nhiên
XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ PROTEIN
1. Xác định nồng độ protein hoà tan theo Lowry
a. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp
photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất
mầu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước song 660nm.
Cường độ mầu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một
phạm vi nhất định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể
xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
b. Hoá chất cần dùng
- Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) và 20g Na
2
CO
3
(2%) pha trong 1000ml nước
cất.
- Dung dịch B: 0,5g CuSO
4
.5H
2
O (0,5%) pha trong dung dịch Natri Xitrat (1%)
hoặc trong dung dịch Natri, Kali Tactơrat 1%.
- Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước khi
dùng).
- Thuốc thử folin, trước khi dùng pha loãng hai lần sao cho độ axit bằng 1N.
- Albumin huyết thanh bò 1mg/ml.
c. Cách tiến hành
- Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dịch chứa protein với hàm lượng thích
hợp cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C, lắc đều để yên trong 10 phút.
Sau đó thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25ml folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều

Nguyễn Xuân Hạnh K12 – Sinh học thực nghiệm
660
nm
OD
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,2 0,4 0,6
0,8 1
1,2
0
mg
2
Chuyên đề thực hành Hoá sinh học các hợp chất thiên nhiên
Dựa vào đồ thị chuẩn, có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu
nghiên cứu.
2. Xác định nồng độ protein theo Bradford
Hàm lượng protein huyết thanh có thể được định lượng theo phương pháp
Bradford (1976).
a. Vật liệu và dụng cụ
- Các mẫu protein.
- Dung dịch mầu:
+ Coomassie blue G (serva N
o
35050) 40mg
+ Ethanol (EtOH) (absolute) 20ml
+ H

nhựa.
Thêm vào 0,6ml dung dịch mầu lắc đều.
Đo độ hấp phụ quang học (OD) ở bước sóng 595nm.
Dựa vào đồ thị chuẩn xác định hàm lượng protein trong mẫu theo công thức
sau:
X(mg) =
1000
.. aVC
Trong đó:
+ X: số mg protein có trong mẫu
+ [C]: nồng độ protein theo đồ thị 1000 (mg/ml).
+ V: thể tích dung dịch mẫu.
+ a: độ pha loãng dung dịch.
3. Xác định nồng độ protein bằng phương pháp quang phổ
- Nguyên tắc của phương pháp này là các axit amin acid thơm như trytophan,
tyrosine và phenylalanine trong chuỗi pholypeptit có phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng
280nm.
- Sử dụng BSA làm chất chuẩn, biết rằng ở bước sóng 280nm 1ml BSA có nồng
độ 1mg/ml sẽ có mật độ quang học là OD = 0,67. Dựa vào đó có thể xác định hàm
lượng protein trong các mẫu thí nghiệm theo công thức sau:
Y(mg) =
67,0
.].[ VaOD
Trong đó:
+ [OD]: mật độ quang học của 1ml dung dịch mầu.
+ V: thể tích dung dịch mầu.
+ a: độ pha loãng dung dịch.
Nguyễn Xuân Hạnh K12 – Sinh học thực nghiệm
4
Chuyên đề thực hành Hoá sinh học các hợp chất thiên nhiên

13,7
Chuỗi
µ
13,9
Chuỗi
α
15,5
Chuỗi nhẹ 12,3
Fab 15,0
Fc 12,0
V
H
27,0
Con A (lectin Canavalia
ensiformis)
12,0
Lectin Lens culinaris (LCA) 12,5
BSA 6,7
3. Nếu chưa biết hệ số tắt của protein, hoặc dung dịch gồm hỗn hợp của một số
dạng protein thì nồng độ protein tổng số có thể được tính theo phương trình sau:
Nồng độ protein, tính theo mg/ml = 1,55 x A280 – 0,77 x A260
Trong đó:
+ A280 là giá trị hấp thụ ở bước sóng 280 nm.
Nguyễn Xuân Hạnh K12 – Sinh học thực nghiệm
5