MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, dịch cúm gia cầm do virus A/H5N1 là vấn đề
quan tâm đối với cả thế giới, đặc biệt là đối với các nước châu Á như Việt Nam,
Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc... Kể từ cuối năm 2003 đến nay, dịch cúm
A/H5N1 đã gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm và gây tử vong cho
hàng trăm người. Cả thế giới đang lo sợ trước nguy cơ có thể xảy ra một đại
dịch cúm trên người do virus A/H5N1 giống như các vụ đại dịch cúm đã xảy ra
trong thế kỷ 20. Các nước trên thế giới đã tiêu tốn hàng tỷ đô la cho việc chuẩn
bị chống lại một đại dịch cúm H5N1 có thể xảy ra trong tương lai như mua thuốc
và các thiết bị y tế, nghiên cứu sản xuất vaccine, thực hành các phương án phòng
chống dịch, thực hiện các chiến lược nhằm kiểm soát chặt chẽ đường biên
giới...
Ở Việt Nam, kể từ năm 2003 đến nay, dịch cúm gia cầm liên tục xảy ra ở
hầu hết các tỉnh thành trên toàn quốc. Mỗi năm có hàng triệu gia cầm bị chết và
tiêu hủy. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam đang đứng thứ 2
trên thế giới (sau Indonesia) về số người nhiễm và tử vong do virus A/H5N1.
Virus cúm A/H5N1 là virus có khả năng biến đổi gen nhanh chóng và hình
thành nên các chủng virus mới nên việc sử dụng vaccine để dự phòng thường
không đạt được hiệu quả cao. Ở Việt Nam hiện nay, dịch cúm A/H5N1 vẫn liên
tục xảy ra trên gia cầm và người, mặc dù mức độ không trầm trọng như giai
đoạn trước đây nhưng nếu không được phát hiện và có các biện pháp dập dịch
kịp thời thì dịch có thể trở nên bùng phát.
Khi có dịch cúm gia cầm, một phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy và chính
xác là cần thiết cho việc điều trị, kiểm soát và ngăn chặn kịp thời tránh lây lan
rộng ra cộng đồng. Để phát hiện virus cúm A/H5N1 trong các mẫu bệnh phẩm ở
người và gia cầm, hiện nay hầu hết các phòng xét nghiệm đều áp dụng kỹ thuật
RTPCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction). Đây là kỹ thuật
1
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1
1.1.1. Phân loại học và danh pháp
1.1.1.1. Phân loại virus cúm
Theo ủy ban Quốc tế về phân loại virus (ICTV International Committee on
Taxonomy of Viruses), virus cúm thuộc nhóm V, họ Orthormyxoviridae, gồm 3
type là A, B và C. Chúng là các virus có vật liệu di truyền là RNA sợi đơn âm
[32].
Sự phân biệt virus cúm A, B và C dựa trên sự khác nhau về đặc tính kháng
nguyên của nucleoprotein (NP) và protein nền M1 (matrix protein). Ngoài ra, hệ
gen của virus cúm A và B đều có 8 đoạn RNA còn virus cúm C chỉ có 7 đoạn
RNA [36].
Trong 3 type thì type A là virus có giới hạn vật chủ rất rộng, lưu hành phổ
biến trên gia cầm và một số động vật có vú như lợn, ngựa, chó, mèo, hải cẩu,…
và cả con người [32]. Virus cúm A là loại có độc lực mạnh nhất, có khả năng
biến đổi gen rất lớn và nguyên nhân chủ yếu gây ra các vụ đại dịch cúm trong
thế kỷ qua. Dựa vào sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên của hai glycoprotein
là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA), virus cúm A còn được chia thành
16 subtype HA (H1H16) và 9 subtype NA (N1N9). Sự tái tổ hợp giữa các
subtype HA và NA, về mặt lý thuyết sẽ tạo ra nhiều subtype khác nhau về độc
tính và khả năng gây bệnh [2]. Tất cả các subtype HA và NA đều hiện diện trên
3
các chủng virus lưu hành ở các loài thủy cầm hoang dã. Tuy nhiên, chỉ có một số
subtype nhất định thường xuyên lưu hành trên người như H1N1, H1N2, H2N2,
H3N2 [11]. Cúm A/H5N1 là một subtype có khả năng gây nhiễm cao của virus
cúm. Các chủng của virus cúm gia cầm có thể xâm nhiễm vào nhiều loại động
vật khác nhau như chim, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi và con người.
Virus cúm B và virus cúm C lưu hành chủ yếu trên người và chỉ gây ra các
nhau, mỗi clade còn có thể phân thành các subclade (phân dòng) [5, 46]. Hiện tại
chỉ có các virus thuộc clade 0, 1, 2 và 7 là lây nhiễm cho người. Clade 2 gồm một
số subclade khác nhau vẫn đang lưu hành và tiếp tục hình thành các subclade mới
[5]. Kể từ 2008, các clade A/H5N1 hiện đang lưu hành và gây bệnh ở người gồm
có clade 2.3.2 (Trung Quốc), 2.3.4 (Trung Quốc và Việt Nam) 2.2 (Ai Cập), 2.1
(Indonesia), 1 (Campuchia) và 7 (Trung Quốc) [51].
1.1.1.3. Danh pháp virus cúm
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã quy định thống nhất danh pháp c ủa virus
cúm theo thứ tự kí hiệu: type virus (A, B hoặc C), vật chủ (có thể bỏ qua nếu vật
chủ là người), địa điểm phân lập virus, mã số chủng virus và năm phân lập. Nếu
là virus cúm A thì phải thêm kí hiệu của kháng nguyên HA và kháng nguyên NA
đặt trong dấu ngoặc đơn.
Ví dụ: A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) là chủng virus cúm A ở người, phân
lập ở Hong Kong, mã số chủng là 156, phân lập năm 1997, có kháng nguyên HA
là H5 và kháng nguyên NA là N1.
A/Chicken/Vietnam/G62/2005 (H5N1) là chủng virus cúm A phân lập ở gà
tại Việt Nam năm 2005, mã số chủng là G62, kháng nguyên HA là H5 và kháng
nguyên NA là N1.
1.1.2. Hình thái và cấu trúc virus cúm A/H5N1
Virus cum H5N1 la môt subtype cua virus cum A, thuôc ho
́
̀ ̣
̉
́
̣
̣ Orthomyxoviridea.
Virus cúm A/H5N1 mang cac đăc điêm cua virus cum A (hình 1.1).
́ ̣
̉
̉
1.1.3. Hệ gen và các protein của virus A/H5N1
6
H5N1 có hệ gen là RNA sợi đơn âm bao gồm 8 phân đoạn gen mang tên từ
18 với kích thước phân tử giảm dần hoặc gọi theo tên protein mà chúng mã hóa
tổng hợp là PB2, PB1, PB1F2, PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2) và NS (NS1 và
NEP) (hình 1.2).
Hình 1.2. Các phân đoạn gen và các protein của virus cúm A/H5N1
Đặc điểm các phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1 như sau:
Các phân đoạn mã hóa cho các kháng nguyên bề mặt của virus (đặc trưng
theo từng chủng virus):
Phân đoạn 4 (gen HA): Có kích thước khoảng 17041707 bases, mang gen
mã hóa tổng hợp protein HA, là một kháng nguyên bề mặt của virus cúm có bản
chất là glycoprotein. Kháng nguyên này có vai trò trong việc giúp cho virus gắn
với tế bào vật chủ và vận chuyển vật liệu di truyền của nó vào bên trong tế bào
vật chủ. Quá trình này có thể bị chặn lại nếu có các kháng thể đặc hiệu gắn kết
với các kháng nguyên trên bề mặt của virus. Protein HA còn là kháng nguyên bề
mặt quan trọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch
thể đặc hiệu với từng subtype HA, và tham gia vào phản ứng trung hòa virus. HA
là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là
đích của bảo vệ miễn dịch nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể
nhiễm, là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay. Một đặc điểm di
7
truyền để phân biệt giữa virus cúm gia cầm và virus cúm người là: virus cúm gia
polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus [2]. Nghiên
cứu thấy rằng, trên PB2 tất cả các virus cúm gia cầm đều có axit amin ở vị trí
627 là glutamine, còn PB2 ở các chủng A/H5N1 phân lập từ người mang đột biến
chứa axit amin lysine ở vị trí 627. Sự có mặt của lysine ở vị trí 627 của PB2 s ẽ
tạo thuận lợi cho virus phát triển ở cả đường hô hấp trên và đường hô hấp dưới
của động vật có vú, là nguyên nhân làm cho A/H5N1 có độc lực cao [29].
Phân đoạn 2 (gen PB1) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa
tổng hợp protein PB1 và PB1F2. PB1 là tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp
enyzme polymerase, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA [5]. PB1F2 liên quan đến độc
lực của virus và có thể có vai trò quan trọng trong việc xác định mức độ nguy
hiểm của dịch cúm [43]. Khi so sánh các chủng virus trong vụ dịch ở Hong Kong
năm 1997, người ta nhận thấy sự biến đổi axit amin asparagine ở vị trí 66 thành
serine (N66S) trên PB1F2 liên quan đến độc lực của virus. Sự thay đổi axit amin
N66S cũng được phát hiện trên PB1F2 của virus cúm gây ra đại dịch cúm năm
1918 [17].
Phân đoạn 3 (gen PA) có kích thước khoảng 2233 bases, là phân đoạn gen
bảo tồn cao, mã hóa tổng hợp protein PA, là một tiểu đơn vị của enzyme
polymerase chịu trách nhiệm kéo dài RNA trong quá trình tổng hợp RNA của
virus [40].
Các phân đoạn mã hóa các protein chức năng khác của virus, chúng có kích
thước tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A, gồm:
Phân đoạn 5 (gen NP) có kích thước khoảng 1556 bases, mã hóa tổng hợp
nucleoprotein (NP), chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế
bào chủ. NP có đặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong
các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA.
Phân đoạn 7 (gen M): có kích thước khoảng 1027 bases, mang gen mã hóa
tổng hợp protein nền M1 và M2 của virus. Các protein này kết hợp với 2 kháng
9
́ ợp RNP được vân chuyên vao nhân tê bao đ
̣
̉
̀
́ ̀ ể tổng hợp sợi
dương RNA. Sợi dương RNA được làm khuôn để sao mã tạo mRNA và tái bản
sợi âm RNA của virus. mRNA được đưa ra tế bào chất để tổng hợp protein của
virus. Quá trình tổng hợp protein và tái bản hệ gen của virus là quá trình phức tạp
được điều hoà bởi nhiều yếu tố của virus cũng như của tế bào. Các protein PB1,
PB2, PA và NP của virus sau khi được tổng hợp sẽ được đưa vào nhân tế bào và
kết hợp với RNA virus hình thành các phức hợp RNP và phức hợp được đưa ra
tế bào chất. Các protein khác (HA, NA và M2) được glycosyl hoá nhờ mạng lười
nội sinh chất và phức hệ golgi của tế bào. Sau khi hoàn thiện, các protein này
được đưa đến màng tế bào gắn vào lớp lipid kép và khi mật độ đủ lớn thì các
phức hợp RNP và protein M1 cũng tập hợp lại trên màng để hình thành hạt virus
thế hệ con gắn trên bề mặt tế bào nhờ liên kết giữa HA với nhóm sialic acid của
glycoprotein màng tế bào. Các hạt virus sau đó giải phóng khỏi màng nhờ tác
dụng cắt nhóm sialic acid của enzyme neuraminidase.
Thời gian từ khi virus xâm nhiễm tế bào đến khi hình thành thế hệ virus con
trung bình khoảng 6 giờ. Sự giải phóng các hạt virus mới không phá tan tế bào
nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử và
rơi vào quá trình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ
thể vật chủ [48].
1.1.5. Hiện tượng biến đổi kháng nguyên của virus cúm A
Virus cúm A là loại virus đặc biệt nhất trong các virus đường hô hấp do có
hệ gen phân thành 8 đoạn và khả năng biến đổi kháng nguyên nhanh chóng. Khả
11
glycosyl hóa xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay đổi đặc
tính kháng nguyên của HA và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác động miễn dịch
bảo vệ của cơ thể chủ và điều hoà sự nhân lên của virus [7].
Hiện tượng lệch kháng nguyên và glycosyl hóa tao ra nh
̣
ưng biên đôi di
̃
́
̉
truyên nho nh
̀
̉ ưng diên ra liên t
̃
ục trong qua trinh l
́ ̀ ưu hanh cua virus trong t
̀
̉
ự nhiên.
Ngược lai, hi
̣
ện tượng trao đôi kháng nguyên
̉
có thể xảy ra với tất cả các chủng
của virus cúm A khi co hiên t
́ ̣ ượng đồng nhiễm, tao ra cac biên đôi di truyên l
̣
́
́ ̉
nhiên rất khó kiểm soát. Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ
của chúng trong quá trình lây truyền ở tự nhiên (hình 1.4).
13
Hình 1.4. Các vật chủ tự nhiên và khả năng lây nhiễm giữa các loài vật chủ của
virus cúm A.
http://www.medicalecology.org/diseases/influenza/print_influenza.ht
Nhờ đặc tính luôn thay đổi kháng nguyên trong tự nhiên, virus cúm A có
khả năng xâm nhiễm nhiều loài vật chủ trung gian khác nhau như gia cầm,
một số loài động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn…) và cả con người, tạo
nên tính thích ứng lan truyền “ nội loài” như gà gà, hay “ ngoại loài” như gà
lợn; gà lợn người. Đặc điểm thích ứng vật chủ này là điều kiện thuận lợi
cho virus cúm A trao đổi, tái tổ hợp các phân đoạn gen, đặc biệt là các phân
đoạn gen kháng nguyên (HA và NA) giữa các chủng, tạo ra một ch ủng virus
cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới của chúng đặc
biệt khi chúng vượt qua đượ c “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây
bệnh từ gia cầm sang người và giữa người với người [15].
Các nghiên cứu về virus H5N1 trong thời gian gần đây cho thấy virus đã có
những biến đổi để thích nghi lây nhiễm trên người. Hai chủng virus H5N1 phân
lập trên người năm 2003 (Hong Kong) cho thấy có hiện tượng giảm ái lực với
thụ thể của gia cầm và có ái lực (mặc dù chỉ ở mức thấp) với thụ thể của người
và sự thay đổi axit amin ở vị trí 227 (Ser thành Asn) là nguyên nhân làm thay đổi
14
tính đặc hiệu với thụ thể của virus [23]. Đột biến ở vị trí 182 hoặc 192
(Asn182Lys hoặc Gln192Arg) làm cho H5N1 thay đổi đặc tính gắn thụ thể, từ
lại, protein HA của HPAI lại có nhiều axit amin kiềm tại vị trí phân cắt, do đó có
thể chịu tác dụng của các protease nội bào (intracellular protease) phổ biến như
furin [44]. Chính vì vậy mà HPAI có thể gây bệnh ở nhiều mô, cơ quan khác nhau
trên cơ thể vật chủ và gây nên các triệu chứng nặng nề và tỉ lệ tử vong cao.
Độc lực và khả năng gây bệnh của virus A/H5N1 được quyết định chủ yếu
bởi các protein của virus là HA, PB2, NS1 và PB1F2: Protein HA là kháng nguyên
bề mặt quan trong cua virus cúm, giup cho virus co thê găn v
̣
̉
́
́ ̉ ́ ơi cac thu thê sialic
́ ́
̣
̉
acid đăc hiêu trên bê măt tê bao, hoa mang va xâm nhiêm tê bao chu. V
̣
̣
̀ ̣ ́ ̀
̀
̀
̀
̃ ́ ̀
̉ ị trí phân căt́
protein HA cua A/H5N1 mang nhiêu axit amin kiêm nên dê dang bi phân căt b
̉
̀
̀
̃ ̀
̣
́ ̀
̃ ̀ ́
ban cua virus. Protein NS1 co thê tham gia điêu hoa đap
̉
̉
́ ̉
̀ ̀ ́ ứng miên dich
̃ ̣ ở vât chu,
̣
̉
do đo cung la môt yêu tô quyêt đinh đôc l
́ ̃
̀ ̣
́ ́
́ ̣
̣ ực cua virus đôi v
̉
́ ới con ngươi. PB1F2
̀
có vai trò gây ra hiện tượng apoptosis làm tổn thương mô, cơ quan của cơ thể
nhiễm.
1.1.8. Sức đề kháng của virus cúm A
Virus cúm A tương đối nhạy cảm với các tác nhân vật lí hay hóa học. Các hạt
virus tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6.5 đến 7.9. Ở pH quá acid hay quá kiềm,
khả năng lây nhiễm của virus bị giảm mạnh. Lớp vỏ ngoài của virus bản chất là lớp
lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan
lipid, chất tẩy rửa và các chất sát trùng: formaldehyde, phenol, βpropiolacton, sodium
hypochloride, acid loãng và hydroxylamine. Virus bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau
40 giờ, tồn tại được 15 ngày ánh sáng thường, tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng
đường tiêu hóa) [6]. Không giông
́ như cum
́ mua,
̀ bênh
̣ nhân nhiêm
̃ A/H5N1
thương không co biêu hiên nhiêm trung đ
̀
́ ̉
̣
̃
̀
ường hô hâp trên ma th
́
̀ ương biêu hiên
̀
̉
̣
17
tinh trang viêm phôi va nhiêm trung đ
̀
̣
̉ ̀
̃
̀ ường hô hâp d
́ ưới. Đăc điêm lâm sang nay co
̣
́
̀
lượng môt sô protein huyêt thanh nh
̣
́
́
ư aminotransaminase, lactate dehydrogenase
va creatine phosphokinase; đ
̀
ường huyêt tăng ro, co thê liên quan đên viêc s
́
̃ ́ ̉
́
̣ ử dung
̣
corticosteroid va co thê tăng creatinine mau [31].
̀ ́ ̉
́
Ở nhưng bênh nhân co tai l
̃
̣
́ ̉ ượng
virus cao trong dich mui va dich nôi khi quan, nh
̣
̃ ̀ ̣
̣
́ ̉
ưng bênh nhân
̃
̣
̃ ́ ̣
́
́
̀ ̣
̉
ở hâu hêt cac mô trong c
̀ ́ ́
ơ
thê, bao gôm: phôi, khi quan, gan, niêm mac ruôt non, ruôt gia, tuy x
̉
̀
̉
́ ̉
̣
̣
̣
̀ ̉ ương va nao.
̀ ̃
Tỉ lệ tử vong đối với bệnh nhân nhiễm cúm A/H5N1 nhập viện tương đối
cao, xấp xỉ 60% [13, 16], mặc dù tỷ lệ tử vong chung có lẽ thấp hơn nhiều. Trái
ngược với năm 1997, khi phần lớn các ca tử vong xảy ra ở bệnh nhân trên 13
tuổi, cúm A/H5N1 hiện nay gây tỷ lệ tử vong cao ở trẻ nhỏ. Ở trẻ dưới 15 tuổi,
tỷ lệ tử vong là 89% [16]. Thời gian trung bình từ khi có triệu chứng đầu tiên đến
khi tử vong là 910 ngày (thay đổi từ 630 ngày) và hầu hết bệnh nhân tử vong do
suy hô hấp tiển triển [5, 16].
1.2.2. Các phương pháp xét nghiệm và chẩn đoán nhiễm cúm A/H5N1
Chẩn đoán lâm sàng nhiễm cúm A/H5N1 là rất khó vì triệu chứng của bệnh
rất đa dạng và tương tự như một số bệnh khác. Để chẩn đoán xác định người ta
thường phải dựa vào các kết quả xét nghiệm xác định sự có mặt của virus, kháng
nguyên, kháng thể hoặc RNA của virus trong mẫu bệnh phẩm.
phôi có thể bị chết trong vòng 24 giờ sau khi gây nhiễm.
Phân lập từ tế bào: Khi nuôi cấy các virus cúm mùa LPAI trên tế bào
MDCK, người ta phải bổ sung trypsin để virus có thể tái bản. Tuy nhiên, đối với
các virus cúm A/H5N1, vì là HPAI nên virus có thể tái bản mà không cần bổ sung
trypsin.
19
Là tiêu chuẩn vàng, nhưng phân lập virus đòi hỏi phải có phòng an toàn sinh
học cấp 3 (BioSafety Level 3 BSL3) và thời gian nuôi cấy tương đối lâu, từ 26
ngày. Ngoài ra, sau khi phân lập được virus vẫn phải thực hiện các xét nghiệm
khác để chẩn đoán xác định subtype virus.
Phương pháp phát hiện kháng nguyên
Là phương pháp dùng kháng thể đặc hiệu để phát hiện kháng nguyên virus.
Người ta có thể phát hiện kháng nguyên của virus trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm
bằng một số kỹ thuật khác nhau, tuy nhiên kỹ thuật được sử dụng phổ biến hơn
do thời gian xét nghiệm nhanh là:
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (direct immunofluorescence
assay): Tế bào niêm mạc đường hô hấp được cố định trên lam kính, kháng
nguyên của virus được phát hiện bằng kháng thể đặc hiệu có gắn huỳnh quang
và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Kỹ thuật miễn dịch gắn men (EIA: Enzymelinhked Immunosorbent Assay):
Kỹ thuật sử dụng kháng thể đặc hiệu gắn enzyme để phát hiện kháng nguyên
virus. Mẫu bệnh phẩm được gắn lên thành giếng, sau khi được ủ với kháng thể
có gắn enzyme thì bổ sung cơ chất phù hợp. Nếu có kháng nguyên virus trong
mẫu bệnh phẩm thì enzyme sẽ tác dụng với cơ chất làm đổi màu.
Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên virus nhanh, đơn giản nhưng chỉ phát hiện
được các kháng nguyên bảo thủ của virus cúm như NP và M. Do đó, kết quả xét
nghiệm dương tính cũng chỉ có thể kết luận là nhiễm virus cúm A, không xác
các băng nhỏ, ủ với mẫu huyết thanh pha loãng, kháng thể đặc hiệu trong huyết
thanh sẽ liên kết với kháng nguyên gắn trên màng. Tiến hành ủ các băng nêu trên
với kháng kháng thể đặc hiệu có gắn enzyme, chất chỉ thị màu (phosphatase kiềm
hoặc peroxidase cải củ cay) hoặc biotin và được nhận biết bằng streptavidin
HRP. Vị trí gắn kháng thể kháng virus sẽ được xác định khi ủ các băng này với
cơ chất của enzyme hoặc chất tạo màu. WB có độ nhạy cao, thường được sử
dụng kết hợp với kĩ thuật HI hoặc EIA để làm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu [42].
21
Kĩ thuật trung hoà virus: Mẫu virus được ủ với huyết thanh bệnh nhân sau
đó hỗn hợp được sử dụng để gây nhiễm trong hệ thống phù hợp (tế bào nuôi
cấy, phôi trứng) để xác định sự xâm nhiễm của virus. Nếu không có sự xâm
nhiễm của virus, tức là kết quả dương tính, khi đó huyết thanh có kháng thể đặc
hiệu với virus. Người ta đã áp dụng kỹ thuật này trong vụ dịch ở Hong Kong năm
1997 để phát hiện kháng thể kháng H5N1 trong huyết thanh bệnh nhân và có thể
phát hiện được 14 ngày sau khi bệnh nhân biểu hiện triệu chứng [35]. Kỹ thuật
này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể sử dụng để phát hiện kháng thể kháng
H5N1 ở người nhưng do sử dụng mẫu virus cúm gia cầm nên cũng phải thực
hiện trong phòng an toàn sinh học cấp độ 3.
Kỹ thuật trung hòa vi lượng (Microneutralization MN): là kĩ thuật trung
hoà virus được thực hiện trên tấm 96 giếng, kết quả được đọc bằng phản ứng
EIA sau 1822 giờ kể từ khi gây nhiễm. Kĩ thuật MN dựa trên phản ứng trung
hòa virus với kháng thể đặc hiệu. Huyết thanh bệnh nhân được pha loãng ở các
nồng độ khác nhau và được ủ cùng một lượng virus nhất định trước khi tiến
hành gây nhiễm tế bào. Nếu trong huyết thanh bệnh nhân có kháng thể đặc hiệu
kháng H5N1 thì kháng thể sẽ trung hòa virus và virus không thể gây nhiễm tế
bào. Sau khi ủ, các tế bào được gắn cố định và tiến hành xác định sự có mặt của
protein NP của virus trong các tế bào nhiễm virus bằng phản ứng EIA. Hiện nay,
PCR được thực hiện trong một tube phản ứng, tất cả các thành phần của 2 giai
đoạn được cho vào cùng một lần. Ở đây, toàn bộ sản phẩm cDNA đều tham gia
vào PCR và không nhất thiết phải có mồi riêng cho RT vì chính mồi của PCR sẽ
được sử dụng làm mồi cho RT. RTPCR một bước thuận tiện hơn và tránh được
nguy cơ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại.
Kỹ thuật RTPCR phát hiện các trình tự gen đặc trưng cho virus cúm A (gen
M) hoặc cho subtype HA và NA của virus dựa trên các cặp mồi được thiết kế
đặc hiệu với từng gen, do đó có thể xác định được các subtuye virus cúm A với
độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Để chẩn đoán các trường hợp nghi nhiễm cúm
A/H5N1, người ta thường phải thực hiện vài phản ứng RTPCR, bao g ồm phản
23
ứng xác định nhiễm cúm A và các phản ứng xác định subtype HA và NA. Thời
gian để thực hiện xét nghiệm bằng kỹ thuật này mất khoảng từ 1224 giờ hoặc
hơn, tùy thuộc vào từng phòng thí nghiệm. Kỹ thuật realtime RTPCR chẩn đoán
A/H5N1 giúp rút ngắn thời gian xét nghiệm xuống còn 46 giờ, tăng độ nhạy và
độ đặc hiệu đồng thời có thể xác định được mật độ virus trong mẫu bệnh phẩm
[18, 41]. Do không phải điện di phân tích kết quả nên kỹ thuật realtime RTPCR
hạn chế được hiện tượng dương tính giả do nhiễm sản phẩm PCR. Kỹ thuật
này cho kết quả nhanh và chính xác nhưng chi phí cao, tốn kém.
Kỹ thuật multiplex RTPCR: Sử dụng cả 3 cặp mồi đặc hiệu phát hiện cả 3
gen M, HA và NA của virus cúm A/H5N1 trong cùng một phản ứng. Kỹ thuật này
khắc phục được nhược điểm của hai kỹ thuật trên nhưng để xây dựng được
phản ứng multiplex RTPCR thì quan trọng nhất là phải thiết kế được các mồi có
nhiệt độ gắn mồi (Ta Annaeling temperature) vào DNA đích tương đương nhau
và quan trọng nữa là độ nhạy phát hiện từng tác nhân đích không bị giảm so với
độ nhạy của RTPCR đơn mồi.
Kỹ thuật RTPCR chẩn đoán cúm A/H5N1 với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
liều gấp đôi (150 mg x 2 lần/ngày) và tăng thời gian dùng thuốc [49]. Oseltamivir
vẫn có tác dụng tốt đối với các trường hợp điều trị muộn nếu có dấu hiệu virus
vẫn đang nhân lên [49, 20]. Điều trị phối hợp các thuốc kháng virus với nhau
hoặc phối hợp thuốc kháng virus với thuốc kháng viêm hoặc thuốc điều trị miễn
dịch cũng được áp dụng, tuy nhiên hiệu quả của các phương pháp điều trị phối
hợp đều chưa được đánh giá đầy đủ. Corticosteroid là thuốc được sử dụng phổ
biến nhưng hiệu quả điều trị chưa rõ ràng. Thậm chí một nghiên cứu còn cho
thấy trong số 7 bệnh nhân được điều trị bằng corticosteroid có tới 6 bệnh nhân tử
vong [47]. Rõ ràng là cần phải có những nghiên cứu tiếp theo để đánh giá về
hiệu quả điều trị khi phối hợp thuốc kháng virus với các thuốc khác. Ở giai đoạn
toàn phát của bệnh, đặc biệt là khi bệnh nhân đã biểu hiện ARDS và/hoặc
25
Copyright: Tài liệu đại học ©