NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. BIA VÀ CÁC SẢN PHẨM BIA.
1.1 Khái niệm bia:
Bia là một loại nước uống chứa cồn được sản xuất bằng quá trình lên men của
đường trong môi trường lỏng và nó không được chưng cất sau khi lên men. Nói
một cách khác, bia là loại nước giải khát có độ cồn thấp, bọt mịn xốp và có hương
vị đặc trưng của hoa houblon. Đặc biệt CO 2 hòa tan trong bia có tác dụng giải nhiệt
nhanh, hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa. Ngoài ra trong bia còn chứa một lượng
vitamin khá phong phú (chủ yếu là vitamin nhóm B như vitamin B1, B2, PP…).
Nhờ những ưu điểm này, bia được sử dụng rộng rãi ở hầu hết các nước trên thế
giới với sản lượng ngày càng tăng. Đối với nước ta, bia đã trở thành loại đồ
uống quen thuộc với sản lượng ngày càng tăng và đã trở thành ngành công
nghiệp mũi nhọn trong ngành công nghiệp nước ta.
Quá trình sản xuất bia được gọi là nấu bia. Do các thành phần sử dụng để
sản xuất bia có khác biệt tùy theo từng khu vực, các đặc trưng của bia như
hương vị và màu sắc cũng thay đổi rất khác nhau.

[16]

1.2. Lịch sử phát triển ngành sản xuất bia:
Sản xuất bia là một ngành công nghiệp thực phẩm có bước phát triển nhanh
chóng mặc dù trải qua nhiều thăng trầm của thời gian, công nghệ - kĩ thuật và nhận
thức của cộng đồng. Xét về nguồn gốc, bia có xuất xứ từ các sản phẩm Nông
nghiệp. Các chứng cứ cho thấy rằng bia được pha chế tại xung quanh vùng Lưỡng
Hà khoảng 6000 đến 7000 năm trước. Người Ai Cập cổ đại đó ủ rượu, bia bằng các
loại ngũ cốc của họ (lúa miến), việc này cũng được thưc hiện trong những bộ lạc
người châu Phi.. Từ thế kỷ thứ 10 trong giai đoạn này việc sử dụng thảo dược rất
phổ biến và người Đức đó sử dụng Houblon trong sản xuất bia sau đó Houblon

giới tăng trưởng nhanh nhưng lại phân bố không đều giữa các châu lục, tập trung ở
Châu Âu và Châu Mỹ. Bên cạnh đó sản lượng bia ở những khu vực khác trong
những năm gần đây cũng tăng trưởng khá nhanh, đặc biệt là các nước Châu Á, đó
đứng thứ 3 trên thế giới sau Châu Âu và Châu Mỹ. Hiện nay ở Châu Á, Trung
Quốc là nước thị trường rộng lớn nhất và là thị trường đang phát triển mạnh nhất,
tiếp theo là Nhật Bản nhưng ở mức độ vừa phải từ những năm 1990 trở lại đây.
Ở Việt Nam, ngành công nghiệp sản xuất bia có lịch sử hơn 100 năm.
Xưởng sản xuất bia đầu tiên được đặt tên là xưởng sản xuất bia Chợ Lớn, do
một người Pháp tên là Victor Larue mở vào năm 1875, là tiền thân của nhà
máy bia Sài Gòn, nay là Tổng công ty Bia Rượu Nước giải khát Sài Gòn. Ở

4


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

miền Bắc, vào năm 1889, một người Pháp tên là Hommel đó mở xưởng bia ở
Làng Đại Yên, Ngọc Hà, sau trở thành nhà máy bia Hà Nội, nay là Tổng công
ty Bia Rượu Nước giải khát Hà Nội. Trong quá trình hình thành và phát triển,
ngành sản xuất bia đó đạt mức tăng trưởng cao vào những năm của thời kỳ mở
cửa. Cùng với quá trình hội nhập, ngành sản xuất bia phát triển về quy mô và
trình độ công nghệ, trở thành một ngành công nghiệp có thế mạnh khi Việt Nam
gia nhập tổ chức WTO.

Hình 2.1: Mức tiêu thụ bình quân đầu người qua các năm

Việc đầu tư xây dựng các nhà máy bia được triển khai mạnh mẽ từ
những năm 1990 trở lại đây. Số các nhà máy bia là 469 vào năm 1998 với các
quy mô khác nhau từ 100.000 lít/năm đến 100 triệu lít/năm. Mức tiêu thụ

1.3.1 Chất hòa tan (chất trích ly)
Chiếm 3,5 ÷ 5,0% trọng lượng bia.
Chất hòa tan (chất trích ly) trong bia tuy chiếm một hàm lượng không lớn,
song do sự phong phú về thành phần hóa học mà có tính chất quyết định đến chất
lượng của bia. Cụ thể trong chất hòa tan (chất trích ly) của bia sẽ gồm có:
1.3.1.1 Hydrat cacbon : Chiếm 80 ÷ 85% chất hòa tan trong bia. Trong số
này, riêng maltose và maltotriose chiếm khoảng 60 ÷ 70%, còn lại là các đường
khác như glucose, saccarose, pentose, arabinose, xylose,…
1.3.1.2 Protein : Chiếm 6 ÷ 9% chất hòa tan trong bia (khoảng 700 mg/l các
chất chứa Nitơ). Trong đó:
- 140 mg/l protein có phân tử lượng cao.
- 120 mg/l protein có phân tử lượng trung bình.
- 440 mg/l protein có phân tử lượng thấp.
1.3.1.3 Glyceryl :

6


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

Chiếm 3 ÷ 5%, là sản phẩm phụ hình thành khi lên men (khoảng 1200 ÷ 1600
mg/l).
1.3.1.4 Các chất tro:
Chiếm 3 ÷ 4% trọng lượng chất hòa tan, tức khoảng 1,4 ÷ 1,8g/l. Trong đó
30% là photphat, còn lại là clorit, silicat, các cation như K+, Na+, Ca+, Mg2+,…
1.3.1.5 Các chất đắng – tanin (chát) – màu:
- Hàm lượng chất đắng (đơn vị EBC): Khoảng 15 ÷ 20 mg/l theo izo – α –
acid và α - acid đắng.
- Khoảng 150 mg/l tanin. Trong đó 2/3 từ malt; 1/3 từ hoa houblon.

1.3.2 Các chất dễ bay hơi
- Etanol: 3,4 ÷ 4,5% trọng lượng bia.
- Acid carbonic: 0,35 ÷ 0,55% trọng lượng bia.
- Nước: 90 ÷ 92% trọng lượng bia.[1][5][6]

1.4. Vai trò của bia:
Bia là một loại thức uống mát, bổ với vị đắng dễ chịu và hương thơm đặc
trưng, độ cồn thấp. Với bia, khi sử dụng đúng mức sẽ mang đến cho con người sự
sảng khoái, dễ chịu và tăng sức đề kháng cho cơ thể.
Hàm lượng nước: có thể chiếm 90% trong bia, với hàm lượng nước nâng cao,
bia sẽ giúp giải khát tốt cho người sử dụng, khi uống vào CO 2 trong bia sẽ thoát ra
cho ta cảm giác mát lạnh ở lưỡi.
Chất khoáng: trong bia có khoảng hơn 30 loại chất khoáng mà chủ yếu được
trích ly từ malt như: Mg, P, K…Ngoài ra bia còn chứa một lượng thấp của Na và Ca
giúp giảm nhanh cơn khát.
Vitamin: bia chứa hầu hết các vitamin nhóm B (B2, B6, PP), một ít nhóm A, D
và E, các vitamin kể trên là cần thiết đối với con người.
Polyphenol: có khoảng 150mg/l bia. Nó giúp chống lại các nguy cơ về bệnh
tim mạch và ung thư.
Cacbon dioxit (CO2): ngoài việc làm cho bia có cảm giác thơm ngon, nó còn
làm tăng khả năng bài tiết nước tiểu, tăng khả năng tiêu hóa của cơ thể.
Năng lượng: 1 lít bia khi uống sẽ cung cấp cho con người một lượng từ 500 –
600 calori.[1][5][6]

1.5 Phân loại bia:
1.5.1 Phân loại theo tính chất
Có nhiều loại bia khác nhau, mỗi loại bia được coi là thuộc về một kiểu bia cụ
thể nào đó. Yếu tố chính để xác định loại bia là men bia sử dụng trong quá trình lên
men. Phần lớn kiểu bia thuộc về một trong hai họ lớn: ale- sử dụng lên men nồi


Hình2.3 : Bia Lager

0

(30-40 F). Trong giai đoạn lên men
thứ cấp, lager được làm trong và chín. Các điều kiện lạnh cũng kiềm chế việc sản
xuất tự nhiên các ester và các phụ phẩm khác, tạo hương vị “khô và lạnh hơn” của
bia.[15]
Loại bia hỗn hợp: Kiểu bia lai hay bia hỗn hợp sử dụng các nguyên liệu và
công nghệ hiện đại hoặc bổ sung càc khía cạnh truyền thống của sản xuất bia. Mặc
dù có một số biến thái giữa các nguồn khác nhau, nhưng nói chung bia hỗn hợp có
thể là:





Bia rau quả là hỗn hợp với một số loại phụ gia từ hoa quả có thể lên men
trong quá trình lên men, tạo ra chất lượng hài hòa một cách rõ nét.
Bia thảo mộc và bia gia vị bổ sung các chất chiết ra từ rễ, hạt, lá, hoa hay
quả thảo mộc hoặc các loại cây gia vị thay vì bổ sung hoa bia.

9


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH


Các loại bia tồn trữ trong các thùng gỗ là các loại bia truyền thống hay


Hình 2.4 : một số loại bia lon trên thị trường

2. PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN BIA.

10


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

2.1 Làm trong bia:
Trong quá trình lên men phụ và tàng trữ, bia đã được lam trong một cách tự
nhiên nhưng chưa đạt đến mức độ cần thiết. Màu đục của bia được lý giải bằng sự
hiện diện của nấm men, của các hạt phân tán cơ học, của các hạt dạng keo, của phức
chất protein- polyphenol, của nhựa đắng và của nhiều loại hạt li ti khác. Tất cả các
cấu tử này sẽ góp phần làm giảm độ bền của bia nếu chúng cứ tồn tại trong đó. Vì
vậy muốn làm tăng độ bền của bia, với mục đích là tăng thời gian bảo quản khi
chúng lưu hành trên thị trường, cần phải lại bỏ tất cả những cấu tử gây đục cho bia,
bằng phương pháp nhân tạo. Có hai giải pháp để lam trong bia: lọc và ly tâm.
Nguyên tắc lọc bia được xây dựng trên hai quá trình:
 Giữ chặt bằng lực cơ học tất cả các hạt có kích thước lón hơn kích
thước lỗ hổng của vật liệu học.
 Hấp phụ các hạt có kích thước bé hơn, thậm chí các hạt hòa tan dạng
keo và các hạt hòa tan phân tử. Độ trong tinh thể của bia đạt được là nhờ có quá
trình thứ hai này. Hiệu quả của quá trình hấp phụ, phụ thuộc trước hết vào bản chất
của chất hấp phụ và chất bị hấp phụ, sau đó là thời điểm trong quá trình lọc.
Trong công nghiệp sản xuất bia, những loại vật liệu lọc được sử dụng rộng rãi
nhất gồm có:
 Xelluloza trộn với bột axbetit rồi ép chặt thành bánh hình tròn (hoặc

học. Chính vì vậy mà sự thay đổi về thành phần và tính chất của bia sau khi ly tâm
là hầu như không đáng kể. Ngoài ra, giải pháp ly tâm còn có một ưu điểm nữa là sự
thuận tiện về mặt cơ khí khi làm việc. Bên cạnh những ưu điểm, giải pháp này cũng
có một số nhược điểm nhỏ ta cần phải lưu ý. Đó là, trong khi ly tâm, nhiệt độ của
bia có thể sẽ tăng lên. Theo một số ít tác giả thì bia sau khi ly tâm sẽ có tính khử
yếu hơn so với bia lọc. Vì những lý do đó, làm lạnh bia trước lúc ly tâm là công
việc bắt buộc phải làm.[3][4]

2.2 Bão hòa CO2:
Nhằm làm tăng chất lượng cảm quan, chống kết tủa và là môi trường tốt để
bảo quản bia. Bổ sung lượng CO 2 bị thất thoát trong quá trình lọc bia.Tạo mọi điều
kiện thích hợp về nhiệt độ, áp suất, để tiến hành bão hoà CO 2.
Phương pháp bão hoà CO2: Hạ nhiệt độ trong absort xuống 20C bằng cách mở van
tác nhân lạnh. Dịch bia sau khi lọc được bơm vào absort không được quá vạch vì
dịch bia sẽ bị trào ra ngoài khi áp suất cao. Mở van CO 2 từ bình chứa vào trực tiếp
và được dẫn vào trong absort xuống đáy thiết bị qua thiết bị phân tán thành những
phân tử nhỏ khuếch tán đều trong bia. Nạp CO 2 khi áp suất lên gần 5 kg/ cm 2 thì
ngưng lại.
Chú ý:

12


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

Trước khi nạp CO2 vào ta phải xả áp suất trong absort gần 0 kg/ cm 2 và đóng
lại rồi mới bắt đầu nạp CO 2. Sau 30 phút mở van xả áp suất, loại bỏ bớt CO 2 do CO2
không hấp thụ hoàn toàn trong bia. Khi áp suất trong bình còn 1 – 2 kg/ cm 2 thì tiến
hành nạp CO2 lại trong thời gian nhất định, số lần nạp từ 2 đến 3 lần.[3][4]

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

Thời gian cần thiết để diệt các tế bào vi sinh vật phụ thuộc vào nhiệt độ. Khả
năng chịu nhiệt của các loài vi sinh vật khác nhau cũng khác nhau, và khả năng đó
dao động trong những khoảng khá rộng. Ngoại trừ một số, còn đa số nấm men đều
bị diệt ở nhiệt độ 620C- 630C trong vòng 2 phút, ở nhiệt độ đó, phải kéo dài tới 1520 phút nhiều loại vi khuẩn mới bị tiêu diệt. Còn vi khuẩn chịu nhiệt thì với thời
gian đó mà ở nhiệt độ 1000C chúng vẫn không chết. Bào tử của nấm men và nấm
mốc kém chịu nhiệt hơn so với bào tử của vi khuẩn. Chúng bị diệt ở 80 0C, còn bào
tử của vi khuẩn, nhiều trường hợp phải ở nhiệt độ 120 0C trong 30 phút may ra mới
diệt được chúng.
Thanh trùng bia sẽ dẫn đến sự thay đổi bất lợi cho hương, vị và màu sắc của
sản phẩm. Ngay sau khi thanh trùng, những sự thay đổi đó rất khó nhận ra, nhưng
sau một thời gian bảo quản thì chúng mới lộ rõ. Một trong những nguyên nhân dẫn
đến sự thay đổi đó là sự tạo thành melanoid.
Thanh trùng bia cũng có thể dẫn đến vẩn đục dạng keo cho sản phẩm. vấn đề
này phụ thuộc vào thành phần protein của bia, nhiệt độ và thời gian đun nóng.
Protein cao phân tử là những thủ phạm chính gây ra vẩn đục dạng keo trong giai
đoạn thanh trùng. Ở một múc độ nào đó, các hợp chất polyphenol ngưng tụ cũng
góp phần vào việc làm hỏng bia.
Để loại trừ, hoặc làm giảm bớt các hậu quả âm tính đến chất lượng sản phẩm
do quá trình thanh trùng gây ra, thì bia phải được sản xuất theo một chế độ công
nghệ đặc biệt nghiêm ngặt. Điều cần thiết trước hết là ở giai đoạn sản xuất dịch
đường, quá trình đường hóa và thủy phân phải đạt ở múc sâu và hoàn toàn. Lên men
chính, lên men phụ và tàng trữ phải tiến hành ở nhiệt độ thấp và phải kéo dài thời
gian đủ mức cần thiết. lọc bia hai lần và làm lạnh sâu đến 0 0C trước đó, tiến hành
trong hệ thống kín tránh tiếp xúc với oxy là những giải pháp bắt buộc phải thực
hiện. Ngoài những vấn đề nêu trên, bia cần phải được làm ổn định thành phần bằng
cách xử lý với các chất hấp phụ, các chất kết lắng, các chế phẩm enzym proteaza và
các chất chống oxy hóa.

chát và nhựa hoa houblon.
Vẩn đục do kết tủa protein, dextrin: do hàm lượng protein trong đại mạch quá
cao, quá trình nấu, tàng trữ, lọc không bảo đảm kỹ thuật.
Vẩn đục do kết tủa kim loại: do bia tiếp xúc với kim loại như Pb, Fe. Cu.
Protein kết hợp với kim loại, bị biến tính gây kết tủa. Hiện tượng đục bia này gây
bất lợi về mặt cảm quan, màu bia bị xám, mùi vị có pha lẫn mùi vị kim loại.
Vẩn đục do hoạt động của vi khuẩn: xảy ra khi trong bia còn lẫn tạp trùng. Để
khắc phục còn phải chú ý đến khâu vệ sinh, sát trùng thiết bị, phân xưởng sản xuất.
Để ngăn chặn hiện tượng đục trong bia cần nghiêm chỉnh chấp hành đúng quy
chế kỹ thuật đã xác định trong toàn bộ quy trình sản xuất.

3.3 Bia bị chua
Độ acid trong bia thay đổi bình thường từ 1,8 – 5,5 ml kiềm trong 100 ml bia.
Độ acid tăng lên trong mọi nhiệt độ bảo quản, và bia có thể bị hỏng ngay cả khi đạt
tới độ acid giới hạn quy định theo tiêu chuẩn.

15


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

Ngoài ra, mùi vị bia có thể thay đổi trong quá trình bảo quản: bia bị nhạt, có vị
chua và đắng, vị lên men, không còn mùi thơm. Hiện tượng thay đổi mùi vị sinh
cặn, mất acid carbonic xảy ra ở nhiệt độ cao hơn là nhiệt độ thấp.

4. NHỮNG VI SINH VẬT NHIỄM VÀO BIA TRONG QUÁ TRÌNH
SẢN XUẤT VÀ BẢO QUẢN.
4.1 Vi sinh vật gây ngộ độc:
4.1.1 Coliforms:


thường chỉ có nấm mốc gây ra độc tố làm trúng độc. Người ăn phải nấm mốc có thể
bị khối u trong gan, gây ra ung thư gan, tácđộng lên thận làm suy thoái thận. [11]
4.1.4 Staphylococcus aureus:
Staphylococcus aureus là VSV có khả năng sản sinh một số loại độc tố đường
ruột bền nhiệt, không bị phân huỷ khi đun ở 1000C trong khoảng 30 phút.
Staphylococcus aureus không có khả năng cạnh tranh cao so với các vi khuẩn gây
hỏng thực phẩm khác nhưng khi không có đối thủ cạnh tranh, chẳng hạn trong thực
phẩm muối hoặc chế biến, chúng có thể sinh sôi và tạo ra độc tố bền nhiệt. Khi vi
sinh vật này xâm nhiễm vào trong thực phẩm, chúng tiết độc tố vào trong sản phẩm
và gây độc. Khi con người tiêu thụ loại thực phẩm có chứa độc tố này, sau 4-6 giờ ủ
bệnh sẽ bộc phát các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy, nôn mữa, các triệu chứng
này kéo dài từ 6-8 giờ. Các nguồn lây nhiễm vào thực phẩm chủ yêu từ các khâu
chế biến. Trong tự nhiên các vi sinh vật này thường tình thấy trên da, mũi, tóc hay
lông của các loài động vật máu nóng.[11]
4.1.5 Clostridium perfringens:
Quan niệm về sự ngộ độc thực phẩm do Clostridium perfringens gây ra đã có
những thay đổi trong những năm gần đây. Theo những quan niệm trước đây cho
rằng các dòng C.perfringens kháng nhiệt, tạo bào tử và không làm tan máu mới có
thể gây ngộ độ thực phẩm. Nhưng trong những năm gây đây các dòng nhạy cảm với
nhiệt, không làm tan máu cũng được tìm thấy trong các vụ ngộ độc do vi sinh vật
này gây nên.Vì các bào tử của C. perfringens kháng nhiệt nên chúng thường sống
sót qua quá trình nấu chín. Tuy nhiên cũng phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc với
nhiệt. Nếu những bào tử sống sót, khi gặp điều kiện thích hợp chúng sẽ nẩy mầm và
nhân lên. Khi đun nấu thức ăn ở nhiệt độ thấp và thời gian ngắn có thể làm cho các
dòng kháng nhiệt tồn tại vì thế chúng sẽ gây tái nhiễm sau khi bảo quản. Các triệu
chứng của ngộ độc do độc tố của vi sinh vật này gây ra là đau thắt vùng bụng, tiêu
chảy, đôi khi nôn mửa xuất hiện sau 8-20 giờ khi ăn một lượng lớn tế bào sống
Clostridium perfringens. Thời gian ủ bệnh là 12- 24 giờ.[11]


bia với độ cồn lên tới 3,8% (w/v) (Haikara and Lounatmaa, 1987; Lawrence, 1988) .
[13]

18


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. NGUYÊN VẬT LIỆU
1.1 Dụng cụ


Erlen 50 ml, 100 ml



Đèn cồn



Ống đong



Bình định mức 50 ml, 100 ml






Ống nghiệm



Một số vật dụng khác

1.2 Thiết bị
 Autolave ( TOMY SS – 352)
 Cân điện tử (ADAM AQT – 200)
 Máy ảnh (CANON IXUS 8515)
 Máy đo pH( HANNA – HI 8424)
 Kính hiển vi quang học( OLYMPUS CH30)
 Tủ sấy dụng cụ (MEMMERT)

19


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

 Tủ hút ( ASTEC MONNAIR)
 Tủ lạnh ( LG GR - T582GV)
 Tủ ấm ( SHEL LAT)

1.3 Sử lý dụng cụ
Dụng cụ thuỷ tinh: được rửa bằng nước javel sau khi sử dụng, ngâm cồn 70 o
khoảng 6 – 8 giờ. Vô trùng bằng cách hấp khử trùng hơi nước với Autolave ( 121 o ở
1 atm trong 30 phút). Bao gói cẩn thận và sấy khô ở 110o trong 15 phút, bảo quản

 Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy khuấy đồng nhất.

2.4 Số lượng mẫu: 40 mẫu ( mỗi loại 10 mẫu)
2.5 Nội dung nghiên cứu
2.5.1 Mục tiêu tổng quát
Khảo sát khả năng bị nhiễm vi sinh vật của bia tươi trên thị trường Thành phố
Hồ Chí Minh, từ đó có nhận định chung về độ an toàn của các sản phẩm bia tươi
này.
2.5.2 Các chỉ tiêu khảo sát
 Định lượng vi sinh vật trong mẫu bằng phương pháp nuôi cấy
 Xác định vi khuẩn E. coli bằng các phản ứng sinh hóa cơ bản.
 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí
2.5.3 Các phương pháp phân tích
2.5.3.1 Kĩ thuật định lượng vi sinh vật
Tất cả các phương pháp định lượng vi khuẩn trong mẫu bằng phương pháp
nuôi cấy đều yêu cầu các tế bào phải được tách rời nhau, qua quá trình nuôi cấy các
tế bào này phát triển thành các dòng riêng biệt. Tất các qui trình định lượng bằng
phương pháp nuôi cấy nhằm chọn lọc một hay nhiều nhóm vi khuẩn nhất định nào
đó, mức độ chọn lọc phụ thuộc và từng qui trình qui trình cụ thể.
Để xác định tổng số vi sinh vật trong mẫu phải chọn qui trình giảm tối thiểu
khả năng chọn lọc. Nhưng dù mức độ chọn lọc ở mức tối thiểu cũng chỉ định lượng
được số lượng vi sinh vật có thể nuôi cấy. Còn một số lượng lớn vi sinh vật khác
không thể phát triển được trong quá trình nuôi cấy thì không thể định lượng được
bằng phương pháp này.
a. Phương pháp đếm khuẩn lạc

21


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI

ánh được số lượng tế bào vi khuẩn, mẫu phải được phân tán đều vào trong môi
trường hay trên bề mặt môi trtường rắn. Những đĩa có quá nhiều khuẩn lạc xuất

22


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

hiện thì không thể cho số lượng đếm chính xác bởi vì chúng có thể chồng lấp lên
nhau. Những đĩa có quá ít khuẩn lạc cũng phải bỏ đi vì theo nguyên tắc của xác
suất.
Những vấn đề chính yếu cần xem xét trong qui trình đếm khuẩn lạc là thành
phần môi trường, điều kiện và thời gian nuôi ủ. Môi trường để định lượng các vi
sinh vật dị dưỡng không thể cố định nitơ phải chứa các nguồn nitơ, carbon,
phosphate dễ sử dụng và các cation, anion cần thiết như sắt, mangie, calci, natri, clo
và sulphate. Thành phần của các hàm lượng không nhất định, chúng đặt thù cho
từng loại môi trường và từng loại mẫu nhất định để có thể nhận được số lượng vi
sinh vật mục tiêu cao nhất. Như vậy môi trường nuôi cấy phải có các thành phần
dinh dưỡng phù hợp với từng yêu cầu của loài vi sinh vật, bao gồm cả các nhân tố
cần thiết khác cho sự phát triển của một hệ vi sinh vật nhất định. Mục đích chung
của môi trường là hàm lượng dinh dưỡng phải cao hơn các thành phần có trong các
mẫu đang phân tích. Hàm lượng dinh dưỡng trong các loại môi trường đếm tổng số
vi sinh vật phải đủ cao, và độc tính của môi trường đối với sinh vật ở mức thấp
nhất.
Để nâng cao hiệu quả của qui trình định lượng vi sinh vật bằng phương pháp
đếm khuẩn lạc, các điều kiện cần phải điều chỉnh sao cho chỉ có các thành viên vi
sinh vật cần phát hiện theo định nghĩa được đếm. Các môi trường đếm đĩa được
chọn lọc hay phân biệt với các thành viên vi sinh vật khác. Qui trình đếm đĩa chọn
lọc được thiết kế cho thích hợp với sự phát triển của vi sinh vật mong muốn. Sự

sinh vật kháng kháng sinh cũng có thể được định lượng trên môi trường bằng cách
thêm vào đó một liều lượng kháng sinh.
Môi trường phân biệt được thiết lập dựa trên nhiều cách. Các thuốc thử được
thêm vào trong môi trường để cho phép nhận ra các sự khác biệt của những vi sinh
vật mong muốn. Có thể thêm thuốc thử vào môi trường sau khi nuôi cấy để nhận ra
các loài vi sinh vật đặc trưng cần tìm. Chìa khoá nâng cao khả năng phân biệt của
môi trường là qui trình nuôi cấy để cho phép môi trường phân biệt một cách tốt nhất
với vi sinh vật cần định lượng và các vi sinh vật khác có trong mẫu.
Môi trường Eosin methyl blue (EMB) và MacConkey agar là những môi
trường được sử dụng rộng rãi trong việc phân tích vi sinh vật trong nước. Những
môi trường này bao gồm tính chọn lọc và tính phân biệt. Chúng chọn lọc cho sự
phát triển của các vi khuẩn gram âm bởi trong đó có thêm vào các tác nhân ức chế
các vi khuẩn gram dương. Môi trường này có thể phân biệt các vi khuẩn có thể sử
dụng lactose bởi sự hình thành các khuẩn lạc có thể phân biệt bằng màu sắc. Trên
môi trường EMB, vi khuẩn thuộc nhóm coliforms là nhóm gram âm tạo nên những
khuẩn lạc có màu tím ánh kim. Định lượng số lượng coliform bằng cách đếm số

24


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

lượng khuẩn lạc có các đặc điểm này. Cách này thường xuyên được sử dụng trong
việc phân biệt các vi sinh vật chỉ thị trong nước và trong thực phẩm.
Với kỹ thuật đến khuẩn lạc, các mẫu cần phân tích phải được pha loãng thành
chuổi pha loãng liên tiếp và được xác định một vài nồng độ pha loãng nhất định để
cấy vào các môi trường đã chọn phù hợp với các đối tượng cần xác định. Mổi khuẩn
lạc được hình thành được gán cho một đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu-colony
forming units). Kỹ thuật thường qua các bước như sau:

Mỗi độ pha loãng chỉ được phép sử dụng 1 pippette. Các ống nghiệm chứa các độ
pha loãng khác nhau phải được đánh dấu để tránh nhầm lẫn.
- Đối với các mẫu rắn hay bán lỏng, các thao tác được tiến hành như sau: cân
10 g mẫu vào trong các bao dập mẫu hay các máy xay vô trùng, thêm 90ml dung
dịch pha loãng và đồng nhất mẫu, phải đảm bảo sao cho vi khuẩn phân tán đều vào
trong dung dịch. Sau khi mẫu và dung dịch pha loãng được đồng nhất ta được dung
dịch pha loãng 1/10. Các độ pha loãng sau được tiến hành tương tự như phần pha
loãng mẫu lỏng. Các ống nghiệm chứa các độ pha loãng khác nhau phải được đánh
dấu để tránh nhầm lẫn.
Cấy mẫu bằng phương pháp đổ đĩa
Các môi trường agar được đun chảy trong các chai hay trong các ống nghiệm
có thể tích phù hợp. Được làm mát trong các bể điều nhiệt ở 45 0C. Hút 1ml mỗi
dung dịch pha loãng cho vào trong đĩa petri vô trùng. Mỗi độ pha loãng thường
được cấy vào hai đĩa petri hay nhiều hơn. Cũng sữ dụng các pippette sạch cho mỗi
độ pha loãng. Chỉ chọn cấy vào đĩa petri những độ pha loãng có mật độ vi sinh vật
phù hợp, thường trong khoảng 25-300 tế bào/ml. Đỗ vào mỗi đĩa đã cấy 10-15ml
môi trường đã được đun chảy và làm nguội, lắc đĩa theo chiều và ngược chiều kim
đồng hồ khoảng 5-6 lần, đặc đĩa lên mặt phẳng ngang và đợi cho đến khi môi
trường trong đĩa đông đặc. Lật ngược đĩa và ủ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian
xác định.[10]
b. Phương pháp ước đoán số lượng vi sinh bằng kỹ thuật MPN (Most
Probable Number):
Phương pháp MPN là phương pháp có thể thay thế phương pháp đếm khuẩn
lạc để xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu, phương pháp này được dựa trên
nguyên tắc xác suất thống kê sự phân phân bố vi sinh vật trong các độ pha loãng
khác nhau của mẫu. Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại nhiều lần trong các môi
trường lỏng đã được chọn, thông thường phải cấy lặp lại từ 3-10 lần tại mỗi nồng độ
pha loãng. Các độ pha loãng được tiến hành sao cho trong các lần lặp lại có một số
lần cho dầu hiệu dương tính và một số lần cho dấu hiệu âm tính. Số lần lặp lại cho
dấu hiệu dương tính và âm tính được ghi nhận để đối chiếu với bảng thống kê sẽ

đó là nộng độ có tỉ số CPE là 50% trong các ống nghiệm.
Cũng giống như qui trình đếm đĩa, trong phương pháp MPN, môi trường và
nồng độ nuôi cấy cũng được điều chỉnh để chọn lọc cho một nhóm vi sinh vật hay
phân biệt các nhóm vi sinh vật này với các nhóm vi sinh vật khác với các đặc điểm
mong muốn, rỏ ràng rằng sự kết hợp giữa điều kiện nuôi cấy và môi trường cũng có
thể định lượng những nhóm vi sinh vật đặc biệt nào đó theo định nghĩa cụ thể. Mỗi

27