BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THUỲ ANH

NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI KETOCONAZOL VÀ
CLIMBAZOL TRONG DẦU GỘI ĐẦU
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THUỲ ANH
1401018

NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI KETOCONAZOL VÀ
CLIMBAZOL TRONG DẦU GỘI ĐẦU
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn :
1. GS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
2. TS. Lê Thị Hường Hoa
Nơi thực hiện:
Khoa Mỹ phẩm
Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương



1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

3

1.1.

TỔNG QUAN VỀ KETOCONAZOL

3

1.1.1. Đặc điểm chung

3

1.1.2. Ứng dụng của ketoconazol

3

1.1.3. Độc tính của ketoconazol

5

1.1.4. Sự đề kháng của vi khuẩn với ketoconazol và kháng sinh

6

1.1.5. Một số nghiên cứu về phân tích ketoconazol trong mỹ phẩm


SƠ LƯỢC VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC

13

1.3.1. Nguyên tắc của quá trình sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao

13

1.3.2. Cấu tạo máy HPLC

14

1.3.3. Ứng dụng HPLC

15

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

17

2.1.

HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ

17

2.1.1. Dung môi và hoá chất

17

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN

22

3.1.

22

KHẢO SÁT LỰA CHỌN CÁCH XỬ LÝ MẪU

3.1.1. Lựa chọn dung môi hoà tan mẫu

22

3.1.2. Cách chuẩn bị mẫu

22

3.2.

23

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

3.2.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký

23

3.2.2. Thẩm định phương pháp



38

3.4.4.

Về thẩm định phương pháp

39

3.4.5.

Về kiểm tra các mẫu dầu gội đầu lưu hành trên thị trường

40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

41


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AOAC

Hiệp hội các Nhà hoá học Phân tích Chính thức (Association of
Official Analytical Chemists)

ASEAN


EMA

Cơ quan Quản lý Thuốc Châu Âu (European Medicines Agency)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High – Performance Liquid
Chromatography)

ICH

Hội nghị Quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm sử
dụng cho con người (The International Council for Harmonisation)

IN

Indigo carmine

KCZ

Ketoconazol

LC

Sắc ký lỏng (Liquid Chromatography)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)



Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

UPLC

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (Ultra Performance Liquid
Chromatography)

UV

Tia tử ngoại (UltraViolet)

VIS

Bức xạ khả kiến (Visible)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

Trang

Bảng 1.1.

Tính chất của ketoconazol

3

Bảng 1.2.



Chuẩn bị các dung dịch chuẩn hỗn hợp

28

Bảng 3.4.

Kết quả khảo sát độ tuyến tính của CBZ và KCZ

28

Bảng 3.5.

Bảng 3.6.

Bảng 3.7.

Bảng 3.8.

Bảng 3.9.

Bảng 3.10.

Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với KCZ và
CBZ trên nền mẫu placebo 1 (P1)
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với KCZ và
CBZ trên nền mẫu placebo 2 (P2)
Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với KCZ và
CBZ trên nền mẫu thử M1 thêm chuẩn KCZ (M1K)
Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với KCZ và


Các mẫu dầu gội đầu lưu hành trên thị trường được sử dụng để
kiểm tra phương pháp xây dựng

Trang
18

a) Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn với hệ pha động methanol – dung
dịch amoni acetat 0,5% tỷ lệ 80:20 (v/v)
Hình 3.1.

b) Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn với hệ pha động methanol – dung
dịch amoni acetat 0,5% tỷ lệ 75:25 (v/v)

24

c) Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn với hệ pha động methanol – dung
dịch amoni acetat 0,5% tỷ lệ 70:30 (v/v)
Hình 3.2.
Hình 3.3.

Hình 3.4.
Hình 3.5.

Sắc ký đồ độ đặc hiệu với KCZ, CBZ trên nền dầu gội đầu
Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ
climbazol
Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ
ketoconazol
Sắc ký đồ thu được khi phân tích các mẫu dầu gội đầu

Mỹ phẩm ASEAN vào năm 2018, KCZ được liệt kê vào danh mục các chất bị cấm sử
dụng trong mỹ phẩm (với Số tham chiếu là 1380 trong Phụ lục II, phần 1) và CBZ
được liệt kê vào danh sách các chất bảo quản được phép sử dụng trong mỹ phẩm với
mức giới hạn hàm lượng 0,5% (Số tham chiếu là 32 trong Phụ lục VI, phần 1) [14]. Do
vậy nếu dầu gội đầu có chứa thành phần KCZ mà sản phẩm không được đăng kí dưới
dạng thuốc thì không được phép lưu hành.
Với mục đích đảm bảo an toàn cho người sử dụng, đồng thời cung cấp thông tin
và công cụ giúp các cơ quan có biện pháp quản lý phù hợp nhóm mặt hàng dầu gội, đề
-1-


tài: “Nghiên cứu định tính, định lượng đồng thời ketoconazol và climbazol trong
dầu gội đầu” được thực hiện nhằm 2 mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu xây dựng được quy trình phân tích ketoconazol và climbazol
trong dầu gội đầu bằng phương pháp HPLC.
2. Áp dụng phương pháp xây dựng để kiểm tra một số mẫu dầu gội đầu lưu
hành trên thị trường nhằm sơ bộ đánh giá việc sử dụng hai chất này trong các chế
phẩm cùng nhóm.

-2-


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ KETOCONAZOL
1.1.1. Đặc điểm chung
Tên khoa học: 1- acetyl - 4 - [4-[[(2RS, 4SR)-2-(2,4-dichlorophenyl)-2-(1H imidazol1-yl methyl)-1,3-dioxolan-4-yl] methoxy] phenyl] piperazin
Công thức phân tử: C26H28Cl2N4O4
Khối lượng mol: 531,43 g/mol.

[4], được ghi nhận là thuốc có hoạt phổ kháng nấm rộng, tác dụng trên nhiều loại nấm
gây bệnh, bao gồm các loại nấm bề mặt da, niêm mạc, nấm nội tạng và trên cả một số
vi khuẩn Gram (+) [7]. Do đó, KCZ thường được sử dụng với vai trò là hoạt chất
chống nấm trong các chế phẩm như kem bôi ngoài, viên nén, dầu gội đầu và một số
chế phẩm khác [3][4].
KCZ thường có tác dụng kìm hãm nấm nhưng thuốc cũng có thể diệt nấm ở
nồng độ cao và dùng kéo dài hoặc trên nấm rất nhạy cảm [4]
Cơ chế hoạt động của KCZ cũng như các dẫn chất azol chống nấm khác. KCZ
ức chế  - demethylase (thuộc hệ enzym Cytochrom P450) là enzym cần thiết cho quá
-3-


trình khử (demethyl hoá) các 14  - methyl sterol thành ergosterol (sterol chủ yếu của
màng tế bào nấm). Lượng ergosterol bị giảm sẽ làm thay đổi tính thấm và chức năng
của màng tế bào. Tác dụng diệt nấm của KCZ ở nồng độ cao có thể do tác dụng hoá lý
trực tiếp của thuốc trên màng tế bào nấm [4][7].
Ngoài ra, với đặc tính ức chế hệ enzym Cytochrom P450, KCZ còn được sử
dụng trong điều trị một số bệnh lý như: tăng calci máu, rối loạn nội tiết và u ác tính,
hội chứng Cushing... Dự phòng suy hô hấp cấp tính bằng KCZ ở những bệnh nhân có
nguy cơ mắc phải cao cũng được ghi nhận ở một số nghiên cứu [9].
Tính linh động của KCZ giúp thuốc được lưu hành trên thị trường dưới nhiều
dạng bào chế khác nhau, đưa tới sự đa dạng trong mục đích sử dụng của các chế phẩm:
- Thuốc dùng đường uống (viên nén, hỗn dịch) có tác dụng điều trị nhiễm nấm toàn
thân; các bệnh lý nấm tại chỗ (sau khi điều trị tại chỗ không hiệu quả) như bệnh nấm
Candida ở da, niêm mạc nặng, mạn tính; bệnh nấm Candida âm đạo mạn tính, nhiễm
khuẩn ở da và móng tay (trừ móng chân). Ngoài ra, thuốc còn có tác dụng dự phòng
bệnh nấm ở người có chức năng miễn dịch suy giảm [4].
- Thuốc dạng dùng ngoài (kem, gel, dầu gội đầu) có tác dụng điều trị và dự phòng các
bệnh lý nấm ở da và niêm mạc (do nấm Candida, Trichophyton rubrum, Malassezia
furfur…), bệnh lang ben, viêm da tiết bã nhờn hay các bệnh lý liên quan tới da đầu như

cho con người như sau [4][9][13]:
- Rối loạn đường tiêu hoá (chán ăn, buồn nôn, đau dạ dày, táo bón…) là tác dụng phụ
thường gặp nhất của KCZ và xuất hiện với tần suất cao hơn nếu tăng liều dùng của
thuốc. Nhiều nghiên cứu cũng ghi nhận tình trạng nhiễm độc gan ở các mức độ khác
nhau dẫn tới viêm gan, hoại tử gan khi sử dụng KCZ liều cao trong thời gian kéo dài.
Rối loạn nội tiết tố xảy ra ở cả 2 giới với liều cao kéo dài của thuốc và suy thượng thận
là tác dụng không mong muốn của KCZ được ghi nhận ngay cả khi sử dụng ở mức
liều thấp.
- Các tác dụng không mong muốn khác: các phản ứng quá mẫn trên da (nổi mề đay,
ngứa da, kích ứng da nơi bôi thuốc...), phản ứng phản vệ, tác động lên hệ thần kinh,
kích ứng mắt, giảm tiểu cầu, bạch cầu, tăng triglycerid máu, đau yếu cơ xương, rụng
tóc, lông…
KCZ (dạng đường uống) phân bố nhiều trong sữa mẹ, có khả năng qua được
nhau thai, do đó dạng chế phẩm này của thuốc được khuyến cáo là không nên sử dụng
trên phụ nữ đang trong thời kỳ mang thai và cho con bú. Mặc dù chưa có những
nghiên cứu đầy đủ về vấn đề sử dụng KCZ trên các đối tượng bệnh nhân đặc biệt, song
thuốc chỉ được sử dụng cho người mang thai khi lợi ích điều trị xác đáng hơn các nguy
cơ có thể gây ra cho thai nhi, đồng thời, tồn tại một số các nghiên cứu ghi nhận về mức
độ an toàn của việc sử dụng KCZ trong thời kỳ cho con bú [4][9].
Bên cạnh đó, dạng dùng ngoài của KCZ với mức hàm lượng tối đa 2% gần như
không tạo ra sự hấp thu toàn thân, do đó KCZ không được tìm thấy trong huyết tương
ngay cả khi sử dụng với một lượng lớn loại chế phẩm này, đảm bảo tránh được các tác
dụng bất lợi do thuốc gây ra [18][53]. Tuy nhiên, việc kiểm soát sử dụng các chế phẩm
dùng ngoài của KCZ trên các đối tượng bệnh nhân đặc biệt là cần thiết nhằm đảm bảo
an toàn cho người sử dụng [54].
Tình trạng kích ứng da, ngứa, rát, cảm giác bỏng nhẹ da đầu... là những tác
dụng bất lợi thường gặp khi sử dụng các chế phẩm dầu gội đầu ketoconazol 2%. Ngoài
-5-



với KCZ đã xuất hiện ở loài Candida albicans. Khi tiến hành nuôi cấy vi sinh từ các
mẫu bệnh phẩm thu được từ người bệnh, họ quan sát thấy trong môi trường thạch nuôi
cấy có sự xuất hiện của các tiểu quần thể “subpopulation” xảy ra ở cả những mẫu bệnh
phẩm của bệnh nhân chưa có sự phơi nhiễm với thuốc. Kết luận đưa ra chưa rõ ràng,

-6-


tuy nhiên, khoảng giá trị MIC có sự biến động trên một khoảng rộng được đánh giá là
có liên quan tới hiện tượng này [30].
Candida tropicalis được ghi nhận in vivo là có đề kháng với KCZ trong một
báo cáo ca lâm sàng của Hann và cộng sự về bệnh nhi 13 tháng tuổi có chứng loét da
sử dụng KCZ để điều trị nhưng không cho thấy hiệu quả [30].
Tình trạng đề kháng của vi khuẩn đối với KCZ được đánh giá là ít hơn so với
các azol khác (fluconazol, itraconazol…) do tính kém phổ biến trong ứng dụng điều
trị. Tuy nhiên, việc kháng chéo của vi khuẩn đối với KCZ và các azol khác được ghi
nhận ở nhiều nghiên cứu và xuất hiện ngày càng gia tăng [10][24][49].
Như vậy, đối diện với tình trạng đề kháng của vi khuẩn với các nhóm thuốc
kháng nấm và kháng sinh hiện nay, việc sử dụng các chế phẩm của KCZ cần được
quản lý và tuân thủ nghiêm ngặt.
1.1.5. Một số nghiên cứu về phân tích ketoconazol trong mỹ phẩm
 Định lượng ketoconazol trong dầu gội đầu bằng phương pháp HPLC [27]:
Cột LiChrospher® 100 RP-8 (150 mm × 4,6 mm, 5 µm); nhiệt độ cột: 20 ± 1oC.
Pha động: Hỗn hợp của monoisopropylamin – methanol (2:500) và amoni acetat –
nước (1:200 w/v) với tỷ lệ 7:3 (v/v). Dung dịch acid acetic được sử dụng để điều chỉnh
độ pH của pha động tới giá trị 5,5. Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. Detector UV, bước sóng
225 nm. Khoảng nồng độ tuyến tính: 60,0 – 480,0 µg/ml (R2 = 0,9998).
 Xét nghiệm vi sinh thành phần ketoconazol trong dầu gội đầu [45]:
Mẫu vi sinh vật: Candida albicans ATCC 10231.
Môi trường thạch: Sabouraud 2% (Merck).

Giới hạn phát hiện (LOD): 2,3 µg/ml. Giới hạn định lượng (LOQ): 6,9 µg/ml.
 Định lượng ketoconazol trong shampoo gel trị gàu chứa ketoconazol [2]:
Cột Apollo C18 (250 mm x 4,6 mm; 5m). Pha động: Hỗn hợp methanol - dung
dịch đệm phosphat pH 3,0 (65:35). Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu: 20
l. Detector UV, bước sóng 254 nm. Khoảng nồng độ tuyến tính: 50 – 500 g/ml
(R2= 0,999).
 Định lượng ketoconazol trong hệ tiểu phân nano lipid sử dụng qua da [6] bằng
phương pháp HPLC:
Hệ thống sắc ký Agilent Infinity 1260, cột Alltech C18 (250 × 4,6 mm; 5 m).
Pha động: Hỗn hợp methanol - dung dịch đệm phosphat pH 3,0 (65:35). Tốc độ dòng:
1,0 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu: 20 l; Detector UV, bước sóng 254 nm. Khoảng nồng
độ tuyến tính: 4 – 190 g/ml (R2 = 0,9998).
1.2. TỔNG QUAN VỀ CLIMBAZOL
1.2.1. Đặc điểm chung
Bảng 1.2. Tính chất của CBZ [16][20][39][58]
Một số tính chất

Thông số

Áp suất hơi (mmHg, 25 oC)

2,1.10-7

Nhiệt độ nóng chảy

96,8oC

Độ tan trong nước (21oC)

5,5 mg/l

[11][12]. Thời gian bán hủy (t1/2) ở nhiệt độ 50oC là 228,7 ngày, ở nhiệt độ 70oC là
140,6 ngày và ở nhiệt độ 90oC là 91,1 ngày [20].
Do cùng thuộc nhóm dẫn chất của imidazol, CBZ có cơ chế hoạt động tương tự
KCZ. CBZ ức chế  - demethylase (thuộc hệ enzym Cytochrome P450) là enzym cần
thiết cho quá trình khử (demethyl hoá) các 14 - methyl sterol thành ergosterol (sterol
chủ yếu của màng tế bào nấm). Lượng ergosterol bị giảm sẽ làm thay đổi tính thấm và
chức năng của màng tế bào, ảnh hưởng trực tiếp tới hoạt động của màng tế bào nấm
dẫn đến tác dụng chống nấm của CBZ [33].
Theo ghi nhận của Pople và cộng sự (2014), CBZ có khả năng điều chỉnh tính
biệt hoá của tế bào sừng (keratinocyte), thúc đẩy sự biểu hiện của các protein giàu prolin trong các tế bào sừng quan trọng. Ngoài ra, một báo cáo nghiên cứu in vitro của
Bhogal và cộng sự (2014) đã chứng minh tác dụng ức chế của CBZ trên các protease
trong tóc có liên quan đến đặc tính của sợi tóc [37].
CBZ có tác dụng tốt trên các loài nấm thuộc Malassezia spp., gồm M. globosa,
M. restricta và M. furfur, là các vi sinh vật đóng vai trò chính trong nguyên nhân gây
ra các bệnh về gàu ở người [25][40][41]. So sánh với các hoạt chất điều trị gàu hiệu
quả khác, nhiều nghiên cứu đã ghi nhận tính vượt trội trong tác dụng của CBZ [37].
Tháng 11 năm 1980, CBZ lần đầu tiên được cân nhắc đưa vào danh sách độc
chất bởi Hội đồng Quản lý Độc chất (PSC - Poisons Scheduling Committee). Tuy
nhiên, tới tháng 11 năm 1986, CBZ được đưa vào mục sửa đổi và cho phép xuất hiện
trong thành phần của mỹ phẩm với vai trò chất bảo quản ở mức hàm lượng tối đa 0,5%
theo khuyến cáo của Tiêu chuẩn Mỹ phẩm Úc (Australian Cosmetics Standards) bởi
-9-


Hội đồng Quản lý Thuốc và Độc chất (DPSC – Drugs and Poisons Scheduling Committee) [12].
Theo các cơ quan y tế của Úc, Hội đồng Phê duyệt Thuốc (MEC – Medicines
Evaluation Committee) đã cho phép sử dụng CBZ chỉ với mục đích ngoài da. Nồng độ
CBZ trong các sản phẩm chăm sóc đọng lại (leave – on products) có giới hạn tối đa là
0,5% và không quá 2% với các sản phẩm tẩy rửa (rinse – off products) [12].
Tuy nhiên, tại Việt Nam, quy định về nồng độ hoạt chất này trong mỹ phẩm vẫn


1.2.3.2. Độc tính trên các sinh vật khác
Một trong những đặc tính nổi bật của CBZ là độc tính của hợp chất này trên hệ
sinh thái [33]. Trong khoảng thời gian trở lại đây, các hoạt chất chống nấm trở thành
các nhân tố mới gây ra những hậu quả ô nhiễm vô cùng nghiêm trọng tới môi trường,
đặc biệt là môi trường thuỷ sinh. CBZ có độc tính rất mạnh với tảo và đậu lăng nước,
có khả năng gây rối loạn nội tiết, ảnh hưởng lớn tới các quá trình chuyển hoá và sản
xuất hormon ở cá [22][39].
Đối với các sinh vật trên cạn, do có khả năng ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng
hợp sterol và gibberellin - là các yếu tố quan trọng đảm bảo sự phát triển bình thường
của cây, CBZ có độc tính cao chủ yếu trên thực vật, làm chậm tốc độ tăng trưởng của
các loài cây nói chung và hệ thực vật bậc cao nói riêng [39].
CBZ gây kích ứng trên da ở chuột lang cái với nồng độ 10% và kích ứng nhẹ ở
loài thỏ trắng New Zealand ở mức nồng độ 0,5% [12].
Một số nghiên cứu về độc tính liều lặp lại của CBZ trên chuột cho thấy hiện
tượng men gan tăng ở mức liều từ 15 mg/kg cân nặng/ngày trở lên [12].
Kết quả thử nghiệm CBZ đường uống cho thấy tình trạng co giật, suy giảm khả
năng phối hợp vận động ở chuột phụ thuộc vào liều, ở thỏ và chó biểu hiện co giật
xuất hiện hạn chế hơn [43].
Ngoài Malassezia spp., Pityrosporum ovale cũng được ghi nhận là một trong
những tác nhân hàng đầu gây ra tình trạng viêm da tiết bã. Trong nhiều báo cáo nghiên
cứu cả in vivo và in vitro, CBZ được đánh giá là hoạt chất chống nấm có tác dụng tốt
trên loại vi khuẩn này [51].
1.2.4. Sự đề kháng của vi khuẩn với CBZ và kháng sinh
Mặc dù đã có nhiều báo cáo nghiên cứu đánh giá tích cực về khả năng chống
nấm hiệu quả của CBZ, hợp chất này cho đến nay vẫn chưa được đưa vào danh sách
các dược chất có hoạt tính. Do đó, việc sử dụng CBZ với vai trò chất bảo quản hoặc
hoạt chất trong các sản phẩm chăm sóc cá nhân rất dễ bị thiếu kiểm soát, dẫn đến tình
trạng gia tăng đề kháng của vi khuẩn đối với nhóm thuốc chống nấm cũng như một số
loại kháng sinh.

- Phương pháp HPLC:
Máy HPLC Shimadzu (bơm LC-10AD, detector UV-Vis SPD-10AV)
Cột LiChrospher® RP-8 (150 mm × 4,6 mm, 5 µm). Nhiệt độ cột: 20 ± 1oC
Pha động: Hỗn hợp monoisopropylamin – methanol (2:500) và amoni acetat –
nước (1:200) với tỷ lệ 7:3. Dung dịch acid acetic được sử dụng để điều chỉnh độ pH
của pha động tới giá trị 5,5. Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. Detector UV, bước sóng 225
nm.
Khoảng nồng độ tuyến tính: 60,0 – 480,0 µg/ml (R2 = 0,9797).
- Điều kiện của phương pháp vi sinh:
Mẫu vi sinh vật: Candida albicans ATCC 10231.
Môi trường thạch: Sabouraud 2%.
Dung dịch chuẩn: 25,0 mg chất chuẩn climbazol được hoà tan trong bình định
mức 25,0 ml với hỗn hợp các chất: 1,0 ml HCl 1N, 1,25 g dầu gội đầu climbazol 2%,
0,25 ml polysorbat 80 và methanol vừa đủ. Lọc và pha loãng với dung dịch đệm
KH2PO4 1N pH 6,0 thu được các mức nồng độ 20,0; 100,0 và 500,0 µg/ml.
- 12 -


Dung dịch mẫu: 1,25 g dầu gội đầu climbazol 2% được hoà tan trong bình định
mức 25,0 ml với hỗn hợp các chất: 0,25 ml polysorbat 80 và methanol vừa đủ. Lọc và
pha loãng với dung dịch đệm KH2PO4 1N pH 6,0 thu được các mức nồng độ 20,0;
100,0 và 500,0 µg/ml.
4 ống bằng thép không gỉ có kích thước đồng đều (đường kính trong 6 mm cao
10 mm), 2 ống thép chứa dung dịch mẫu, 2 ống thép chứa dung dịch chuẩn.
Nhiệt độ thực hiện: 37oC. Thời gian thực hiện: 18 giờ.
Khoảng nồng độ tuyến tính: 20 - 500 µg/ml (R2 = 0,9766). Độ chính xác của
phương pháp: RSD = 2,45%.
 Định lượng climbazol đọng lại trên da đầu từ các chế phẩm dầu gội trị gàu bằng
UPLC – MS/MS [15]:
Với mục đích đánh giá đồng thời độ nhạy cảm và hàm lượng của thành phần

Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký (sắc ký phân bố, sắc ký hấp
phụ, sắc ký trao đổi ion…).
Thực hiện quá trình sắc ký là đặt chất phân tích lên pha tĩnh ở đầu cột rồi cho
pha động liên tục đi qua. Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký là các tương tác:
giữa các chất phân tích với pha tĩnh; giữa các chất phân tích với pha động và giữa pha
tĩnh với pha động.
Mẫu phân tích được hòa tan trong pha động. Pha động có thể là một chất lỏng (có
thể ở trạng thái siêu tới hạn) hoặc chất khí được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và
không hòa lẫn vào pha tĩnh. Pha tĩnh được cố định trong cột. Các chất tan sẽ di chuyển
qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa: chất tan –
pha tĩnh – pha động. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau mà các thành phần của mẫu cần
phân tích sẽ được tách ra riêng biệt.
1.3.2. Cấu tạo máy HPLC
Do bản chất hóa học của các chất phân tích rất khác nhau nên có nhiều kỹ thuật
để tách định lượng bằng sắc ký lỏng. Tuy vậy, nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc ký
lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận được kết nối với nhau.
1.3.2.1. Hệ thống cấp pha động
Pha động thường được chứa trong bình thủy tinh. Có 2 cách sử dụng pha động:
- Đẳng dòng: thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký.
- Chương trình hóa dung môi: pha động là một hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là
2 – 4 dung môi được đựng trong các loại bình khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay
đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định. Có hai kiểu thực hiện chương
trình dung môi:
+ Chương trình dung môi áp suất thấp: các dung môi đựng trong các bình riêng.
Mỗi bình có van riêng lấy lượng dung môi xác định đưa vào bình hòa trộn, sau đó
dùng một bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu.
+ Chương trình dung môi áp suất cao: điểm khác chủ yếu là mỗi dung môi có
một bơm riêng, việc hòa trộn được thực hiện ở áp suất cao. Chương trình này có tốn
kém và cồng kềnh hơn với loại hòa trộn ở áp suất thấp. Tuy nhiên, nó có độ đúng và
độ lặp lại cao hơn.

- Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng
Bộ phận ghi tín hiệu gồm có máy ghi, máy phân tích, máy tính.
1.3.3. Ứng dụng HPLC
HPLC có 3 ứng dụng chính là định tính, định lượng và điều chế.
1.3.3.1. Định tính
Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu của chất phân tích cùng điều kiện sắc ký (pha
động, pha tĩnh, nhiệt độ) là những thông tin định tính giúp khẳng định sự có mặt của
chất phân tích trong mẫu. Với mẫu nhiều thành phần, việc định tính bằng quang phổ
thường gặp khó khăn. Do vậy, HPLC thường được sử dụng để phân tách các thành
phần trước khi phân tích bằng quang phổ hay bằng các nguyên tắc phát hiện khác.
1.3.3.2. Phân tích định lượng
- 15 -


Dữ liệu thực nghiệm dùng trong định lượng là chiều cao pic hoặc diện tích pic.
Chiều cao pic thường dễ đo, tuy nhiên chỉ dùng được khi pic hẹp, cân đối. Diện tích
pic được sử dụng phổ biến hơn và đảm bảo cho kết quả tin cậy.
Những phương pháp thường dùng trong phân tích sắc ký:
- Phương pháp chuẩn ngoại: tiến hành chạy sắc ký ở cả hai mẫu chuẩn và thử trong
cùng điều kiện. So sánh diện tích pic của mẫu thử với diện tích pic của mẫu chuẩn sẽ
tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử. Có 2 phương pháp:
+ Chuẩn hóa một điểm: chọn nồng độ mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ mẫu thử.
+ Chuẩn hóa nhiều điểm: xây dựng đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện
tích pic với nồng độ của chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính
toán nồng độ của chất cần xác định.
- Phương pháp thêm chuẩn: thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các chất chuẩn
tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi tiến hành xử lý mẫu và sắc ký
trong cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết của chất trong mẫu thử được tính dựa vào sự
chênh lệch nồng độ ΔC và sự tăng của diện tích pic ΔS.
- Phương pháp chuẩn nội: người ta chọn một chất chuẩn nội đưa vào trong mẫu phân