BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

TRẦN THỊ HỒNG

SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ
PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia
vesparium THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG, VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

TRẦN THỊ HỒNG

SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ
PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia

kiện cho tôi làm việc, hoàn thành các thủ tục giấy tờ và hoàn thiện các nội dung
trong nghiên cứu này.
Tôi trân trọng cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Công nghệ
Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và giúp đỡ tôi hoàn thành mọi
thủ tục cần thiết trong quá trình học tập.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn
bên cạnh động viên, giúp đỡ, chia sẻ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập,
nghiên cứu và hoàn thiện luận án của mình.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Tác giả

NCS. Trần Thị Hồng

i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một số kết quả
lần đầu tiên được công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành có uy tín với sự đồng
ý và cho phép của các đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019


Sơ lược về metagenomics............................................................................................ 14

1.3.

Chất ức chế protease (PIs)......................................................................................... 19

1.3.1.

Sơ lược protease................................................................................................................ 19

1.3.2.

Chất ức chế protease và phân loại.............................................................................. 20

1.3.3.

Cơ chế hoạt động của PIs............................................................................................... 25

1.3.4.

Ứng dụng của chất ức chế protease........................................................................... 28

1.3.5.

Tình hình nghiên cứu PIs từ vi sịnh vật liên kết với hải miên trong và
ngoài nước.......................................................................................................................... 31

1.4.

Hệ biểu hiện gen ngoại lai Escherichia coli và Pichia pastoris................35

2.2.1.

Phương pháp tách DNA metagenome của VSV liên kết hải miên.................43

iii


2.2.2.

Định danh hải miên bằng sinh học phân tử............................................................. 43

2.2.3.

Phân tích dữ liệu metagenomics.................................................................................. 43

2.2.4.

Tổng hợp gen PIs từ CSDL metagenomics hải miên và thiết kế
plasmid mang gen PIs..................................................................................................... 47

2.2.5.

Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ
biểu hiện E. coli (DE3)................................................................................................... 48

2.2.6.

Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ
biểu hiện nấm men Pichia pastoris........................................................................... 49



3.3.

Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên kết
hải miên Spheciospongia vesparium QT2 biển Quảng Trị, Việt
Nam bằng tin sinh học................................................................................................. 56

3.3.1.

Lắp ráp reads của DNA metagenome........................................................................ 56

3.3.2.

Kết quả dự đoán gen........................................................................................................ 58

3.3.3.

Kết quả chú giải và phân loại chức năng gen......................................................... 60

3.3.4.

Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia
vesparium QT2 biển Quảng Trị

3.3.5.

64

Khai thác gen có hoạt tính ức chế protease (PIs) dựa trên cơ sở dữ
liệu (CSDL) metagenomics71

Tinh sạch protein tái tổ hợp PI-QT trong E. coli và nhận diện bằng
khối phổ................................................................................................................................ 87

3.4.6

Thử hoạt tính ức chế của protein tái tổ hợp PI-QT với protease.....................89

3.5.

Nghiên cứu biển hiện ức chế protease (PIs) trong hệ nấm men
Pichia pastoris................................................................................................................... 91

3.5.1.

Tạo plasmid pPIC9 mang gen PI-QT........................................................................ 91

3.5.2.

Tạo dòng tế bào Pichia pastoris SMD1168 mang gen PI-QT......................... 92

3.5.3.

Biểu hiện gen PI-QT trong nấm men P. pastoris SMD1168............................ 93

3.5.4.

Kết quả thử hoạt tính ức chế của protein PI-QT biểu hiện trong nấm
men......................................................................................................................................... 96

3.5.5.


Amp

Ampicillin

BLAST
bp, kb, kDa
CFU

Basic Local Alignment Search Tool
Base pair, Kilo base, Kilo dalton
Colony forming units

CSDL

Cơ sở dữ liệu

CTAB

Cetyl trimêtylamôni brômua

ĐC

Đối chứng

DN

Đà Nẵng

DNA


High microbial abundance

IAA

3-Indolebutyric acid

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

KH&CN
LB:

Khoa học và Công nghệ
Luria-Bertani

LMA

Low microbial abundance

mRNA

Messenger RNA

NCBI

National Center for Biotechnology Information

P. pastoris


TAE

Tris-Acetic-EDTA

Taq polymerase

Polymerase Thermus aquarius

TBS

Tris-buffered saline

TE

Tris- EDTA

TFA

Axit trifluoroacetic

TQ

Trung Quốc

VSV

Vi sinh vật

vii


Bảng 3.5.

Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia
vesparium QT2 theo giới và ngành................................................................. 65

Bảng 3.6.

Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia
vesparium QT2 đến lớp và bộ........................................................................... 66

Bảng 3.7.

Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia
vesparium QT2 đến họ; chi................................................................................ 68

Bảng 3.8.

Kết quả sàng lọc các gen có hoạt tính protease inhibitor từ
CSDL metagenomics QT2.................................................................................. 71

Bảng 3.9

Gen có hoạt tính sinh học mới (so với ở Việt Nam).................................. 73

Bảng 3.10

So sánh hoạt tính ức chế protease của protein PI-QT tinh sạch
thu hồi biểu hiện trong P. pastoris SMD1168 và E. coli
BL21(DE3)............................................................................................................. 106

Hình 1.7.

Một vài họ PPI quan trọng............................................................................. 23

Hình 1.8.

Ức chế cạnh tranh (Competitive inhibitor).............................................. 26

Hình 1.9.

Cơ chế ức chế không cạnh tranh kiểu thứ II............................................ 27

Hình 1.10.

Serpin ức chế protease..................................................................................... 28

Hình 2.1.

Cấu trúc vectơ pET-32a(+)............................................................................. 38

Hình 2.2.

Cấu trúc vectơ pPIC9....................................................................................... 39

Hình 3.1.

Điện di đồ sản phẩm tách DNA của vi sinh vật liên kết hải
miên biển Quảng Trị......................................................................................... 54

Hình 3.2.


Hình 3.10.

Phân loại vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia
vesparium QT2 theo giới và ngành............................................................. 66

Hình 3.11.

Phân loại vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia
vesparium QT2 biển Quảng Trị theo chi.................................................. 69

Hình 3.12.

So sánh trình tự axít amin của protein PI-QT với các trình tự
tương đồng trên cơ sở dữ liệu NCBI.......................................................... 76

Hình 3.13.

Mối phát sinh quan hệ gen của protein PI-QT với các serpin

ix


khác. (B) Cấu trúc protein của PI-QT đã được dự đoán bằng
SWISS-MODEL. (C) Cấu trúc protein của PI-QT đã được dự
đoán bằng (PS)2-v2.......................................................................................... 77
Hình 3.14.

(A) –Gel agarose của vectơ cắt bằng EcoRI/NotI, (B) – Gel
agarose của plasmid tái tổ hợp ([pET-32a(+)/PI-QT]) được cắt

Sử dụng đệm đẩy cột imidazole 100 mM, 250 mM, 300 mM,
500 mM................................................................................................................. 86

Hình 3.21.

Kết quả Western blot và kết quả loại bỏ đuôi dung hợp TRxHis-tag ra khỏi protein PI-QT bằng thrombin trên gel SDSPAGE 12.6 %...................................................................................................... 88

Hình 3.22.

Thử nghiệm hoạt tính ức chế protein tái tổ hợp PI-QT đối với
Trypsin và Elastase trên đĩa thạch............................................................... 90

Hình 3.23.

Thử nghiệm hoạt tính ức chế protein tái tổ hợp PI-QT đối với
ɑ-Chymotrypsin trên đĩa thạch..................................................................... 90

Hình 3.24.

Điện di đồ trên gel agarose 1 % sản phẩm cắt mở vòng vectơ
pPIC9 (a) và cắt kiểm tra plasmid [pPIC9/PI-QT]............................... 91

Hình 3.25.

Điện di đồ trên gel agarose 1% sản phẩm cắt kiểm tra plasmid
pPIC9/PI-QT và sản phẩm PCR bằng cặp mồi AOX1........................ 92

Hình 3.26.

Kết quả kiểm tra kiểu hình và kiểu gen nấm men mang gen PIQT............................................................................................................................ 92

Điện di SDS-PAGE 12,6 % đồng trùng hợp với cơ chất casein
0.1 % và xử lý bằng enzyme trypsin.......................................................... 98

Hình 3.33.

Khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo protein
PI-QT (mg/L) trong nấm men P. pastoris................................................ 99

Hình 3.34.

Khảo sát nhiệt độ biểu hiện của P. pastoris SMD 1168
[pPIC9/PI-QT].................................................................................................... 100

Hình 3.35.

Khảo sát pH trong quá trình biểu hiện

P. pastoris SMD

1168[pPIC9/PI-QT].......................................................................................... 102
Hình 3.36.

Nồng độ methanol cảm ứng trong biểu hiện P. pastoris tái tổ
hợp........................................................................................................................... 103

Hình 3.37.

Điện di SDS – PAGE 12,6 % protein PI-QT qua màng cut off
30 kDa và qua cột sắc ký ái lực Trypsin-Sepharose 4B...................... 105


LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2020


1
MỞ ĐẦU
Chất ức chế protease (PI), một tác nhân có thể làm cho protease mất khả
năng thủy phân protein thành peptide được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đặc biệt
là trong y dược như: điều trị kháng phân hủy sợi huyết (antifibrinolytic); ức chế
angiotensin trong điều trị tăng huyết áp; ngăn chặn sự nhân lên của một số virus
(HIV, viêm gan C…. Ví dụ về các thuốc ức chế protease là saquinavir (tên thương
hiệu: Invirase) và ritonavir (tên thương hiệu: Novir) được sử dụng chủ yếu trong
điều trị HIV/AIDS. Chúng được dùng như một phần của một loại cocktail đa thuốc
và đã được chứng minh là có khả năng làm giảm đáng kể mức độ virus HIV trong
máu.
Vì vậy, việc sàng lọc và phát hiện các phân tử protein mới có hoạt tính ức chế
đặc hiệu các protease đích khác nhau, liên quan đến các loại bệnh là một hướng
nghiên cứu được quan tâm hiện nay. Hải miên và các vi sinh vật liên kết với hải
miên được xem là một nguồn để phát hiện và khai thác các hợp chất có hoạt tính
sinh học mới phục vụ chế tạo thuốc, các peptide có hoạt tính ức chế protease là một
trong số đó. Tuy nhiên, phần lớn các vi sinh vật liên kết hải miên thuộc loại không
nuôi cấy được nên hạn chế khả năng khai thác chúng. Nhờ kỹ thuật metagenomic,
với sự hỗ trợ của thiết bị giải trình tự gen hiệu năng cao và công cụ tin sinh cho
phép phát hiện các gen, cụm gen có chức năng mã hóa cho các PI, cho phép khai
thác được các PI từ các vi sinh vật chưa nuôi cấy được.
Đến nay tại Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về hải miên, từ việc phân
lập vi sinh vật trên hải miên, đến tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ nhóm
vi sinh vật này. Tuy nhiên, vẫn còn chưa có nghiên cứu nào sử dụng công cụ
metagenomics và công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới để phát hiện, sàng lọc các

và P. pastoris. Hoạt tính ức chế protease của protein biểu hiện đã được đánh giá
và kết quả thu được cho thấy protein PI-QT tái tổ hợp từ E. coli có hoạt tính ức
chế trypsin, ức chế ɑ-chymotrypsin và protein từ P. pastoris thể hiện hoạt tính ức
chế trypsin, ɑ-chymotrypsin và thermolysin.


3

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Hải miên và vi sinh vật liên kết hải miên
1.1.1. Giới thiệu về hải miên
Hải miên là một ngành động vật đa bào nguyên thủy, có cấu trúc tế bào tách
biệt và là nhóm động vật sống bám, tuy nhiên một số loài có khả năng vận động nhờ
vào tế bào chất hay roi. Hải miên có thể sống trong các loại môi trường khác nhau ở
biển và trong tất cả các vùng khí hậu. Từ các vùng cực và ôn đới, đến hệ sinh thái
rạn san hô nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tính đến năm 2019, khoảng 9.125 loài hải
miên nói chung được chấp nhận có trong danh sách của Cơ sở dữ liệu hải miên thế
giới (Http://www.marinespecies.org). Vì vậy, các quần thể hải miên có sự khác biệt
về sự đa dạng, sự phong phú và mật độ. Các loài hải miên được chia thành 4 lớp:
Calcarea (hải miên đá vôi), Demospongia (demosponges), Hexactinellida (hải miên
thủy tinh), và Homoscleromorpha. Lớp lớn nhất là Demospongia, gồm khoảng 83,4
% tất cả các loài được biết. Trong số các loài hải miên được biết đến, chỉ có khoảng
250 loài là sống trong nước ngọt (van Soest et al., 2012).
Hải miên có các hình dạng khác nhau, từ hình cầu, hình ống, hình bình hoặc
phân nhánh và kích thước cũng khác nhau, từ một vài milimet (hải miên Cliona
celata), đến vài mét (hải miên Xestospongia muta). Phần lớn hải miên là động vật
ăn lọc, trừ các loài ăn thịt cư trú ở môi trường biển sâu nghèo dinh dưỡng (Lee et
al., 2012). Hình dáng cơ thể chung của loài ăn lọc được chuyên môn hóa cho lọc
nước để lấy dinh dưỡng, hô hấp và bài tiết. Phụ thuộc vào thiết kế của hệ thống lọc
nước, hải miên được chia thành: (1) Asconoid, khi cơ thể hải miên có hình trụ rỗng,

Thành phần hóa học, sự khác biệt cấu trúc và kích thước gai là các đặc điểm
hình thái quan trọng để phân loại hải miên. Lớp Demospongia và
Homoscleromorpha

có sợi collagen

hoặc

các

gai

hoặc

cả

hai.

Lớp

Homoscleromorpha cũng có đại diện không có gai nhưng có sợi collagen. Lớp hải
miên đá vôi và hải miên thủy tinh có canxi hoặc silic, tương ứng (van Soest et al.,
2012).
Là loài ăn lọc, hải miên xử lý hàng trăm lít nước biển một ngày, vì vậy thức
ăn của chúng bao gồm VSV, sinh vật nhân chuẩn nhỏ, các hợp chất hữu cơ nhỏ...
(de Goeij et al., 2013). Thức ăn được tế bào roi và lớp bề mặt của hải miên bắt giữ,
và chuyển đến các tế bào mô liên kết và tiêu hóa bởi tế bào khởi thủy
(archaeocytes). Tiếp theo, các sản phẩm của thức ăn đã được tiêu hóa được phân bố
đến các tế bào mô liên kết khác và cuối cùng các thứ không được tiêu hóa và sản
phẩm bài tiết được trục xuất ra khỏi hải miên thông qua các kênh thở ra (exhalant)


Gemmatimonadetes,

Nitrospirae, Proteobacteria (Alpha-, Beta-, Gamma-, và Delta-), Planctomycetes,
Verrucomicrobia, và Poribacteria (Hentschel et al., 2012). Từ nghiên cứu giải trình
tự thông lượng cao về quần xã VSV liên kết hải miên, số lượng ngành VSV trong
một hải miên tăng từ 23 ngành (Webster et al., 2010) lên đến 47 ngành (Reveillaud
et al., 2014). Theo số liệu mới nhất gần đây, hơn 60 ngành VSV đã tìm được từ các
mẫu hải miên biển theo phân loại của Silva và hơn 70 ngành theo phân loại của
Greengenes (Moitinho-Silva et al., 2017). Nhìn chung, VSV liên kết hải miên có
các loại tương tác khác nhau, có lợi hoặc có hại, từ việc là nguồn thức ăn, ký sinh,
gây bệnh, đến hỗ sinh và hội sinh (Hình 1.3) (Taylor et al., 2007; Lafi et al., 2009).
Vi khuẩn liên kết hải miên được chia ra thành các nhóm: vi khuẩn quang
hợp, vi khuẩn dị dưỡng, cổ khuẩn oxi hóa ammonia. Ba loại liên kết rộng rãi của vi
khuẩn với hải miên gồm: (1) Lượng lớn các quần thể vi khuẩn đặc hiệu hải miên
trong mô liên kết hải miên; (2) Các quần thể nhỏ vi khuẩn bên trong tế bào riêng
biệt; (3) Các quần thể vi khuẩn không đặc hiệu giống với các quần thể trong môi
trường nước xung quanh (Mares et al., 2017).
VSV nhân chuẩn là một trong những thành phần quan trọng và đa dạng của
các hệ sinh thái biển; tuy nhiên, chúng được đánh giá thấp so với các VSV khác.
Trong hải miên, chủ yếu là thấy nấm men. Trái ngược với các cộng đồng vi khuẩn
liên kết với hải miên, các nghiên cứu về sự liên kết giữa nấm và hải miên vẫn còn
rất khiêm tốn (Rodríguez-Marconi et al., 2015; Naim et al., 2017). Các sinh vật
nhân chuẩn khác như "SAR" - một nhánh bao gồm Stramenopiles, Alveolates và
Rhizaria cũng đã được phát hiện trong hải miên (Burki el al., 2007; Webster et al.,
2004; Sipkema & Blanch., 2009). Tuy nhiên, cộng đồng các VSV nhân chuẩn


7
dường như không cộng sinh chặt chẽ với hải miên (Rodríguez-Marconi et al.,


8
VSV nhân sơ
(Prokaryotes)

Vai trò

Liên kết

Khử

VSV nhân
chuẩn
(Eukaryotes)

Vai trò

Tảo (algae)

nitơ,
bảo vệ

Polychaetes

Nguồn
thức ăn

sulphate

Oxy hóa

(Mangroves)

Giảm

Cổ khuẩn
(Archae)

nhiễm
bệnh

Hình 1.3.Vai trò của vi sinh vật với hải miên
(Nguồn: Lafi et al., 2009)
Sự phong phú, đa dạng và đặc hiệu của vi sinh vật liên kết hải miên
VSV liên kết hải miên thường cư trú ở vùng ngoại bào, nơi chúng tập trung
xung quanh các tế bào roi, các vòng của các tế bào roi tạo thành hệ thống dẫn nước
của hải miên (Hình 1.2). Dựa vào mật độ VSV liên kết, hải miên được chia thành
9

loài có mật độ liên kết cao (high microbial abundance: HMA), có tới 10 tế bào/cm

3

mô hải miên, và loài có mật độ VSV liên kết thấp (low microbial abundance: LMA)
5

6

3

với 10 -10 vi khuẩn/cm mô và vùng mô liên kết chỉ có rất ít VSV (Gloeckner et

12 triệu trình tự 16S rRNA ngắn từ Dự án giải trình tự thông lượng cao của Tổng
cục điều tra Quốc tế về VSV biển (International Census of Marine Microbes ICoMM; Http://icomm.mbl.edu/) đối với 173 cụm trình tự đặc hiệu hải miên của
Simisterel al. (2012) cho thấy, rất nhiều VSV đặc hiệu hải miên cũng có mặt trong
các hệ sinh thái biển khác, nhưng với số lượng cực ít. Webster et al. (2010) sử dụng
giải trình tự thông lượng cao 16S rRNA để nghiên cứu đa dạng và sự phong phú của
quần xã VSV liên kết 3 loài hải miên (Ianthella basta, Ircinia ramosa và
Rhopaloeides odorabile) từ biển Đông Bắc, Australia. Kết quả nhận được cho thấy
đơn vị phân loại vi khuẩn có đa dạng ngành cao (n=23) trong 3 loài hải miên nghiên
cứu. Các trình tự nhận được rơi vào 33 cụm đặc hiệu hải miên, với hầu như một nửa
số cụm chỉ liên quan đến vật chủ. Bằng cách ứng dụng 16S rRNA giải trình tự thông
lượng cao cho 32 loài hải miên (˃ 90 mẫu vật) từ 8 địa điểm của vùng nhiệt đới và
ôn đới phân bố trên toàn cầu, Schmitt el al. (2012) mô tả 3 trạng thái chung của các
cộng đồng VSV liên kết hải miên: (1) cộng đồng lõi nhỏ; (2) cộng đồng bất định và
(3) nhóm lớn đặc hiệu hải miên (Hình 1.4).
Các cộng đồng VSV liên kết hải miên dường như tương đối ổn định và có
thay đổi theo vật chủ hoặc đặc hiệu loài theo không gian, thời gian. Những nghiên
cứu luân chuyển loài của các cộng đồng VSV liên kết hải miên theo thời gian


10
(Hardoim & Costa., 2014), không gian (Reveillaud et al., 2014) cũng như các môi
trường khác nhau (Cardenas et al., 2014) nhấn mạnh rằng các cấu trúc cộng đồng
VSV nói chung là đặc hiệu loài. Ngược lại, sự khác biệt theo chiều dọc (độ sâu) và
chiều ngang (địa sinh học) có vẻ chỉ có ảnh hưởng nhỏ lên các kiểu cộng đồng.
Nhưng ảnh hưởng của gradients môi trường tự nhiên cục bộ (ví dụ, độ sâu, mật độ
dinh dưỡng, độ mặn hoặc gradients ánh sáng) hoặc tổ hợp các nhân tố lên quần xã
VSV hải miên được nghiên cứu ít toàn diện hơn, chỉ có một vài nghiên cứu đặc biệt
tập trung vào các ảnh hưởng cụ thể này (Cardenas et al., 2014).

Hình 1.4. Ba trạng thái liên kết chung của VSV và hải miên

thể có hại trong trường hợp hải miên bị phân tán đến môi trường không thuận lợi
cho VSV liên kết. Trong khi chọn lọc tự nhiên dường như có lợi cho vật chủ khi có
được VSV cộng sinh từ môi trường tự nhiên, nhưng cũng đồng thời có hại bởi có
thể các nguồn bệnh có cơ hội nhiễm vào hải miên (Hentschel et al., 2012).

Hình 1.5. Ba cách truyền và thu nhận VSV để thiết lập và duy trì các cộng
đồng VSV liên kết hải miên
(Nguồn: Hentschel et al., 2012).