[Type text] [Type text] [Type text]
Trường Đại Học Kỹ Thuật – Công Nghệ TP.HCM
Khoa Công Nghê Thực Phẩm

Đề tài:
-Tp.HCM tháng 11/2011-
Mục lục
Chương 1 : Tổng quan..............................................................................................4
[Type text] Page 1
[Type text] [Type text] [Type text]
I. Sơ lược về vi khuẩn E.coli......................................................................................4
1. Đặc điểm sinh học..................................................................................................4
1.1 Hình thái................................................................................................................4
1.2 Tính chất nuôi cấy..................................................................................................4
1.3 Tính chất hóa sinh..................................................................................................5
1.4 Kháng nguyên........................................................................................................6
1.5 Phân loại................................................................................................................6
2. Khả năng gây bệnh................................................................................................7
3. Chẩn đoán vi sinh vật............................................................................................12
3.1 Chẩn đoán trực tiếp................................................................................................12
3.2 Chẩn đoán gián tiếp................................................................................................12
4. Nguyên tắc điều trị và phòng bệnh.......................................................................13
4.1 Điều trị...................................................................................................................13
4.2 Phòng bệnh.............................................................................................................13
Chương II : Các phương pháp phát hiện E.coli......................................................14
I. Phương pháp truyền thống....................................................................................14
1. Định lượng E.coli bằng phương pháp MPN........................................................14
1.1 Nguyên tắc.............................................................................................................14
1.2 Quy trình phân tích.................................................................................................14
1.3 Cách đọc kết quả....................................................................................................15
2. Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc........................................15

[Type text] [Type text] [Type text]
Chương I: TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI
I. SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI (E.COLI)
Escherichia coli do Theodore Escherich
(1857-1911), một nhà vi khuẩn học người Áo, phát
hiện lần đầu tiên năm 1885. Chi Escherichia thuộc họ
vi khuẩn đường ruột. Trong các loài thuộc chi này,
E.coli được chọn làm điển hình và có vai trò quan
trọng nhất trong y học.
E.coli là một trong những thành viên chính của
hệ vi khuẩn bình thường ở ruột nhưng cũng là căn
nguyên của nhiều bệnh nhiễm trùng, trong đó có
những bệnh nó là căn nguyên đứng đầu.
E.coli đã được sử dụng làm mô hình nghiên
cứu về sinh học phân tử trong lĩnh vực vi sinh học nói riêng và sinh học nói chung.
[Type text] Page 4
Hình 1.1: Hình chụp vi khuẩn E.coli
dưới kính hiển vi với kích thước 2 µm
[Type text] [Type text] [Type text]
E.coli K12 là vi khuẩn được sử dụng làm mô hình nghiên cứu nhiều nhất. nhiều thành
tựu về di truyền học, hóa sinh học đã được thu trên cơ sở nghiên cứu vi khuẩn này.
Ngày nay E.coli cũng được sử dụng nhiều trong công nghệ sinh học.
Mặc dù E.coli là loài vi khuẩn được nghiên cứu sâu nhất, cho đến nay nó vẫn tiếp
tục được quan tâm nghiên cứu, với rất nhiều phát hiện mới ở tầm phân tử, đặc biệt cơ
chế bệnh sinh của các type gây bệnh (pathotype).
1. Đặc điểm sinh học
1.1 Hình thái
E.coli là trực khuẩn Gram âm. Kích thước trung bình từ 2 đến 3µm x 0,5µm;
trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ như trong môi trường có kháng sinh) vi
khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E.coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có

2
S. Không sử dụng được nguồn
carbon của citrate trong môi trường Simmons. Có decarboxylase, vì vậy có khả năng
khử carboxyl của lysine, ornithin, arginin và acid glutamic. Betagalactosidase dương
tính. Thử nghiệm VP (Voges Proskauer) sau 24 giờ âm tính, sau 48 giờ có thể dương
tính.
Bảng 1.1: Tính chất hóa sinh của một số loài thuộc chi Escherichia
Thử nghiệm
Các loài
E.coli
(bình
thường)
E.coli
(inactive
)
E.blatta
e
E.fergus
onii
E.herma
nnii
E.vulneri
s
E.alberti
i
CNPG + T - T + + -
Indole + T - + + - -
Đỏ methyl + + + + + + ?
Voges-
Proskauer

ONPG: Ortho-nitrophenyl-beta-Dgalactopyranoside
+: >90% dương tính -: < 10% dương tính.
T: 10-90% dương tính
1.4. Kháng nguyên
[Type text] Page 6
[Type text] [Type text] [Type text]
Kháng nguyên O: người ta đã biết tới gần 160 yếu tố kháng nguyên O của E.coli.
Kháng nguyên K: Khoảng 100 yếu tố kháng nguyên K đã được xác định và được
chia thành ba loại: A, B và L, trong đó A dưới dạng vỏ quan sát được bằng kính hiển vi
quang học thông thường, B và L dưới dạng màng rất mỏng chỉ có thể quan sát được nhờ
kính hiển vi điện tử.
Kháng nguyên H: hơn 50 yếu tố kháng nguyên H đã được xác định.
1.5 Phân loại
Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E.coli được chia thành các type huyết thanh.
Với sự tổ hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều type huyết thanh
khác nhau. Mỗi type huyết thanh được ký hiệu bằng kháng nguyên O và K, ví dụ
O86B7 (yếu tố kháng nguyên O số 86, yếu tố kháng nguyên K số 7 loại B).
Dựa vào vị trí gây bệnh các E.coli có khả năng gây bệnh ở người được chia thành
2 nhóm: thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC-intestinal pathogenic E.coli) hay
E.coli gây tiên chảy (DEC-Dierrheagenic E.coli), thứ hai là nhóm gây bệnh ngoài
đường ruột (ExPEC-extraintestinal pathogenic E.coli).
- Các loại E.coli gây bệnh đường ruột (IPEC) đã được biết gồm:
EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột
ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột
EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập ruột
EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli ngưng tập ruột
DAEC (Diffusely adherent E.coli): E.coli bám dính phân tán
EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): E.coli gây xuất huyết ruột
- Hai loại E.coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là:
MAEC (Meningitidis-associated E.coli): E.coli gây viêm màng não

enzyme adenylate cyclase làm tăng AMP vòng (cAMP-cyclic adenosine
monophosphate), dẫn đến làm giảm hấp thu Na
+
, tăng tiết Cl
-
. Hậu quả của quá trình này
là áp lực thẩm thấu trong lòng ruột tăng, nước được kéo từ tế bào ra lòng ruột gây tiêu
chảy.
Độc tố chịu nhiệt ST có trọng lượng phân tử xấp xỉ 5000 Dalton. ST tác động
lên ruột bằng sự hoạt hóa enzyme guanylate cyclase làm tăng GMP vòng (cGMP-cyclic
guanosine monophosphate). GMP vòng gây rối loạn chuyển hóa nước và điện giải giống
như AMP vòng. ST còn làm mất hoặc làm teo một phần nhung mao của tế bào biểu mô
ruột. Người ta đã nói đến ST-I và ST-II. ST-I gồm ST-Ia và ST-Ib. Hầu hết các chủng
sản xuất ra ST-Ib phân lập được từ người, còn ST-Ia thì hầu hết từ động vật hoặc các
thức ăn có nguồn gốc động vật. Chưa gặp các chủng sinh ST-II gây tiêu chảy ở người.
Tiêu chảy do ETEC thường khởi phát đột ngột, phân toàn nước không có nhày,
máu.
 EIEC-Ecoli xâm nhập ruột
[Type text] Page 8
[Type text] [Type text] [Type text]
EIEC gây bệnh chủ yếu do khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại tràng. Khả
năng xâm nhập được mã hóa bởi gen trên plasmid 140MDa. Các gen trên plasmid này
mã hóa cho các kháng nguyên xâm nhập (IpaA đến IpaD, Ipa-Invasion plasmid antigen).
EIEC cho kết quả (+) tính trong thử nghiệm khả năng gây viêm kết giác mạc chuột lang
(thử nghiệm Sereny). EIEC còn có khả năng sản xuất độc tố ruột giống một số Shigela.
Gen mã hóa cho độc tố này có tên là sen (Shigella enterotoxin). Cơ chế gây bệnh giống
vi khuẩn lỵ. Vì vậy trong y văn hiện nay viết căn nguyên gây bệnh lỵ trực khuẩn
(bacillary dysentery) gồm Shigella và EIEC. EIEC xâm nhập vào trong tế bào biểu mô
đại tràng, làm tiêu các túi thực bào và nhân lên trong bào tương, phá hủy tế bào rối mới
xâm lấn sang các tế bào khác. Tổn thương nhất chính là viêm loét hoại tử niêm mạc đại

Mã hóa BFP (bundle-forming pilus),
Per (plasmid-encoded regulator) và Ler
(LEE-encoded regulator. PAI nhiễm
Bám dính tại chỗ nhờ
BFP
Tổn thương mô A/E
Các tổn
thương A/
E
[Type text] Page 9
[Type text] [Type text] [Type text]
sắc thể (LEE)
TTSS gồm: intimin (eaeA), các protein
tiết; Tir, EspA, EspB, EspD, EspF,
EspG và MAP (mitochondria-
associated protein)
EAST-1
CDT (Cytolethal distending toxin)
Tiêu chảy
cấp
ETEC
ETEC
Các CFA mã hóa bởi plasmid: CFA-I
(fimbriae cứng), CFA-III (tạo bó),
CFA-II và CFA-IV (fimbriae mềm) và
pili dài liên quan với type IV
Độc tố chịu nhiệt LT I và LT II (mã
hóa bởi plasmid)
Độc tố vững bền với nhiệt STa và STb
(mã hóa bởi plasmid và transposon)

tràng, nhân lên gây
viêm loét hoại tử niêm
mạc đại tràng
Hội chứng
lỵ trực
khuẩn
EAEC
Điểm bám dính kết tập AAF
(aggregative adhesion fimbriae)
Yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggr
Protein pet
Độc tố EAST-1 (enteroaggregative
heat-stable toxin-1)
Protein làm tan máu và mất thăng bằng
vận chuyển ion qua màng
AAF tạo nên kiểu bám
dính hình chồng gạch
aggR điều hòa sự biểu
hiện của AAF
gây tích tụ dịch và gây
độc tố cho biểu mô
tiêu hóa
EAST-1 phá hủy tế
bào biểu mô
Protein làm tan máu và
làm mất thăng bằng
vận chuyển ion qua
màng
Tiêu chảy
kéo dài

EAST-1 phá hủy tế
bào biểu mô
Tiêu chảy
phân
thường
không có
máu
EHEC còn được gọi là E.coli sinh độc tố Shiga. Yếu tố động lực chính của
EHEC là độc tố Stx (Shiga toxin) hay độc tố gây độc đối với tế bào Vero VT
(veroccytotoxin) vì vậy loại này thuộc nhóm có tên là VTEC – Verocytotoxin E.coli.
Hiện nay, có ba loại Stx do EHEC sinh ra đã được xác định là Stx1, Stx2 và Stx2v. Các
độc tố này được mã hóa bởi các gen prophage thích hợp trên nhiễm sắc thể.
Độc tố Shiga hủy hoại chọn lọc các vi nhung mao hất thu của tế bào biểu mô
ruột. Nó cũng xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, ức chế quá trình tổng hợp protein
dẫn đến làm chết tế bào. Hậu quả là viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảy phân như
máu. Những trường hợp hoại tử nặng có thể gây thủng ruột.
Stx còn có thể gây hội chứng tăng ure huyết tan máu (HUS-haemorrhagic
uremic syndrome). Stx vào máu đến thận gây tổn thương tế bào biểu mô tiểu cầu thân,
làm hẹp và tắc mao mạch tiểu cầu thận. Hậu quả của quá trình này là mức lọc của thận
suy giảm, bệnh nhân bị suy thận cấp.
 EPEC – E.coli gây bệnh đường ruột
EPEC được bắt đầu nghiên cứu rất sớm, từ những năm 1940. EPEC bám dính
vào niêm mạc ruột gây tổn thương đặc trưng là sự phá hủy vi nhung mao ở riềm bàn
chải của niêm mạc ruột. Loại vi khuẩn này có vai trò rất quan trọng trong viêm dạ dày
ruột gây tiêu chảy ở trẻ em.
 DAEC – E.coli bám dính phân tán
[Type text] Page 11
[Type text] [Type text] [Type text]
DAEC là type gây bệnh được mô tả tương đối gần đây. Nó được xác định là
một type gây bệnh riêng vì không có các gen độc lực đặc trưng của các type khác đã

bệnh được trộn dịch nảo tủy, nếu trong bệnh phẩm có kháng nguyên đặc hiệu của
E.coli thì phản ứng sẽ dương tính. Đó là phản ứng ngưng kết thụ động.
[Type text] Page 12
[Type text] [Type text] [Type text]
Phương pháp chuẩn đoán chủ yếu nhất là nuôi cấy phân lập. Bệnh phẩm phân
được nuôi cấy trên môi trường phân lập có chất ức chế chọn lọc như DCL, Endo. Nước
tiểu giữa dòng được tiến hành cấy đếm trên môi trường đặc, trước đây thường sử dụng
thạch thường, hiện nay có môi trường uriselect vừa có giá trị cấy đếm, vừa có khả năng
định danh. Tiến hành cấy máu khi nghi có nhiễm khuẩn máu.
Sau khi đã phân lập được vi khuẩn thuần nhất thì xác định tính chất sinh vật hóa
học và định tên bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính với các kháng huyết thanh
mẫu.
Để xác định các E.coli sinh độc tố người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp
khác nhau như phương pháp quai ruột, phương pháp thử nghiệm trên tế bào nuôi,
phương pháp đồng ngưng kết, ELISA…
Kỹ thuật khuếch đại gen PCR cũng đã được áp dụng trong chẩn đoán E.coli. Ở
nước ta hiện nay chủ yếu mới sử dụng PCR trong định danh khi vi khuẩn đã được phân
lập thuần nhất. Các kỹ thuật PCR xác định E.coli trực tiếp từ bệnh phẩm đang được
nghiên cứu phát triển.
3.2. Chẩn đoán gián tiếp
Trên thực tế phương pháp huyết thanh học không được sử dụng để chẩn đoán các
nhiễm khuẩn do E.coli.
4. Nguyên tắc điều trị và phòng bệnh
4.1 Điều trị
E.coli thuộc vào các vi khuẩn có tỷ lệ kháng thuốc cao, nhất là các chủng phân
lập được từ nước tiểu, vì vậy cần phải làm kháng sinh đồ để chọn kháng sinh thích hợp.
Ngoài việc sử dụng kháng sinh, một số việc khác rất có giá trị trong điều trị như
bồi phụ nước, điện giải trong trường hơp ỉa chảy (việc này nhiều khi có vai trò quyết
định để cứu sống bệnh nhân), giải quyết các cản trở trên đường tiết niệu, rút ống thông
sớm nếu có thể được.

Các môi trường lỏng trên được chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa ống Durham úp
ngược. Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống
Durham.
- Môi trường thạch đĩa EMP
- Môi trường rắn Simmon Citrate Agar (thạch Simmon Citrate)
- Canh MR-PV
- Thuốc thử Methyl Read
- Thuốc thử α-napthol.
I.2 Quy trình phân tích
Tuần tự cấy 1ml dung dịch mẫu đã pha loãng 10
-1
vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi
ống chứa 10ml canh LSB. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10
-2
và 10
-3
.
Đây là trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại (hệ 3
x 3 hay 9 ống nghiệm). nếu nghi ngờ số lượng vi sinh vật trong mẫu quá cao, phải sử
dụng các mẫu có bậc pha loãng cao hơn. Ủ các ống nghiệm ở 37
0
C trong 48 giờ. Ghi
nhận ống có sinh hơi. Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang
các ống có chứa canh BGBL và ủ ở 37
0
C ± 1
0
C trong 48 giờ. Ghi nhận số ống cho kết
quả (+) (có sinh hơi) ứng với mỗi độ pha loãng.
Dùng que cấy vòng chuyển một vòng dịch mẫu từ các ống canh LSB (+) sang môi

IMViC.
2.2Môi trường và hóa chất
- Môi trường canh Tryptone Soya Agar (TSA) và môi trường Violet Red Bile
Agar (VRB) được chuẩn bị vô trùng trong các chai thủy tinh, đun chảy và làm
nguội ở nhiệt độ 45
0
C trong bể điều nhiệt trước khi sử dụng.
- Môi trường canh Escherichia coli broth (EC Broth) được phân phối 10ml trong
mỗi ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược, hấp khử trùng để nguội và kiểm
tra không có sự hiện diện của bọt khí trong ống Durham. Các ống EC này được
bảo quản ở 2 – 8
0
C.
- Môi trường canh Lactose Tryptone Lautyl Sulphate Broth (LST Broth) được
chuẩn bị tương tự môi trường canh EC.
- Môi trường canh Tryptone Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp
khử trùng.
- Môi trường canh MR-VP Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp
khử trùng, để nguội và bảo quản ở 2-8
0
C cho đến khi sử dụng.
- Môi trường thạch Simmon Citrate được chuẩn bị dưới dạng các ống thạch
nghiêng có màu xanh lục.
- Thuốc thử Kovac’s.
2.3 Quy trình phân tích
[Type text] Page 16
[Type text] [Type text] [Type text]
Mẫu được đồng nhất hóa bằng cách đối với mẫu rắn xay nhuyễn mẫu trong điều
kiện vô trùng rồi cân chính xác 10g (hoặc 25g), đối với mẫu lỏng hút 10ml (hoặc 25ml),
bổ sung vào trong bình tam giác chứa 90ml (hay 225ml) nước SPW đã được hấp khử

loãng.
Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ (khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, có vòng tủa muối
mật, đường kính ≥ 0,5 mm), dung que cấy vòng chuyền sang môi trường canh EC, ủ ở
44 ± 0,5
0
C trong 24 giờ.
Chọn các ống cho kết quả (+) (sinh hơi) và dung que cấy vòng chuyền sang các
môi trường sau: canh Tryptone, canh MR-VP, thạch Simmon Citrate. Ủ các môi trường
trên ở 44 ± 0,5
0
C trong 24 giờ
Thử nghiệm Indol, Methyl Read, Voges Proskauer, Citrate. Ghi nhận khuẩn lạc
cho thử nghiệm khẳng định E.coli (+) ( IMViC là + + - -).
2.4 Cách tính kết quả
Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ khẳng định, tính mật độ của E.coli theo
công thức sau:
A (CFU/mg hay CFU/ml) = x R
[Type text] Page 17
[Type text] [Type text] [Type text]N: tổng số khuẩn lạc đếm được
n
i
: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng
V: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa
f
i
: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm
R: tỷ lệ khẳng định

12.Canh thang urê (các thành phần là thạch urê nhưng không có agar) (mt 93)
13.Môi trường V.P (Voges Proskauer medium) (mt 54)
14. Kháng huyết thanh E.Coli
3.4 Cách làm
1. Chuẩn bị mẫu:
Cân 25g mẫu bằng thao tác vô khuẩn rồi cho vào 225ml canh thang MacConkey
và 225ml canh thang dinh dưỡng trong blender vô khuẩn và làm đồng nhất trong
30 giây (1:10)
2. Ria thẳng
Ria từ canh thang dinh dưỡng đồng nhất lên thạch L-EMB, thạch MacConkey. Ủ
ấm 35
0
C trong 24h.
3. Làm giàu vi khuẩn :
ủ ấm canh thang MacConkey ở 35
0
C trong 20h , chuyển một quai cấy sang 30ml
canh thang LST. Ủ ấm 44
0
C trong 20h. Ủ ấm canh thang dinh dưỡng 35
0
C trong
6h, Chuyển một quai cấy sang 30ml canh thang EE. Ủ ấm 41,5
0
C trong 18h.
4. Xét nghiệm sơ bộ về huyết thanh :
Trung hòa canh thang LST và EE với 10% NaHCO
3
, nhỏ một giọt canh thang
của mỗi thứ lên trên phiến kính sạch và cho thêm một giọt huyết thanh đa giá OB

hơi hồng tím . Thuộc địa của men nonlactose vẫn không màu, hoặc ít nhất không đậm
hơn so với màu sắc của các phương tiện truyền thông
[Type text] Page 20
[Type text] [Type text] [Type text]
ư
[Type text] Page 21
Hình 2.1: Khuẩn lạc E.coli trên môi trường thạch EMB
Hình 2.3: Thử nghiệm Indole
Ống 1: E.coli cho kết quả dương tính
Ống 2: E.coli cho kết quả âm tính
(1)
(2)
Hình 2.4: Thử nghiệm Urease
(1): E.coli (-) ; (2): E.coli (+)
Hình 2.5: Thử nghiệm Cytochrome oxidase
với vi khuẩn E.coli
(A) Cho kết quả (-)
(B) Cho kết quả (+)
(a) (b)
(A)
(B)
(1) (2)
[Type text] [Type text] [Type text]
[Type text] Page 22
Hình 2.6: Thử nghiệm VP
(a): E.coli (+); (b): E.coli (-)
Hình 2.7: Thử nghiệm MR
(a): E.coli (+); (b): E.coli (-)
(a)
(b)

Việc trích ly DNA được thực hiện như sau: thu khoảng 6-10 khhuẩn lạc E.coli
trên môi trường thạch (MAC hoặc SMAC, hoặc CT-SMAC) cho vào eppendorf đựng
sẵn 0,4-0,5 ml nước cất hai lần vô trùng, đun sôi 10 phút, lấy ra và chuyển vào tủ âm
-70
0
C giữ trong 10 phút. Sau khi rã đông hoàn toàn, ly tâm 13000 vòng trong 3 phút. Để
yên và hút phần dung dịch ở phía trên làm DNA khuôn mẫu (DNA xét nghiệm).
[Type text] Page 24
Mẫu
MAC
(37
0
C/24 giờ)
SMAC
(37
0
C/24 giờ)
Pepton (vancomycin,
cefixime) (37
0
C/24 giờ)
CT-SMAC
(37
0
C/24 giờ)
[Type text] [Type text] [Type text]
Sơ đồ 1: Qui trình phân lập, định tính và phát hiện gen độc lực E. coli
[Type text] Page 25
Chọn 6-10 khuẩn lạc theo
từng nhóm riêng: trắng hoặc