Chương 9
PHÂN LẬP GENE TÁCH DÒNG PHÂN TỬ
VÀ BIỂU HIỆN GENE

Tóm tắt: Công nghệ ADN tái tổ hợp bao gồm các kĩ thuật tách dòng gene và
biểu hiện gene. Bắt đầu từ sự phân lập gene và sau đó là tạo vector tái tổ hợp,
biến nạp vào tế bào chủ, tách dòng và xác định trình tự gene. Protein là sản
phẩm biểu hiện gene. Quá trình biểu hiện gene ngoại lai bắt đầu từ việc đưa
gene vào vector biểu hiện và biến nạp vào tế bào chủ. Vector biểu hiện gene
được thiết kế bao gồm promotor mạnh và điều khiển được. E. coli là vi khuẩn
được sử dụng rộng rãi trong công nghệ ADN tái tổ hợp và sự biểu hiện gene
thành công nhất hiện nay vẫn là ở E. coli. Phân lập, tách dòng và biểu hiện
gene được minh hoạ bằng ví dụ về sự phân lập, xác định trình tự gene mã hoá
cho trichobakin-RIP và quá trình biểu hiện gene này.
Nội dung của chương gồm 3 vấn đề chính là: (1).Phân lập gene; (2). Tách
dòng gene; (3). Biểu hiện gene. §1. PHÂN LẬP GENE
Phân lập gene hay phân lập đoạn ADN theo mục đích có thể được tiến
hành theo phương pháp sử dụng enzyme cắt hạn chế hoặc bằng phản ứng chuỗi
PCR. Phân lập gene mang ý nghĩa trong kĩ thuật giải trình tự ADN hay tạo dòng
ADN tái tổ hợp trong kĩ thuật chuyển gene.
1.1. Phân lập gene bằng kĩ thuật cắt hạn chế

Enzyme giới hạn (restrition enzyme) có khả năng cắt ADN ở những điểm
đặc hiệu. Với đặc tính đó người ta đã vận dụng để xác định những đoạn ADN
mã hoá cho các tính trạng của sinh vật và phân lập đoạn ADN đó. Kĩ thuật phân
lập gene nhờ enzyme giới hạn có thể gồm các bước sau:
(1). Tách chiết và tinh sạch ADN.
(2). Cắt ADN bởi enzyme giới hạn.

- Chọn lọc một thư viện gene.
2.2. Các bước của kĩ thuật tách dòng
- Chọn và xử lí vector.
- Xử lí ADN cần tạo dòng.
- Tạo vector tái tổ hợp.
- Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ.
- Phát hiện dòng cần tìm trong thư viện gene.

127Hình 9.1. Quy trinh chung của kĩ thuật tách dòng gene
2.3. Thư viện bộ gene

Thư viện bộ gene là tập hợp tất cả các trình tự ADN cấu thành bộ gene đã
được gắn vào vector. Về nguyên tắc, thư viện bộ gene được thiết lập từ bất cứ tế
bào nào của sinh vật nghiên cứu.
Các bước thiết lập thư viện bộ gene:
(1) Tách chiết ADN.
(2). Cắt ADN thành những đoạn có kích thước xác định bằng RF.
(3). Gắn đoạn các ADN vào vector để tạo vector tái tổ hợp.
(4). Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ.
(5). Tế bào chủ nuôi cấy trên môi trường đặc và hình thành nên các dòng. 128

Hình 9.2. Tách dòng ADN tái tổ hợp
Ứng dụng:
- Giải mã thông tin di truyền chứa trong bộ gene, đặc biệt cấu trúc itron,

pháp của Kary Mullis và cộng sự (1985) với việc sử dụng cặp mồi
Chap_N/chap_C thiết kế dựa trên trình tự ADN bổ sung (cDNA) của giống đậu
tương Nhật Bản.
Chap_N:
5_GCC ATA TGT CGG CAA TCG CGG CCC C
Chap_C:
5_CGG GAT CCC TAC CTC ACA GTT ACA GTT ACA ATA TCA TC
Chu trình nhiệt phản ứng: 95
0
C : 1 phút; 55
0
C : 1 phút; 72
0
C : 1 phút 20
giây: 32 chu kì; 72
0
C : 8 phút; Kết thúc ở 4
0
C.
Để tiến hành tách dòng gene chaperonin sản phẩm PCR được cắt thành
các đoạn nhỏ hơn bằng SacI. Sau đó đem sản phẩm cắt gắn vào vector
pBluescript KS (-) đã được mở vòng. ADN tái tổ hợp được biến nạp vào chủng
E. coIi-DH5
α
. Môi trường nuôi cấy, các phương pháp gắn, tạo tế bào khả biến,
biến nạp, tách ADN plasmid, kiểm tra đoạn gene bằng cách xử lí với enzyme
giới hạn dược tiến hành theo sách cẩm nang chọn dòng phân tử của Sambrook
và cộng sự 1989.

130

Chaperonin tế bào chất là một dạng protein tồn tại trong tất cả các tế bào đóng
vai trò quan trọng trong việc tạo cấu trúc không gian đúng cho protein tạo khung
tế bào là actin và tubulin. Chúng cùng đồng thời thực hiện nhiều chức năng khác
như tham gia tái tạo cấu trúc không gian đúng cho protein bị biến tính khi gặp
điều kiện bất lợi. Các tác giả đã sử dụng đoạn mồi được tổng hợp dựa vào trình
tự cDNA của chaperonin tế bào chất giống đậu tương chịu lạnh Nhật Bản để tiến
hành nhân gene chaperonin của các dòng đậu tương đột biến ML10, ML48 và
ML61 bằngkĩ thuật pPC.131

Hình 9.4. Điện di đồ sản phẩm PCR gene chaperonin của 3 dòng đậu tương
Sau 32 chu kì phản ứng, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên
gel agarose 0,8% và kết quả cho thấy ở cả ba dòng đậu tương đều thu được sản
phẩm PCR đặc hiệu. Kích thước phân tử (KTPT) của sản phẩm PCR vào khoảng
1,6 kb. Đồng thời sản phẩm PCR nhận được có KTPT giống với đoạn tương ứng
ở đoạn cDNA của gene chaperonin trong giống đậu tương Nhật Bản. Điều đó
chứng tỏ rằng các dòng đậu tương nghiên cứu đều có gene chaperonin. Như vậy,
trong trình tự của nó chỉ có những vùng được dịch mã sang protein (exon), mà
không có những vùng không dịch mã (intron).
2.4.3. Phân tích gene chaperonin bằng enzim giới hạn
Theo các nghiên cứu đã công bố, trình tự gene chaperonin có điểm nhận
biết cho một số enzyme giới hạn như: SacI, AluI, SauI. Trong đó SacI cắt trình
tự cDNA thành 5 đoạn có kích thước phân tử tương ứng là 260, 189, 198, 630 và
325 bp. Như vậy, để so sánh gene chaperonin này với các trình tự công bố. Sản
phẩm cắt được điện di trên gel agaroza 1,2%.

Hình 9.5. Phổ điện di ADN plasmid
Kết quả trên diện di đồ cho thấy không có sự khác biệt về vị trí điểm cắt

vào. Để kiểm tra kết quả của quá trình chọn dòng 9 khuẩn lạc màu trắng (kí hiệu
các khuẩn lạc từ 1 đến 9) và một khuẩn lạc màu xanh (làm đối chứng) được sử
dụng để tách chiết ADN plasmid. Sau khi tách chiết và làm sạch, sản phẩm
ADN plasmit được kiểm tra trên gel agaroza 0,8%. Trên ảnh điện di đồ cho thấy
cả 9 khuẩn lạc đều có ADN plasmid với độ di động điện di cao hơn đối chứng.
Để xác định được những khuẩn lạc cần tìm có gắn đoạn sản phẩm PCR cắt bằng
SacI, chọn ADN plasmid từ bơn khuẩn lạc 1, 4, 7 và 8 để tiến hành phản ứng cắt
kiểm tra bằng enzyme SacI. Sản phẩm sau khi cắt được kiểm tra bằng điện di
trên gel agaroza 0,8 %.
Kết quả trên ảnh điện di dòng số 8 đã gắn được một đoạn ADN khoảng
0,6 kb; dòng số 7 đã gắn được đoạn ADN khoảng 0,4 kb; dòng số 4 đã gắn dược
đoạn ADN khoảng 0,2 kb. Riêng sản phẩm cắt của dòng số 1 cho thấy có cả 2
đoạn ADN khoảng 0,6 kb và 0,2 kb được gắn vào vector. Trong quá trình tách
dòng, sử dụng enzyme SacI cắt gene chaperonin thành 5 đoạn. Vì SacI là
enzyme cắt tạo đầu dính nên sản phẩm cắt chỉ cho được 3 đoạn có đầu dính
tương ứng với kích thước là 189, 198 và 630 bp.
Như vậy, rõ ràng là dòng số 8 đã gắn được đoạn tương ứng có kích thước
là 630 bp. Dòng số 4 thì gắn dược hoặc là đoạn 189 bp hoặc 198 bp (vì hai đoạn

133
này rất khó phân biệt trên diện di đồ). Còn dòng số 1 gắn được cả hai đoạn 630
bp và một trong hai đoạn ngắn nói trên. Đối với dòng số 7 đoạn gắn có kích
thước khoảng 400 bp có thể là tổng của hai đoạn ngắn 189 và 198 bp và cũng có
thể là đoạn lẫn tạp trong sản phẩm cắt ngẫu nhiên. Để có những kết luận chính
xác về các dòng thu được, cần tiến hành đọc trình tự ADN.
2.4.5. Xác định trình tự gene Chaperonin ở cây đậu tương
Vector tách dòng TA cloning và các hoá chất cần thiết của hãng
Invitrogen, vi khuẩn E. coli chủng DH5
α
. Tạo dòng phân tử được tiến hành

1 8 Gln (Q) Gln (Q) Gln (Q)
His (H)

2 24 Glu (E) Asp (D) Asp (D) Glu (E)
3 29 Gli (G) Ala (A) Ala (A) Ala (A)
4 43 Thr(T) Thr(T) Thr(T)
Ala (A)

5 54 Ile (1) Thr(T) Thr (I) Ile (I)
6 76 Val (V) Gli (G) Val (V) Val (V)
7 99 Ser (S) Thr(T) Thr (T) Thr (T)
8
110
His(H) Leu (L)
His(H)
Leu (L)
9
128
Glu Asp (D)
Asp
Asp
10 129 Pro (P) Ala (A) Pro (P) Ala (A)
11 191 Pro (P) Pro (P) Pro (P)
Ala (A)

12 204 Val (V) Ile(I) Val (V) Val (V)
13 220 Leu (L) Pro (P) Leu (L) Leu (L)
14 280 Ser (S) Gli (G) Gli (G) Ser (S)
15 308 Ser (S) Ser (S) Ala (A) Ser (S)
16 360 Phe (F) Val (V Phe (F) Phe (F)