BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ
----------------------

N
G
U
Y
Ễ
N
C
Ẩ
M
H
À

NGHIÊN CỨU
SQUALENE TỪ VI
TẢO BIỂN DỊ


DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM
MANGROVEI PQ6 ĐỊNH
HƢỚNG LÀM NGUYÊN
LIỆU CHO THỰC PHẨM
BẢO VỆ SỨC KHỎE, MỸ


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS. TS Đặng Diễm Hồng

Hà Nội – Năm 2020


i
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS.
TS. Đặng Diễm Hồng, ngun Trưởng phịng Cơng nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - người thầy đã định hướng,
truyền dạy những kiến thức khoa học và giúp đỡ tôi vượt qua những trở ngại và khó
khăn trong suốt thời gian thực hiện luận án.
Tôi trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Cơng nghệ sinh học, phịng thí
nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, bộ phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Ban
Lãnh đạo và bộ phận đào tạo của Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và
giúp tơi hồn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu.
Trong q trình viết luận án tơi đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình
của TS. Hồng Thị Lan Anh. Ngồi ra tơi cũng nhận được sự giúp đỡ của các đồng
nghiệp làm việc tại phịng Cơng nghệ Tảo: TS. Hồng Thị Minh Hiền, TS. Ngơ Thị
Hồi Thu, TS. Lưu Thị Tâm, ThS. NCS. Lê Thị Thơm. Nhân dịp này, tôi xin chân
thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ q báu đó.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Nguyễn Hoàng Ngân- Học
viện Quân Y, đã giúp đỡ tôi trong một số thử nghiệm trên động vật thực nghiệm,
phân tích độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và tác dụng dược lý của squalene.
Luận án được thực hiện trong khuôn khổ các đề tài Quỹ Phát triển Khoa học và
Công nghệ Quốc gia - Nafosted, Bộ Khoa học và Công nghệ “Nghiên cứu đánh giá và
khai thác chất squalene làm dược phẩm từ vi tảo biển của Việt Nam” (2013-2016) do
PGS. TS. Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm, đề tài “Cơ chế điều hòa trao đổi lipid của


iii

Trang phụ bìa
Lời cảm ơn……………………………………………………………………...
Lời cam Ďoan…………………………………………………………………...
Mục lục…………………………………………………………………………
Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt…………………………………………..
Danh mục các bảng…………………………………………………….............
Danh mục các hình vẽ, Ďồ thị…………………………………………………..
MỞ ĐẦU……………………………………………………………………….
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………....
1.1.

G

1.1.1.

Tí

1.1.2.

Ng

1.1.3

Cá

và
1.1.4


1.4.2.

Tì

ch
1.4.2.1.

Tì

ch
1.4.2.2.

Tì

sq
Chƣơng 2.

VẬ


2.1.

Vật liệu……

2.1.1.

Mẫu vật……

2.1.2.


Ďiều kiện nu

xuất squalen
2.2.1.1.

Phương phá

khối khơ……
2.2.1.2.

Phương phá

2.2.1.3.

Phương phá

tảo……………
2.2.1.4.

Phương phá

2.2.1.5.

Phương phá

2.2.1.6.

Phương phá




2.2.2.4.
2.2.3.
2.2.4.

2.2.4.1

2.2.4.2.

2.2.5.
2.2.6.
Chƣơng 3.
3.1.
3.2.
3.2.1.
3.2.1.1.
ở cấp độ bình tam giác………………………………………………..67

3.2.1.2.Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng và hàm

lượng squale
3.2.1.3

Ảnh hưởng c

hàm lượng s
3.2.1.4.

Ảnh hưởng c

Ảnh hưởng của

trưởng và tích lũ
3.2.2.4

Ảnh hưởng của

squalene của chủ
3.3.

Xây dựng quy

mangrovei PQ6
3.3.1.

Tối ưu Ďiều kiệ

S. mangrovei PQ
3.3.1.1.

Tách chiết lipid

3.3.1.2

Tách chiết lipid

3.3.1.3.

Tinh sạch và địn


3.3.3.

Tách chiết và tin

3.3.4.

Phân tích các ch

loại của squalen
3.4.

Tính an toàn và


S.

viv
3.4.1.

Độ

ng
3.4.2.

Độ

th
3.4.2.1.

Ản

Tá

th
3.5.2.1.

Tố

lư
3.5.2.2.

Tá

tro
3.5.3.

Cơ

ch
3.5.4.

Tá

ma
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………...
DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ………………………………
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………
PHỤ LỤC


viii


GC
GPP
HDL-C

HMG-CoA
HMGR

HPLC

IPP
KLCT
KXPH
LD50

LDL-C

LDL-R

LXR
MĐTB


x
MEP
MJA
MVA
NMR
OA
ORO


Bảng 1.4.

Các phươ

Bảng 1.5.

Sự phân

Anderso

Beakes v
Bảng 2.1.

Danh sác

Bảng 2.2.

Trình tự

Bảng 2.3.

Địa Ďiểm

Bảng 3.1.

Sinh trưở

thuộc ch
Bảng 3.2


Ảnh hưở

Bảng 3.8.

Ảnh hưở

trong má
Bảng 3.9.

Ảnh hưở

Bảng 3.10.

Ảnh hưở

Bảng 3.11.

Ảnh hưở


DANH
Hình 1.1.

Cấu trúc hóa học

Hình 1.2.

Tổng hợp squale


Hình 3.2.

Ảnh hưởng của n

lượng squalene (B
Hình 3.3.

Ảnh hưởng của n

lipit (B) của S. m
Hình 3.4.

Ảnh hưởng của n

suất squalene (B)
Hình 3.5.

Ảnh hưởng của n

khơ (B), hàm lượ
Hình 3.6.

Ảnh hưởng của t

(B), hàm lượng s
Hình 3.7.

Ảnh hưởng của c

và hàm lượng squ


Hình 3.13. Hình thái tế bào chủng PQ6 ở các giai Ďoạn ni cấy của q trình lên
men fed-batch. A- Trước thời Ďiểm bổ sung glucose; B- Sau khi bổ
sung glucose lên 22%

85

Hình 3.14. Ảnh hưởng của các yếu tố dung môi (A), nhiệt Ďộ (B), thời gian (C),
số lần chiết (D) tỷ lệ sinh khối/dung môi (E), chế Ďộ khuấy trộn (G),
nhiệt Ďộ sấy sinh khối (H), Ďộ ẩm sinh khối (I) lên hiệu suất tách chiết
lipid 87
Hình 3.15. Sắc ký lớp mỏng mẫu lipid khơng xà phịng hóa (A) và sắc ký Ďồ
squalene tinh sạch từ sinh khối chủng PQ6 (B) 92
Hình 3.16. Hàm lượng squalene qua các bước làm giàu và tách chiết từ sinh khối
S. mangrovei PQ6

92

Hình 3.17. Ảnh chạy sắc ký lớp mỏng (A) và sắc ký Ďồ của squalene tinh sạch
sau quá trình làm giàu thơng qua quy trình 6 bước (B) 93
Hình 3.18. Phổ 1H (A) và 13C (B) NMR của squalene tinh sạch từ sinh khối S.
mangrovei PQ6

94

Hình 3.19. Ảnh hưởng của dung môi lên hàm lượng squalene tách chiết từ sinh
khối S. mangrovei PQ6. (A) Ảnh chạy TLC mẫu squalene thô Ďược
tách chiết từ sinh khối tảo với các loại dung mơi khác nhau
Hình 3.20. Ảnh hưởng của Ďộ ẩm sinh khối tảo lên hàm lượng squalene tách
chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6. (A) Ảnh chạy TLC mẫu


103

Hình 3.28. Sắc ký Ďồ HPLC của squalene chuẩn (A) và squalene tinh sạch từ
sinh khối S. mangrovei PQ6 (B)………………………………………
1

Hình 3.29. Phổ H (A) và

104

13

C (B) NMR của squalene tinh sạch từ sinh khối S.

mangrovei PQ6……………………………………………………………….

104

Hình 3.30. Hình ảnh Ďại thể và mơ bệnh học vi thể - tương ứng (HE, x 400) của
gan, thận, lách chuột tương ứng sau 60 ngày uống thuốc lơ Ďối chứng
(a, d, g, k), lơ thí nghiệm 1 (b, e, h, l) và lơ thí nghiệm 2 (c, f, i, m)….

114

Hình 3.31. Tỷ lệ sống sót của tế bào HepG2 và RAW246.7 Ďược ủ với squalene
ở các nồng Ďộ khác nhau………………………………………………

117



124

Hình 3.38. Ảnh hưởng của squalene trong quá trình sinh tổng hợp triglyceride
trong tế bào HepG2 125
Hình 3.39. Sơ Ďồ tóm tắt bước Ďầu nghiên cứu cơ chế phân tử tác dụng giảm
cholesterol và tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S.
mangrovei PQ6………………………………………………………...

126


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Việt Nam có trên 3.200 km bờ biển với một nguồn sinh vật biển nhiệt Ďới rất
Ďa dạng, phong phú về thành phần lồi và giàu các hợp chất tự nhiên có thể ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y dược.... Trong Ďó vi tảo với ưu
Ďiểm chính là giàu dinh dưỡng, có kích thước tế bào nhỏ (< 10 µm) phù hợp với
miệng của các ấu trùng thủy hải sản, dễ tiêu hóa, khơng Ďộc, có tốc Ďộ sinh trưởng
cao và sức chống chịu cao với những Ďiều kiện khắc nghiệt của mơi trường, Ďược
coi là mắt xích Ďầu tiên, nguồn sinh khối sơ cấp quan trọng trong chuỗi thức ăn
biển. Ngoài ra, sinh khối vi tảo cũng chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quan
trọng cho người và Ďộng vật nuôi như: các loại sắc tố, vitamin, khống chất,
protein, các acid béo khơng bão hịa Ďa nối Ďôi (polyunsaturated fatty acid PUFA)....Ďặc biệt là squalene.
Squalene là một tripterpene tự nhiên, là tiền chất steroid của Ďộng, thực vật
thường Ďược sử dụng trong các sản phẩm dinh dưỡng, chăm sóc sức khỏe, mỹ
phẩm và y học. Squalene Ďược ứng dụng rộng rãi trong cơng nghiệp mỹ phẩm, có
tác dụng chống khơ da và làm mềm da, có vai trò bảo vệ da khỏi các tác hại do ánh

bảo Ďảm an toàn cho sử dụng theo Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo
vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm ở Việt Nam. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện
Ďề tài “Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium mangrovei
PQ6 định hƣớng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và
dƣợc phẩm”.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
- Sàng lọc và xác Ďịnh Ďược Ďiều kiện ni trồng thích hợp của chủng

Schizochytrium mangrovei PQ6 của Việt Nam, tiềm năng lựa chọn Ďược cho sản
xuất squalene.
- Xác Ďịnh Ďiều kiện thích hợp cho tách chiết, làm sạch squalene từ sinh

khối chủng S. mangrovei PQ6 lựa chọn Ďược; Ďánh giá Ďộ an toàn và tác dụng sinh
học, dược lý của squalene tách chiết Ďược theo Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho
thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
- Sàng lọc Ďược chủng/loài vi tảo biển của Việt Nam tiềm năng cho sản xuất

squalene từ một số chủng vi tảo biển Việt Nam
- Tối ưu Ďiều kiện nuôi cấy Ďể thu Ďược sinh khối tảo có hàm lượng squalene

cao ở chủng tiềm năng lựa chọn Ďược ở quy mơ bình tam giác; bình lên men 30 Lít.
- Tối ưu Ďiều kiện tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene từ sinh khối

chủng vi tảo biển lựa chọn Ďược; xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch
squalene; xác Ďịnh Ďộ sạch và cấu trúc của squalene tách chiết Ďược.
- Đánh giá tính an tồn của squalene bao gồm Ďộc tính cấp và bán trường

diễn, tác dụng sinh dược trên mô hình in vivo (mơ hình Ďộng vật thực nghiệm).
- Bước Ďầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm cholesterol của squalene trên

Ďạt 6,9 g/L.
- Có Ďược quy trình tách chiết lượng lớn squalene từ chủng S. mangrovei

PQ6 có Ďộ tinh sạch cao 90- 95%, an toàn và Ďạt tiêu chuẩn Ďảm bảo chất lượng
Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và dược phẩm.
- Góp phần làm sáng tỏ squalene tách chiết từ chủng PQ6 có tác dụng giảm

cholesterol và tryglycerol nội bào, tăng hàm lượng cholesterol gắn với lipoprotein có tỷ
trọng cao, HDL-C và tỷ lệ HDL-C/cholesterol toàn phần trong máu; giảm cholesterol
gắn với LDL-C và VLDL-C trong máu mà không gây ảnh hưởng Ďến sự phát triển cân
nặng cơ thể và gan, cholesterol toàn phần và tryglyceride ở mơ hình tế bào và Ďộng vật
thực nghiệm; bước Ďầu Ďã cung cấp cơ sở khoa học cho việc Ďịnh hướng làm nguyên
liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm có.

6. Bố cục của luận án
Luận án gồm 148 trang, trong Ďó phần mở Ďầu 3 trang; Tổng quan tài liệu 39
trang; Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 22 trang; Kết quả và thảo luận 62 trang; Kết
luận và kiến nghị 2 trang; Danh mục các cơng trình Ďã cơng bố 2 trang; Tài liệu tham
khảo 18 trang gồm 179 tài liệu. Trong luận án có 19 bảng, 45 hình và 28 trang phụ lục.


4

CHƢƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về squalene
1.1.1. Tính chất hóa lý của squalene
Squalene có cấu tạo (2,6,10,15,19,23-hexanmethyltetracosa-2,6,10,14,18,22hexane) - là một chất trao Ďổi trung gian quan trọng trong sinh tổng hợp sterol và
triterpenes ở Ďộng vật và thực vật.
Squalene là một chất lỏng dạng dầu, trong suốt với trọng lượng phân tử là


5
công thức cho hợp chất này là C 10H18Br4. Mười năm sau, TS. Tsujimoto M. Ďã
thành công trong việc chưng cất chân không một phân Ďoạn của dầu từ gan của hai
con cá mập biển sâu, một hydrocacbon không bão hịa với cơng thức C 30H50, Ơng
gọi nó là “squalene”, từ gốc Latin là “Squalus” (cá mập) [4, 5].
Năm 1934, Robinson Ďã cơng bố cấu trúc vịng của squalene với phân tử
steroit. Năm 1936, cấu trúc sinh học của squalene Ďược mô tả lần Ďầu tiên bởi nhà
nghiên cứu Paul Karrer - người cũng Ďã khám phá ra cấu trúc hóa học của vitamin
A và E [6].
Theo cơng bố của Kohno và cộng sự (1995) thì squalene là một hydrocarbon
hợp chất béo khơng bão hịa (C30H50), với 6 liên kết Ďôi, chứa 6 Ďơn vị isoprene
Ďể cung cấp bộ khung cho tổng hợp cholesterol, acid mật và steroit. Do cấu trúc của
liên kết Ďơi trong sáu nhóm CH3, các isoprenoid có tác dụng chống oxy hóa tự
nhiên một cách mạnh mẽ [7].
E

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của squalene và tiền chất của nó [8]
A - Cấu trúc hóa học của isoprene. Các cấu trúc khác nhau của squalene: B - Dạng

kéo dài, C - Dạng cuộn, D - Dạng giống như sterol E - Cấu trúc hóa học của
squalene
Do cấu trúc hóa học của squalene, Ďặc biệt là mức Ďộ khơng bão hịa cao nên
squalene khơng có tính ổn Ďịnh cao mà lại rất dễ bị oxy hóa. Hình 1.1 Ďã cho thấy các
liên kết Ďôi Ďã cho phép hình thành nên cấu trúc squalene ở dạng giống sterol, dạng
kéo dài hoặc cuộn. Thật thú vị khi cấu trúc squalene cũng có thể Ďược tổ chức ở cả
dạng giống với sterol. Hauss và cs (2002) Ďã chỉ ra squalane - một dạng hydro


6

trình sinh tổng hợp ở các vi sinh vật này bắt Ďầu bằng sự hình thành 1- deoxy-Dxylulose-5-


7
phosphate (DXP) trong Ďó DXP-synthase và các enzyme khác tham gia Ďể hình thành
IPP và DMAPP. Các bước cịn lại từ IPP Ďến FPP giống hệt với con Ďường MVA.

Con đường sinh tổng hợp squalene ở động vật có vú [8]
Ở các tế bào Ďộng vật, sự tổng hợp cholesterol (Hình 1.2A) xảy ra thơng qua

con Ďường MVA/isoprenoid. Con Ďường này bắt Ďầu với acetyl-CoA, Ďược chuyển
thành HMG-CoA và sau Ďó Ďược khử bằng 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA
reductase (HMGR) thành MVA. Sự Ďiều hịa Ďược duy trì bằng cách kích hoạt hoặc
làm giảm HMGR. HMGR là một loại protein không thể tách rời của mạng lưới nội chất
chứa vùng cảm ứng sterol xuyên màng, Ďóng vai trị quan trọng trong sự thối hóa của
enzyme bởi proteasome. Các nghiên cứu gần Ďây cho thấy có sự kích thích trực tiếp và
gián tiếp của sự thối hóa bởi cholesterol, lanosterol và oxapseol.

A

B

Hình 1.2. Tổng hợp squalene thơng qua con Ďường MVA ở Ďộng vật có vú (A) [8].
AACT - acetoacetyl-CoA thiolase; FPS - FPP synthase; HMGS - HMG-CoA synthase; HMGR HMG-CoA reductase; IDI - isopentenyl diphosphate isomerase; SQS - squalene synthase; SQE squalene epoxidase. Tổng hợp squalene ở thực vật thông qua con Ďường MVA ở phần

bào tan (cytosol) và MEP ở lạp thể (plastid) (B). AACT-acetoacetyl-CoA thiolase; DMAPP dimethylallyl diphosphate; DXP - 1-deoxy-Dxylulose-5-phosphate; DXR - DXP reductoisomerase;
DXS - DXP synthase; FPP - farnesyl diphosphate; FPS - FPP synthase; G-3-P - glycerol-3phosphate; GPP - geranyl diphosphate; GGPP - geranylgeranyl diphosphate; HMBPP - (E)-4hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate; HMG-CoA - 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA; HMGS HMG-CoA synthase; HMGR-HMG-CoA reductase; IDI - isopentenyl diphosphateisomerase;IPPisopentenyldiphosphate; MEP - 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate; MVA - mevalonate; SQSsqualene synthase; ER - endoplasmic reticulum.