i
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN THỊ THOA

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH
LƯỢNG HOẠT CHẤT TRONG DƯỢC LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ FALLOPIA
MULTIFLORA (THUNBERG) HARALDSON
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Hà Nội - 2021


ii
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN THỊ THOA


Nguyễn Thị Thoa


iv

LỜI CẢM ƠN
Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa
học và Cơng nghệ Việt Nam, với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài VAST.ƯDCN.05/1416. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của
các thầy cô giáo, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình.
Tơi xin bảy tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng
tới PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt và TS. Nguyễn Hải Đăng - những người thầy đã tận
tâm hướng dẫn, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt
thời gian thực hiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tơi
trong suốt q trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển cùng tập thể cán
bộ của Viện đã quan tâm giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tơi trong suốt
q trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn phòng Hoạt chất sinh học, Trung tâm tiên tiến về
Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa sinh biển đã tạo điều kiện cơ sở vật chất, trang thiết bị
tốt nhất để tơi thực hiện và hồn thành luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Công nghiệp Hà
Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong q trình học tập và hồn thành luận
án. Tơi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Cơng nghệ hóa và đồng nghiệp
đã giúp đỡ, luôn tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi học tập và thực hiện luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới tồn thể gia đình, bạn
bè và người thân đã ln ln quan tâm, khích lệ, động viên tơi trong suốt quá trình
học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án.

1.4. Tình hình nghiên cứu hà thủ ơ đỏ tại Việt Nam.............................................26
1.5. Tổng quan về thẩm định phương pháp phân tích ...........................................28
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ...................................................30
2.1. Đối tượng nghiên cứu.....................................................................................30
2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................31
2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất........................................................31
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất ............................31
2.2.3. Phương pháp xử lí mẫu ...........................................................................32
2.2.4. Phương pháp phân tích định tính, định lượng các hợp chất....................32
2.3. Phân lập các hợp chất .....................................................................................33
2.4. Hằng số vật lí và các dữ kiện phổ của các hợp chất ......................................37
2.4.1. Hợp chất FM3 .........................................................................................37


vi
2.4.2. Hợp chất FM4 .........................................................................................37
2.4.3. Hợp chất FM1 .........................................................................................37
2.4.4. Hợp chất FM2 .........................................................................................37
2.4.5. Hợp chất FM5 .........................................................................................38
2.4.6. Hợp chất FM6 .........................................................................................38
2.4.7. Hợp chất FM7 .........................................................................................38
2.4.8. Hợp chất FM8 .........................................................................................38
2.4.9. Hợp chất FM9 .........................................................................................39
2.4.10. Hợp chất FM10 .....................................................................................39
2.4.11. Hợp chất FM11 .....................................................................................39
2.5. Kết quả thiết lập điều kiện phân tích cho hệ thống HPLC .............................39
2.5.1. Kết quả khảo sát thể tích bơm mẫu .........................................................39
2.5.2. Kết quả lựa chọn cột sắc ký ....................................................................40
2.5.3. Kết quả khảo sát bước sóng phân tích ....................................................40
2.5.4. Kết quả khảo sát pha động ......................................................................42

3.4. Hàm lượng hoạt chất trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ .......................................109
3.4.1. Sắc ký đồ DAD 280 nm của 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ ...........................109
3.4.2. Sắc ký đồ DAD 320 nm của 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ ...........................111
3.4.3. Sắc ký đồ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang ...........................................113
3.4.4. Kết quả phân tích 8 mẫu rễ củ hà thủ ơ đỏ............................................114
KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................120
DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ....................................................121
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................... Error! Bookmark not defined.


viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Tiếng Anh

Diễn giải

1

Proton nuclear magnetic

Phổ cộng hưởng từ proton

H-NMR

resonance spectroscopy
13



Chemiluminescence

Phổ phát quang hóa

COSY

1

Phổ COSY

AOAC

ASTM

H-1H Correlation

spectroscopy
DAD

Diod array detector

Detector mảng diode

DEPT

Distortionless enhancement

Phổ DEPT



50%

High performance liquid

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

chromatography


ix
HR-MS

High resolution - mass

Phổ khối lượng phân giải cao

spectrum
HMBC

Heteronuclear multiple bond

Phổ HMBC

connectivity
HSQC

Heteronuclear single-quantum Phổ HSQC
coherence


mass spectrometry
LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantification

Giới hạn định lượng

MCF-7

Human breast carcinoma

Ung thư vú ở người

MS

Mass spectrum

Phổ khối lượng

NMR

Nuclear magnetic resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân


Signal to noise ratio

Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn
Ung thư ruột kết

SW620
TCVN

-

Tiêu chuẩn Việt Nam

THSG

2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-

-

2-O-β-D-glucoside
TLC

Thin layer chromatography


Drug Administration

Mỹ

USP

United States Pharmacopoeia

Dược điển Mỹ

UV

Ultraviolet

Tử ngoại

YMC-RP

YMC-reversed phase

Pha đảo YMC

USFDA


xi

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các hợp chất stilbene phân lập từ hà thủ ô đỏ ............................................7
Bảng 1.2. Các hợp chất quinone phân lập từ hà thủ ô đỏ .........................................10

xii
Bảng 2.23. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM2 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.............66
Bảng 2.24. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM4 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.............66
Bảng 2.25. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM5 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.............67
Bảng 2.26. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM3 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.............68
Bảng 2.27. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM8 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.............68
Bảng 2.28. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM6 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.............69
Bảng 2.29. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM1 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.............70
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM3 và hợp chất tham khảo ..................77
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM4 và hợp chất tham khảo ..................83
Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM1 và hợp chất tham khảo ..................86
Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM2 và hợp chất tham khảo ..................88
Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM5 và hợp chất tham khảo ..................90
Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM6 và hợp chất tham khảo ..................92
Bảng 3.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM7 và hợp chất tham khảo ..................93
Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM8 và hợp chất tham khảo ..................96
Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM9 và hợp chất tham khảo ..................98
Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM10 và hợp chất tham khảo ..............99
Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM11 và hợp chất tham khảo ............102
Bảng 3.12. Hàm lượng các hoạt chất trong 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ (mg/g) ..........115


xiii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh cây, lá và hoa hà thủ ơ đỏ ............................................................6
Hình 1.2. Một số chế phẩm từ hà thủ ơ đỏ ................................................................26
Hình 2.1. Hà thủ ơ đỏ dạng củ (a, b) và cắt lát khô (c) .............................................30
Hình 2.2. Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu củ hà thủ ơ đỏ .........................................33
Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn FMWC mẫu củ hà thủ ơ đỏ ...35

Hình 3.22. Cấu trúc hóa học của hợp chất FM9 .......................................................98
Hình 3.23. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất FM10 .101
Hình 3.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất FM11 ...................................................103
Hình 3.25. Cấu trúc của 11 hợp chất phân lập từ rễ củ hà thủ ơ đỏ Hà Giang .......104
Hình 3.26a. Sắc ký đồ của 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ ở bước sóng 280 nm ..............110
Hình 3.26b. Sắc ký đồ 3D của 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ ở bước sóng 280 nm ........111
Hình 3.27a. Sắc ký đồ của 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ ở bước sóng 320 nm ..............112
Hình 3.27b. Sắc ký đồ 3D của 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ ở bước sóng 320 nm ........113
Hình 3.28. Sắc ký đồ DAD 280 nm (A), sắc ký đồ DAD 280 nm - dãn (B)
và sắc ký đồ DAD 320 nm - dãn (C) mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang ..................114


1

MỞ ĐẦU
Ngày nay, việc sử dụng dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên đang có xu
hướng tăng mạnh, do đó cần có biện pháp quản lý chất lượng dược liệu từ khâu
nguyên liệu đến sản phẩm. Chất lượng dược liệu phần lớn phụ thuộc vào thành phần
hoạt chất, những chất hố học có hoạt tính sinh học đóng góp vào tác dụng dược lý
của dược liệu đó. Có nhiều nguyên nhân có thể ảnh hưởng đến thành phần hoạt chất
trong dược liệu bao gồm nguồn gốc nguyên liệu không đảm bảo; địa hình địa lí
trồng trọt, thu hoạch và bảo quản dược liệu. Cũng có thể do q trình chế biến dược
liệu không đúng kỹ thuật dẫn đến mất hoạt chất hoặc biến đổi hoạt chất, từ hoạt chất
có lợi thành chất gây hại cho con người. Ngồi ra, hố chất độc hại cũng có thể
được sử dụng trong bảo quản dược liệu. Thậm chí, một số dược liệu có thành phần
hoạt chất thấp hoặc dược liệu giả mạo cũng được bán trên thị trường với danh nghĩa
là dược liệu quý... Do vậy dược liệu nói chung cần được kiểm tra chất lượng sản
phẩm đặc biệt là hàm lượng các hoạt chất có trong thành phần dược liệu nhằm đảm
bảo quyền lợi người tiêu dùng, bảo vệ sức khỏe con người.
Hà thủ ô đỏ là một loại dược liệu phổ biến sử dụng trong chế biến thuốc

báo về các tác dụng phụ do sử dụng các chế phẩm hà thủ ô đỏ trong thời gian dài.
Tuy cơ chế gây độc chưa được làm sáng tỏ nhưng đã cảnh báo rằng khi liều dùng
không phù hợp sẽ gây lên những tác động xấu đến sức khỏe của người tiêu dùng. Vì
vậy, nhằm sử dụng dược liệu một cách an toàn và hiệu quả cần tăng cường quản lý
chất lượng thông qua đánh giá hàm lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ơ đỏ. Để
góp phần đánh giá chất lượng dược liệu hà thủ ô đỏ trên thị trường Việt Nam, trước
tiên phải xác định rõ thành phần hoá học của chúng, phân lập và xác định cấu trúc
của những hoạt chất chính. Từ đó thiết lập các điều kiện phân tích sắc ký lỏng hiệu
năng cao nhằm phân tích định tính và định lượng các hoạt chất của các mẫu dược
liệu hà thủ ô đỏ.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu
xây dựng bộ dữ liệu phân tích định tính, định lượng hoạt chất trong dược liệu
hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunberg) Haraldson bằng sắc ký lỏng hiệu
năng cao”.
Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học chủ yếu của rễ
củ hà thủ ô đỏ tạo cơ sở xây dựng quy trình phân tích định tính, định lượng đồng


3
thời một số hoạt chất phân lập được, ứng dụng vào đánh giá hàm lượng các hoạt
chất trong một số mẫu dược liệu này.
Nội dung của luận án:
Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ rễ củ hà thủ ô đỏ
thu hái tại Hà Giang, Việt Nam.
Thiết lập một số điều kiện phân tích sắc ký HPLC trên thiết bị HPLC-DADMS từ chất sạch phân lập được. Lập đường chuẩn định lượng và thẩm định quy
trình phân tích đã thiết lập theo tiêu chuẩn của hiệp hội các nhà hóa học phân tích
chính thức AOAC.
Ứng dụng quy trình phân tích đã thiết lập phân tích định tính, định lượng
đồng thời một số hoạt chất trên một số mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ đang lưu hành
trên thị trường Việt Nam, so sánh và đưa ra kết luận.

thuộc chi này. Các lớp chất phân lập được từ chi Polygonum bao gồm terpenoit,
flavonoid, coumarin, axit béo, dẫn xuất axit cinnamic, steroid và ancaloit. Tuy
nhiên, một số lồi vẫn chưa được biết đến về mặt hóa học hoặc dược lý học như P.
flaccidum, P. glabrum, P. lanatum, P.spectabile, P. stininum, P. tinctorium và P.


5
viviparum [1]. Vì vậy, trong tương lai, sẽ có nhiều nghiên cứu về phân lập và xác
định cấu trúc các hợp chất mới từ các loài này đồng thời thu được giá trị lớn về mặt
khoa học. Đồng thời, cần có những nghiên cứu chi tiết để hiểu rõ cấu trúc cũng như
mối quan hệ giữa hoạt tính và cấu trúc của các hợp chất này.
Về hoạt tính sinh học, một số loài thuộc chi Polygonum đã được khẳng định
trong điều trị các bệnh khác nhau như trị rắn cắn, kháng viêm, chống ung thư,
kháng khuẩn, chống vi rút, khử trùng, kháng nấm, điều trị bệnh tiểu đường, điều trị
tăng huyết áp, tăng lipid máu, vàng da, xuất huyết, ho, sốt, loét, tình trạng da, thiếu
máu, tiêu chảy và các rối loạn tiết niệu. Một số loài được dùng làm thực phẩm và
thuốc đông y trong điều trị bệnh tim mạch [12], chống viêm [13], bảo vệ thần kinh
[14] và giảm thiểu các q trình sinh hóa liên quan đến thối hóa thần kinh liên
quan đến tuổi tác rối loạn như Alzheimer [15] và bệnh Parkinson [16].
Các kết quả nghiên cứu cho thấy, nhiều dịch chiết các loài thuộc chi
Polygonum có hoạt tính gây độc tế bào, kháng u, kháng khuẩn, giảm đau, chống
viêm, hạ nhiệt, lợi tiểu và tác dụng chống oxy hóa. Do đó, cần nghiên cứu về hoạt
tính sinh học các hợp chất phân lập được nhằm khẳng định hoạt tính là do hợp chất
nào quyết định. Ngoài ra, một số chiết xuất thực vật chỉ được nghiên cứu hoạt tính
sơ bộ; vì vậy, cần điều tra thêm một số hoạt tính khác để có được thơng tin đầy đủ
về hoạt tính các hợp chất trong mỗi lồi. Qua đó, nghiên cứu thổ nhưỡng, địa lí, khí
hậu... nhằm phát triển dược liệu một cách phù hợp và hiệu quả.
1.2. Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ
Hà thủ ơ đỏ có danh pháp khoa học là Fallopia multiflora (Thunberg)
Haraldson, tên đồng nghĩa là Polygonum multiflorum Thunb, là loài cây thân mềm,

khu vực Đông Á (như Nhật Bản) và Bắc Mỹ [20].
1.3. Tình hình nghiên cứu hà thủ ô đỏ trên thế giới
1.3.1. Các nghiên cứu về thành phần hóa học
Theo thống kê tài liệu [21-23], khoảng 100 hợp chất hóa học đã được phân
lập từ hà thủ ô đỏ. Các nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học chính của hà thủ ơ


7
đỏ bao gồm: stilbene, quinone, flavonoid, hợp chất lipid và một số hợp chất
khác…[24]. Trong đó, thành phần thể hiện hoạt tính chính của hà thủ ơ đỏ bao gồm
phenolic, anthraquinone và glycoside stilbene [25].
1.3.1.1. Hợp chất stilbene
Stilbene là thành phần chính trong lồi hà thủ đỏ. Tổng số đã phát hiện được
21 hợp chất thuộc lớp chất này [26-36]. Các hợp chất đã phân lập được từ hà thủ ô
đỏ thuộc lớp chất này được thống kê trong bảng 1.1:
Bảng 1.1. Các hợp chất stilbene phân lập từ hà thủ ô đỏ
Ký hiệu
1

Tên chất
2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-

TLTK
[26]

glucopyranoside
2

2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-(2″-O-


glucopyranoside
7

2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-xyloside

[30]

8

2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-O-(4″-O-α-D-

[31]

glucopyranosyl)-β-D-glucopyranoside
9

2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-O-(6″-O-β-D-

[31]

glucopyranosyl)-β-D-glucopyranoside
10

2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-O-(6″-O-β-D-

[31]


8
glucopyranosyl)-β-D-glucopyranoside

[33]

16

Cis-2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-

[34]

glucopyranoside
17

Cis-2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-O-(6″-O-α-D-

[35]

glucopyranosyl)-β-D-glucopyranoside
18

Polygonumoside A (2S-2-(4-hydroxyphenyl)-9,10,11-

[36]

trihydroxy-2H-benzofuro[2,3-f]-chromen-7(3H)-one4-O-β-D-glucopyranoside
19

Polygonumoside B (2R-2-(4-hydroxyphenyl)-9,10,11-

[36]

trihydroxy-2H- benzo[c]furo[2,3-f ]- chromen-7(3H)one-4-O-β-D-glucopyranoside)

TLTK

22

Emodin

[30, 37-42]

23

Aloe-emodin

[30, 37-42]

24

Chrysophanol

[30, 37-42]

25

Physcion

[30, 37-42]

26

Rhein


Emodin-3-methyl ether

[30, 37-42]

32

Fallacinol

[30, 37-42]

33

Emodin-6,8-dimethylether

[30, 37-42]

34

2-acetylemodin

[30, 37-42]

35

Emodin-8-O-β-D-glucopyranoside

[37, 43]

36


6-methoxyl-2-acetyl-3-methyl-1,4-naphthoquinone-

[47]

8-O-β-D-glucopyranoside
42

2-Methoxy-6-acetyl-7-methyliuglone

[38]