§Ò tµi nghiªn cøu khoa häc cÊp Bé – 2008

1
BỘ CÔNG THƯƠNG
VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
––––––––––––––––––––––––––––––– BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI R-D CẤP BỘ
Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
CHUẨN PHÂN TÍCH HOOCMON CLENBUTEROL
TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ KHỐI PHỔ (GC/MS”

Chủ nhiệm Đề tài: PHẠM VĂN THÀNH

2
N
2
O
đợc sử dụng rộng rãi nh là một chất tăng trọng, nó đợc bổ sung vào thức
ăn chăn nuôi (TĂCN) lợn, gà, bò nhằm kích thích sinh trởng, tăng tỷ lệ nạc,
nhằm giảm chi phí thức ăn. Tuy nhiên, lợng Clenbuterol tồn d trong vật nuôi
có tác động xấu đến sức khoẻ con ngời nh: làm rối loạn nhịp tim, run cơ, co
thắt phế quản, phù nề, liệt cơ, tăng huyết áp. Các nớc Châu âu từ 1988 đã
cấm đa Clenbuterol vào thức ăn chăn nuôi, Mỹ cấm năm 1991.
ở Việt nam, từ năm 2002 theo quyết định số 54/QĐ-BNN của Bộ trởng
Bộ NN& PTNT ký ngày 20/06/2002 đã cấm sản xuất, nhập khẩu, lu thông và
sử dụng Clenbuterol trong sản xuất và kinh doanh thức ăn chăn nuôi. Mặc dù
vậy, việc sử dụng Clenbuterol trộn vào thức ăn chăn nuôi cha phải đã hết do
những mối lợi từ tác dụng của Clenbutarol đem lại. Những kết quả nghiên
cứu của Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam cho thấy, trong 83
mẫu thức ăn hỗn hợp và đậm đặc của 12 công ty có 9 mẫu dơng tính ( chiém
10,8%). Kết quả thử nhanh trên 80 mẫu thịt có 05 mẫu dơng tính ( Chiếm
6,25%). Kết quả của Chi cục Thú y thành phố HCM cũng cho thấy, trong 334
mẫu khả nghi có tồn d Clenbuterol cao thì có 52 mẫu dơng tính (chiếm
15.57%).
Gần đây nhất, cuối năm 2006, đầu năm 2007 Cục Chăn nuôi đã cùng với
các Sở NN-PTNN của 64 tỉnh, thành phố tổ chức lấy mẫu TĂCN tại các đại
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008

3
lý, các trang trại chăn nuôi và cơ sở sản xuất TĂCN để kiểm tra; đã nhận đựơc


4
1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nớc.
1.4.1 Nghiên cứu ứng dụng phơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS).
Sự kết hợp giữa phơng pháp sắc ký và phơng pháp khối phổ (GC/MS) tạo
nên một phơng pháp phân tích đặc biệt có hiệu quả trong lĩnh vực hoá phân
tích. Hai thiết bị này có khả năng bổ sung và hỗ trợ cho nhau trong quá trình
phân tích (GC: tách, MS: phát hiện), vì vậy phơng pháp này đợc sử dụng rất
hữu hiệu cho quá trình khảo sát, định lợng các chất [13]. Hai kỹ thuật trên
ghép nối với nhau có thể tách và định lợng các chất có nồng độ 10
-8
gram
hoặc nhỏ hơn nữa, đây là nồng độ rất khó phát hiện ở các phơng pháp phân
tích công cụ. Ngoài ra, với sự kết nối này, những mẫu không bền trong thời
gian bảo quản cũng có thể đợc phân tích một cách thuận lợi, đặc biệt là việc
phân tích các hỗn hợp phức tạp. Nhờ đó, có thể tiết kiệm khá nhiều thời gian
thực nghiệm vì phân lập mẫu theo nguyên tắc điều chế trớc khi đa vào khối
phổ do vậy giảm nhẹ yêu cầu kỹ thuật đối với các kỹ thuật viên.
Sơ đồ hệ sắc ký khí khối phổ có thể mô tả tóm tắt nh sau: Về cơ bản, thiết bị sắc ký sử dụng cột nhồi hoặc cột mao quản có thể
ghép nối thiết bị khối phổ loại hội tụ chùm tia đơn hoặc kép [2], [17]. Có nhiều
giải pháp kỹ thuật khác nhau để thực hiện việc ghép nối trong hệ thống. Với
thiết bị hiện đại ngày nay toàn bộ dòng khí thoát ra (khí mang và mẫu) từ cột
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008

6
Hoá khí chất mẫu: mẫu đợc dẫn vào bình chứa, ở đó áp suất có thể giảm
tới 10
-6
mmHg, sau đó dòng khí này đợc dẫn vào buồng ion hoá để sản ra các
ion, lợng mẫu có thể ghi nhận đợc rất nhỏ 10
-13
g/giây.
Ion hoá mẫu, có thể sử dụng các phơng pháp:
- Ion hoá nhờ các tia hay các phần tử mang năng lợng (electron, photon, hạt
nhân).
- Ion hoá nhờ điện trờng mạnh.
- Ion hoá nhờ sự phòng điện.
- Ion hoá nhờ sự phòng điện.
- Ion hoá nhờ sự đốt nóng (nguồn nhiệt Lazer).
- Ion hoá nhờ tơng tác ion (ion hoá học).
Trên thực tế hiện nay, ngời ta sử dụng phơng pháp ion hoá qua sự va
chạm electron.
Phơng pháp va chạm electron là dòng khí đợc dẫn đi qua một dòng
electron thẳng góc với nó, tuỳ thuộc năng lợng của dòng electron này lớn hay
nhỏ mà các ion đợc sản ra nhiều hay ít (nhìn chung năng lợng này khoảng
70ev).
Tách các ion theo khối lợng, về nguyên tắc việc tách này dựa trên sự khác
nhau về khối lợng của ion hơn là sự khác nhau về điện tích. Trớc tiên ngời
ta tăng tốc độ cho các ion, nhờ cho qua một điện trờng mạnh, vận tốc của các

e H
2Trong đó:
- R : Bán kính lệch.
- m: Khối lợng ion.
- e: Điện tích ion.
- H: Cờng độ từ trờng.
Một u điểm của sự kết hợp GC/MS là có thể đợc áp dụng một cách hữu
hiệu cho việc nghiên cứu và phân tích các chất đồng vị bền. Nhờ những u
điểm đó mà kỹ thuật phân tích GC/MS ngày càng đợc ứng dụng rộng rãi, có
thể kể ra một số ứng dụng phân tích sau:
- Phân tích các hợp chất chứa nhóm sunfua: áp dụng trong việc kiểm soát ô
nhiễm môi trờng đặc biệt là ô nhiễm bẩn dầu trong nớc biển và ô nhiễm
nguồn cung cấp thức ăn cho con ngời từ cá biển. Các hợp chất chứa
sunfua có thể coi là thớc đo đánh giá sự ô nhiễm trong cá và cá hồi. Trong
các nghiên cứu ngời ta nhận thấy C
3
H
17
- naphtalen ở giá trị m/z 170 và
C
3
H
7
- banzothiophen ở giá trị m/z 176, alkyl benothiophen C
10
H
10

tồn tại của nó trong môi trờng rất nguy hiểm đối với đời sống con ngời.
Mức độ độc hại của nitrosamin rất cao, vì vậy nó thu hút đợc sự chú ý của
rất nhiều nhà khoa học. Có thể sử dụng nhiều phơng pháp để xác định
nitrosamin nh GC, LC Tuy nhiên đối với chất này thì GC/MS vẫn là
phơng pháp không thể thiếu vì sử dụng GC/MS ta có thể xác định đ
ợc
cấu trúc hoá của các thành phần N- nitroso, đây là u điểm lớn của phơng
pháp.
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008

9
- Ngoài các nghiên cứu, ứng dụng trên, hiện nay phơng pháp GC/MS còn
đợc sử dụng rất nhiều trong phân tích d lợng các chất bảo vệ thực vật,
các chất kích thích, các hoá chất độc dễ bay hơi
ở trong nớc, việc tiếp cận với các kỹ thuật phân tích mới, đặc biệt là kỹ
thuật sắc ký khá phổ biến từ khoảng những năm 90, đây là thời kỳ một số
phòng thí nghiệm của các trờng đại học, các Viện nghiên cứu đợc trang
bị các hệ thống sắc ký hiện đại. Với sắc ký khí khối phổ (GC/MS) tuy cha
nhiều nhng bắt đầu có các nghiên cứu ứng dụng của các trờng đại học
nh Đại học Khoa học Tự nhiên với nghiên cứu: Phân tích các hợp chất
hữu cơ dễ bay hơi trong nớc bằng phơng pháp sắc ký khí khối phổ, dùng
kỹ thuật lấy mẫu bay hơi; Nghiên cứu xác định PANs trong khí thải nhà
máy giấy Bãi Bằng, của tác giả Phạm Hùng Việt và cộng sự; Nghiên cứu
xác định Chloramphenicol trong mẫu sinh học bằng phơng pháp sắc ký
khí khối phổ, của tác giả Vũ Công Sáu tuy nhiên cha có công bố
trong nớc nào về nghiên cứu ứng dụng GC/MS để xác định Clenbuterol
trong thực phẩm.

10
quả kiểm nghiệm đang còn gây nhiều tranh cãi. Để xác định hàm lợng
Clenbuterol trong các mẫu TĂCN Bộ NN&PTNN đã phải gửi mẫu thử sang
Singapore để kiểm tra. Việc làm này đã gây mất nhiều chi phí về tiền của và
thời gian.
Hiện nay, trên thế giới các phơng pháp dùng phát hiện Clenbuterol gồm:
phơng pháp Eliza, Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Sắc ký lỏng hiệu
năng cao khối phổ (LC/MS), Sắc ký khí khối phổ (GC/MS ) trong các
phơng pháp nêu trên, phơng pháp Eliza có u điểm phát hiện nhanh,
mang tính sàng lọc các mẫu thử nhng có độ tin cậy và độ chính xác không
cao. Để định lợng chính xác hàm lợng Clebuterol, ngời ta thờng sử dụng
phơng pháp HPLC/MS hoặc GC/MS. Tuy nhiên phơng pháp HPLC/MS có
độ nhậy thấp hơn, chi phí đắt hơn so với phơng pháp GC/MS; vì vậy xu
hớng xác định d lợng Clenbuterol bằng phơng pháp GC/MS ngày càng
đợc quan tâm ở nhiều nớc.
Theo các tạp chí phân tích chuyên ngành, những phơng pháp phát hịên
Clenbuterol và beta- agonists khác trong các mẫu sinh học đã đợc công bố
trên thế giới có thể thấy: những phơng pháp này phát hiện ở nhiều mức độ
khác nhau, từ phơng pháp miễn dịch enzyme (EIA- enzyme immunoassays),
sắc ký bản mỏng (TLC- thin layer chromatography) tới sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC- high performance liquid chromatography) và sắc ký khí khối phổ
(GC/MS gas chromatography- mass spectrometry) [9]. (Girault and
Fourtillan, 1990; Blanchflower et. al., 1993; Wilson et. al., 1994; Kingston et
al., 1995; Batjoens et al., 1996; Gigosos et al, 1996; Abou- Basha and Aboul-
Enen, 1996; Sangiorgi and Curatolo, 1997). Do có sự trùng hợp về các phản
ứng của beta- agonists và một số steroit, các phơng pháp EIA và RIA (radio
immunoassay) không xác định đầy đủ, chính xác sự hiện diện của các beta-
agonists trong các mẫu sinh học; do đó cần thiết phải sử dụng phơng pháp có
tính đặc hiệu cao. HPLC và GC đáp ứng đợc điều này nhng lại không xác
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008

Ngoài các nghiên cứu trên, một và tác giả trên thế giới còn sử dụng phơng
pháp Sắc ký khí quang phổ hồng ngoại chuyển hoá fourier để khẳng định sự
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008

12
có mặt của các beta- agonists trong mẫu (T.Visser, M J Vredenbreg and
A.PJM Jong), các công bố này cho thấy khi sử dụng kỹ thuật này khả năng
phát hiện các beta agonists khá cao [22].
Ngoài các nghiên cứu lựa chọn các phơng pháp để phát hiện Clenbuterol
nói riêng, các beta- agonists nói chung, các nhà khoa học trên thế giới
(Milagro Reig, Natalia Batlle, Jose Luis navarro, Fidel Toldra) cũng rất quan
tâm đến các nghiên cứu làm ổn định chúng trong quá trình phân tích [16].
Chiết tách, xử lý và làm sạch mẫu luôn là vấn đề quan tâm đối với các nhà
phân tích. Trong nghiên cứu xác định d lợng Clenbuterol, một số tác giả đã
đề cập đến xử lý mẫu nớc tiểu bằng chiết pha rắn (SPE) ( Christin Berggren,
Sami Bayoudh, David Sherington, Kees Ensing Department of Analytical
Chemistry and Toxicology, University Centre for Pharmacy, Antonius
Deusinglaan 1, 9713 AV Groningen, Netherlands; Department of Pure and
Applied Chemistry, University of Strathclyde), hay trong các mẫu thức ăn gia
súc và chế phẩm sinh học (Gianfranco Brambilla, Maurizio Fiori, Barbara
Rizzo, Vittorio Crescenzi, Giancarlo Masci- laboratorio Medicina Veterinaria,
Viale Regina Elena 299, 1-00161 Rome, Italy; Department of Chemistry,
University of Rome, Italy). Các nghiên cứu này đều cho thấy khi sử dụng kỹ
thuật chiết pha rắn (SPE), các mẫu phân tích đợc làm sạch và làm giầu lên rất
nhiều [4].
1.5 Các phơng pháp xác định Clenbuterol:
Hiện nay các phơng pháp cơ bản đợc sử dụng để xác định d lợng

có sự tơng tác với pha tĩnh dẫn đến thời gian lu của các cấu tử sẽ khác nhau.
Các cấu tử sẽ lần lợt ra khỏi cột và đi vào detector. Detector sẽ cho tín hiệu
khi có mặt một chất hoặc một nhóm chức nào đó. Tín hiệu của detector sẽ làm
biến đổi tín hiệu điện tỷ lệ với lợng cấu tử.
Tín hiệu đợc khuyếch đại và ghi lại thành sắc ký đồ. Việc phát hiện
đợc sử dụng nhiều với việc kết hợp quang phổ hồng ngoại (gas
chromatography fourier transform infrared spectrometry), hay khối phổ
(MS) [22]. Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008

14
Phần II : Thực nghiệm
2.1 Phơng pháp nghiên cứu.
2.1.1 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu phân tích.
1.Nguyên tắc chung
Tuỳ đối tợng phân tích, mục đích phân tích, phơng pháp phân tích mà qui
trình phân tích có các bớc cụ thể khác nhau. Tuy nhiên, nhìn chung các bớc
cơ bản của quá trình phân tích một mẫu bao gồm các bớc sau:
Nghiền nhỏ mẫu Đồng hoá Chiết tách

4. Các phơng pháp chiết tách mẫu
Chiết lỏng- lỏng:
Nguyên tắc: dựa trên cơ sở sự hoà tan ( hoặc phân bố ) khác nhau của
chất trong hai dung môi không trộn lẫn vào nhau.
Ví dụ: Chất X khi chiết đợc phân bố vào hai dung môi A, B không trộn lẫn
vào nhau, hệ số phân bố K
pb
đợc xác định:
K
pb
= C
x
( A )/ C
x
( B )
Trong đó: C
x
( A ) là nồng độ chất X trong A
C
x
( B ) là nồng độ chất X trong B
Nếu K > 99/1 thì coi nh chất X đã chuyển hết vào A
Các điều kiện để chiết:
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008

16
- Dung môi chiết phải có độ tinh khiết cao.

- Vi chiết pha lỏng tĩnh.
- Vi chiết pha lỏng động.
Chiết pha rắn
- Chiết pha rắn là kỹ thuật chuẩn bị mẫu nhằm làm sạch và làm giàu
mẫu trớc khi phân tích.
- Tiện ích: Tốn ít dung môi, tiết kiệm thời gian, loại các chất gây nhiễu
tốt hơn, cho độ thu hồi chất phân tích cao và sạch.
Ngời ta chia ra:
+ Dạng hấp phụ:
ở dạng này không có sự liên kết pha nhng dựa vào các nhóm chức
năng có mặt trong chất nhồi cột. Điển hình của dạng này là dùng pha thờng.
+ Dạng phân bố có liên kết pha:
Tơng tác ở đây có sự hấp phụ bề mặt cùng với liên kết cộng kết của
các nhóm chức năng hoá học ( đây là tơng tác chính). Có thể chia ra:
- Pha thờng:
Pha tĩnh phân cực, cho phép các chất tạp nhiễm không phân cực đi qua
và giữ lại các cấu tử cần phân tích phân cực
Dùng tách các chất từ dung môi không phân cực lên bề mặt chất phân
cực. ( Silica pha thờng, Florisil pha thờng )
- Pha ngợc:
Pha tĩnh không phân cực, sẽ giữ lại chất phân tích không phân cực, cho
phép chất phân cực đi qua.
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008

18
Dùng tách các chất phân tích khỏi một pha động phân cực vào một chất không
phân cực ( chất hấp phụ ). ( C8- C18 )

0
21
x
m
mm
R

=

Trong đó : m
1

: lợng chất xác định đợc trong mẫu tự tạo (àg).
m
2

:
Lợng chất xác định đợc trong mẫu trắng (àg).
m
0

: Lợng chất chuẩn trong hỗn hợp dùng để cho vào mẫu
tự tạo (àg) .
R : Độ thu hồi (%).
Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn xác định (LOD).
Giới hạn phát hiện LOD (Limit of detection) là lợng nhỏ nhất của chất
phân tích có thể phát hiện đợc đảm bảo sự khác biệt với mẫu trắng tới 95%;
thông thờng lấy gấp 3 lần độ lệch chuẩn của tín hiệu nhiễu.
Giá trị LOD đợc tính :
LOD = 3 (N/S)xC

chuẩn. Chất nội chuẩn có thể là chất lạ, cũng có thể là một cấu tử nào đó có
sẵn trên sắc đồ. Nếu là chất lạ thì thời gian lu của nó phải gắn với thời gian
lu của cấu tử cần phân tích.
2.1.6 Phơng pháp tự nội chuẩn.
Phơng pháp tự nội chuẩn là phơng pháp sử dụng chính cấu tử cần
phân tích bổ sung thêm vào mẫu. Sau đó so sánh sắc ký đồ của mẫu trớc và
sau khi bổ sung mẫu chuẩn.
2.2 Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu chính
Thiết bị, dụng cụ
- Sắc ký khí khố phổ GCMS Agilent
Gas Chromatograph Mass Spectrometer Agilent 6890
- Bộ cô quay chân không IKA- HB4
Rotary Evaporators IKA-HB4
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008

21
- Bể rửa dụng cụ ( pipet ) siêu âm
Untrasonic LC 60H, SIBATA
- Bộ khử ion nớc Barnstead
Compact ultrapur water system LF Bernstead
- Tủ sấy dụng cụ DG-82 Yamato
Drying Oven DG-82
- Cân kỹ thuật BV 320D Shimadzu
Balance BV 320 Shimadzu
- Máy nghiền mẫu IKA MF10
Analytical Mill IKA MF 10
- Máy ly tâm HETTICH- Rotina 35R

- N- methyl- N- (trimethylsilyl) trifluoro acetomide (MSTFA) : loại
dùng cho phân tích sắc ký, hãng Sigma, USA.
- Trimethylchlorosilane (TMCS), hãng Nacalai tesque, Japan
- Clenbuterol hydrochloride, hãng Dr. Ehrenstorfer, Germany
- Acebutolol hyhrochloride, hãng Sigma.USA
- Khí Nitơ : Độ tinh khiết 99,99%
- Cột làm sạch: C18, SCX,
-

2.3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận
2.3.1 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tách, làm sạch và làm giầu mẫu
Việc chiết tách, làm sạch và làm giầu mẫu là khâu rất quan trọng cho
mọi quá trình phân tích, đặc biệt là những chất phân tích có hàm lợng nhỏ
trong mẫu (dạng d lợng). ảnh hởng của giai đoạn này rất lớn, có thể chiếm
tới 70% sai số của cả quá trình phân tích. Trong nội dung nghiên cứu của đề tài
này, để đảm bảo cho việc chiết tách, làm sạch và làm giàu Clenbuterol từ mẫu
chúng tôi tiến hành xử lý mẫu theo các bớc sau:
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2008

23
a. Xử lý mẫu sơ bộ: Mẫu nghiên cứu đợc nghiền nhỏ bằng máy nghiền
và máy đồng hoá để phá vỡ tế bào (đối với thịt) và tăng cờng khả năng tiếp
xúc của mẫu với dung môi chiết ở bớc tiếp theo, tạo điều kiện cho quá trình
chiết mẫu đợc triệt để.
b. Chiết tách:
Chiết tách là bớc quan trọng trong quá trình phân tích, mục đích của
bớc này là lựa chọn dung môi để chuyển toàn bộ chất cần phân tích vào dung

24
độc hại bằng methanol. Chính vì vậy các nghiên cứu sau này đều sử dụng
HClO
4
0,1M cho quá trình chiết tách.
c. Làm sạch mẫu đã chiết tách.
Làm sạch bằng chiết lỏng - lỏng
Dựa trên các tài liệu tham khảo, việc chiết tách Clenbutarol tốt nhất là
dùng dung môi ethyl acetate isopropanol. Tuy nhiên việc thay đổi tỷ lệ dung
môi sẽ ảnh hởng đến khả năng chiết tách đối tợng phân tích có trong mẫu.
chính vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi thay đổi tỷ lệ hỗn hợp dung môi
để lựa chon hệ dung môi thích hợp nhất.
Kết quả nghiên cứu đợc trình bày tại bảng sau:
Bảng 2. Nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết lỏng- lỏng
STT Dung môi chiết tách Khả năng chiết
tách
Ghi chú
1 Ethyl acetate Isopropanol
(1:1), V/V
Tách kém Phân lớp kém
2 Ethyl acetate Isopropanol
(7:3), V/V
Tách không rõ Phân lớp
3 Ethyl acetate Isopropanol
(9:1), V/V
Tách tốt Phân lớp tốt

Kết quả ở bảng 2 cho thấy, khi thay đổi tỷ lệ dung môi chiết thì khả
năng chiết có sự khác biệt rõ rệt. Với dung môi có tỷ lệ 9:1 khả năng chiết tách
là tốt nhất.

Từ các kỹ thuật làm sạch và làm giàu mẫu đã biết, trên cơ sở tham khảo tài
liệu, chúng tôi lựa chọn phơng pháp làm sạch bằng chiết pha rắn (SPE
Cleanup):
- Chiết pha rắn là kỹ thuật chuẩn bị mẫu nhằm làm sạch và làm giàu
mẫu trớc khi phân tích.
- Nguyên tắc của chiết pha rắn: hấp phụ chất cần phân tích lên pha rắn,
sau đó chất phân tích đợc rửa giải bằng dung môi thích hợp.

Trích đoạn Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài n−ớc

---