BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***OOO***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH HỆ ENZYME AMYLASE
TỪ 3 CHỦNG TRICHODERMA

NGÀNH HỌC: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NIÊN KHÓA: 2002-2006
SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN NHƢ HIẾN
Thành phố Hồ Chí Minh
tháng 8/2006
2

3

TÓM TẮT

 Đề tài “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH HỆ ENZYME AMYLASE TỪ 3 CHỦNG
TRICHODERMA” thực hiện bởi sinh viên Nguyễn nhƣ Hiến, lớp DH02SH-
Khoa CNSH-Trƣờng Đại Học Nông Lâm dƣới sự hƣớng dẫn bởi Th.s Vƣơng
Thị Việt Hoa.
 Thời gian và địa điểm: Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 3/2006 đến tháng 6/2006,
Tại Phòng Vi Sinh - khoa Công Nghệ Thực Phẩm - trƣờng Đại Học Nông Lâm.
 Đề tài đƣợc thực hiện trên đối tƣợng vi nấm Trichoderm. sp gồm 3 chủng D13,
D14, D16. Chúng là vi nấm phân bố rộng rãi trong đất, có nhiều hệ enzyme
(cellulase, amylase…). Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát và đánh giá hoạt lực
hệ enzyme amylase của các chủng này (đƣợc cung cấp bởi phòng thí nghiệm
trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên), để từ đó bổ sung vào các ứng dụng: công
nghệ thực phẩm, công nghệ dệt, xử lý môi trƣờng…đáng chú ý là trong lĩnh vực
bổ sung vào trong thức ăn gia súc và các dạng phân bón sinh học.
 Những kết quả đạt đƣợc.
Chọn ra đƣợc chủng Trichoderma có hoạt tính hệ enzyme amylase phân giải
cao.
Khảo sát đƣợc các yếu tố ảnh hƣởng đến hệ enzyme amylase tách chiết từ môi
trƣờng nuôi cấy (thời gian, nhiệt độ, pH).
3.2.1. Phƣơng pháp định tính và sơ bộ định lƣợng hoạt độ enzyme amylase
bằng cách đo đƣờng kính vòng phân giải ...................................................................... 21
3.2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy Trichoderma và tách chiết hệ enzyme amylase
từ môi trƣờng nuôi cấy. ................................................................................................ 22
3.2.3. Phƣơng pháp khảo sát động học hệ enzyme amylase ......................................... 22
3.2.4. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của pH đối vối enzyme amylase. .................. 23
3.2.5. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối vối enzyme amylase ........... 24
3.2.6. Phƣơng phàp xác định hoạt tính hệ enzyme amylase.( Phƣơng pháp Heinkel ). 24 5

IV. KẾT QUẢ................................................................................................................ 28
4.1. Kết quả đếm số lƣợng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu. ..................................... 28
4.2. Kết quả định tính và sơ bộ định lƣợng hoạt độ enzyme amylase bằng cách đo
đƣờng kính vòng phân giải. ........................................................................................... 29
4.3. Kết quả khảo sát động học enzyme amylase. ......................................................... 31
4.4. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với enzyme amylase trên chủng
D13 ................................................................................................................................ 39
4.5. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH đối với enzyme amylase trên chủng D13. ... 41
V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................................... 43
VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 44
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 45

7
DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Dung dịch đệm Mc Hvaice. .......................................................................... 23
Bảng 3.2. Các dung dịch đệm pH 3 – 6,5. ..................................................................... 23
Bảng 3.3. Bảng xác định hoạt tính enzyme amylase ..................................................... 26
Bảng 3.4. Nồng độ dung dịch tinh bột........................................................................... 26
Bảng 3.5. Các dung dịch của đồ thị tiêu chuẩn. ............................................................ 27
Bảng 4.1. Kết quả đếm số lƣợng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu ............................. 28
Bảng 4.2. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 66 giờ. ...................................... 29
Bảng 4.3. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 84 giờ. ...................................... 30
Bảng 4.4. Kết quả đo OD của đồ thị tiêu chuẩn. ........................................................... 31
Bảng 4.5. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D13 theo thời gian nuôi cấy.. ............. 32
Bảng 4.6. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D14 theo thời gian nuôi cấy. .............. 34
Bảng 4.7. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D16 theo thời gian nuôi cấy.. ............. 36
Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với Enzyme Amylase của chủng D13 .............. 39
Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của pH đối với Enzyme Amylase của chủng D13. ..................... 41

9
PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Do áp lực kinh tế, việc tận dụng hiệu quả hơn nguồn thức ăn có hàm lƣợng dinh
dƣỡng thấp cho gia cầm ngày càng gia tăng. Mặt khác, các quy định trong sản xuất
thức ăn gia súc không cho phép sử dụng bất kỳ hoá chất hay thuốc khích thích nhằm
tăng trƣởng gia súc, nâng cao năng suất vật nuôi. Một phƣơng pháp phổ biến đang
đƣợc khuyến khích sử dụng rộng rãi để giải quyết vấn đề này là bổ sung các hệ
enzyme thủy phân vào thức ăn gia súc nhằm tăng cƣờng sự tiêu hoá và hấp thu các
chất dinh dƣỡng khó tiêu, hoặc loại bỏ các nhân tố kháng dinh dƣỡng .
Một trong những nguồn enzyme đáng chú ý là hệ enzyme từ vi nấm
Trichoderma. sp vi nấm này có nguồn enzyme phong phú, có hoạt lực mạnh và đƣợc
sử dụng nhiều mục đích khác nhau, chúng đƣợc ứng dụng trong các lĩnh vực nhƣ:

Tinh bột đƣợc tổng hợp ở thực vật gồm 2 thành phần chủ yếu:
 Amylose - polysaccharide tan trong nƣớc, cho phản ứng màu xanh với Iod.
Amylose có cấu tạo hoá học là chuỗi dài không phân nhánh của gốc
α – D - glucopyranose nối với nhau bằng lien kết α -1,4 glycoside. Phân tử
Amylose có trọng lƣợng khoảng 20000 - 50000, có dạng hình xoắn mỗi
vòng chứa 6 phân tử glucose.
 Amylopectin là polymer mạch nhánh chứa các đơn vị đƣờng đơn nối với
nhau bằng lien kết α -1,4 glycoside và α -1,6 glycoside . Amylopectin cho
màu tím đỏ với Iod. Trọng lƣợng phân tử thƣờng là vài triệu.
Đa số các dạng tinh bột chứa từ 15 - 25% Amylose và 75 - 85% Amylopectin.

2.2. Quá trình thủy phân tinh bột
2.2.1. Giới thiệu về enzyme
Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất là protein. Nó cho phép các phản
ứng cần thiết cho sự sống và sự sinh sản của tế bào diễn ra với tốc độ cao và với tính
chất đặc thù là không tạo ra các sản phẩm phụ nhƣ ở các phản ứng thông thƣờng.
Enzyme có trong tế bào của mọi sinh vật, không chỉ xúc tác cho các phản ứng trong cơ
thể sống mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào( invitro).
a) Tính chất hóa - lý. do enzyme có bản chất là protein nên chúng cũng có những tính
chất nhƣ các protein.
 Khi hòa tan trong nƣớc, enzyme cho một dung dịch keo với những tính
chất đặc trƣng nhƣ khuếch tán kém, áp suất thẩn thấu thấp, độ nhớt cao…
 Enzyme có tính lƣỡng cực.
11
 Mỗi enzyme có một điểm đẳng điện. tại điểm này, chúng có độ hòa tan
thấp nhất.
 Enzyme không chịu đƣợc nhiệt độ cao, dễ bị biến tính và mất hoạt tính

max
.
 Ảnh hƣởng nhiệt độ
Khi khảo sát vận tốc ban đầu của phản ứng theo nhiệt độ (in vitro), ngƣời ta
thấy xuất hiện hai kỳ (pha) riêng biệt tƣơng ứng hai hiện tƣợng khác nhau.
+ Ở nhiệt độ thấp (từ 0 – 40
o
C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng (do
nhiệt cung cấp năng lƣợng cho phản ứng).
+ Ở nhiệt độ cao sau đó (tùy thuộc vào từng enzyme), vận tốc phản ứng giảm
xuống do sự biến tính của protein. Đa số các enzyme mất hoạt tính
12
ở 80 – 100
o
C.
Khoảng nhiệt độ tối ƣu là khoảng nhiệt độ mà tại đó enzyme đạt hoạt tính cao
nhất.
Đa số các enzyme có nguồn gốc động vật nhiệt độ tối ƣu vào khoảng
40 – 50
o
C, và các enzyme thực vật khoảng 50 – 60
o
C.
 Ảnh hƣởng của pH.
Sự thay đổi pH gây nên:
+ Sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptide của
enzyme, làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức enzyme – cơ

với tâm hoạt động và làm mất hoàn toàn hoạt tính enzyme do đó chúng đƣợc gọi
là chất ức chế tự sát (suicide inhibitor).
2.2.2 Giới thiệu về Enzyme amylase
Enzyme amylase là nhóm enzyme phân giải tinh bột (carbohydrate).
Enzyme amylase bao gồm: α-amylase, β- amylase, R-Enzyme (α-1,6-glycosidase),
Amyloglycosidase…
Tùy theo nguồn gốc mà mỗi loại enzyme có trọng lƣợng phân tử, hoạt tính, điều kiện
phản ứng khác nhau.
 α –amylase từ vi khuẩn (chủ yếu từ Bacillus subtilis var amyloliquefaciens và
var amylosacchariticus).
MW : 49000 Da ( theo Fisher và Stein – 1960)
Hoạt tính: 4x10
5
SKB/g protein enzyme
Điều kiện phản ứng:
T
op
: 65-70
o
C
pH
op :
6,5-7,5
 α –amylase từ nấm Aspergillus orizae
MW : 51000 Da
Hoạt tính: 50000 SKB/g protein enzyme
Điều kiện phản ứng:
T
op
: 50-60

carbohydrate.
 R-Enzime còn gọi là α-1,6-glycosidase cắt các liên kết α-1,6-glycoside tại
điểm xuất pháp mạch nhánh.
 Ngoài ra Enzyme Amyloglycosidase lại có khả năng cắt từng đơn vị đƣờng
đơn (glucose) từ đầu của mạch carbohydrate.

15 Hình 2.2: Quá trình thủy phân Amylose.
16 Hình 2.3. Quá trình thủy phân Amylopectin và Glycogen.
17

2.3. Giới thiệu về Trichoderma
Persoon ex Gray (1801) phân loại Trichoderma nhƣ sau:

18

Hình 2.4: Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma.
2.3.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá.
Các loài Trichoderma thƣờng xuất hiện ở đất acid.
Trichoderma phát triển tốt ở bất cứ pH nào nhỏ hơn 7 và có thể phát triển tốt ở đất
kiềm nếu nhƣ ở đó có sự tập trung một lƣợng CO
2
và bicarbonat .
Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ carbonhydrat,
amino acid đến ammonia.
Hình 2.5. Trichoderma harzianum KRL-AG2 phát
triển trên môi trƣờng PDA (Vùng màu xanhchứa
bào tử).
Hình 2.4. Khuẩn ty và cơ
quan sinh bào tử của
Trichoderma
19
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

3.1. Vật liệu
3.1.1. Thời gian và địa điểm
Thí nghiệm đƣợc thực hiện từ tháng 3/2006 đến tháng 6/2006.
Địa điểm thí nghiệm tại Phòng Vi Sinh khoa Công Nghệ Thực Phẩm trƣờng Đại Học Nông

 Môi trƣờng Zapeck ( môi trƣờng cảm ứng tổng hợp enzym amylase)
NaNO
3
2 g
K
2
HPO
4
1g
MgSO
4
0,5g
KCl 0,5g
FeSO
4
0,01g
Agar 20 g
Nƣớc cất 1000 ml
Tinh bột 10 g
hấp khử trùng 121
0
C , 30 phút, pH 5.0 -5.5
 Môi trƣờng bán rắn
Môi trƣờng nuôi cấy ba chủng Trichoderma. sp để thu dịch chiết khảo sát hoạt tính
enzym amylase
Trấu 55 g
Cám gạo 30 g
Đƣờng thùng 4g
Bã khoai mì 5 g
Bột bắp 5 g

lƣợng .
+Chuẩn bị môi trƣờng Zapeck (0,5% tinh bột) cho 20 đĩa petri (400ml)
NaNO
3
0,8 g
K
2
HPO
4
0,4 g
MgSO
4
0,2 g
KCl 0,2 g
FeSO
4
0,004 g
Agar 8 g
Nƣớc cất 400 ml
Tinh bột 2 g
hấp khử trùng 121
0
C , 30 phút, pH 5.0 -5.5
 Cho vào ống nghiệm 20 ml môi trƣờng, hấp khử trùng 121
0
C trong 30 phút
 Sử dụng đĩa petri vô trùng, kích thƣớc bằng nhau. Cho 20 ml môi trƣờng trên từ ống
nghiệm vào.
 Cấy chấm mỗi chủng Trichoderma vào giữa đĩa Petri.
 Ủ nhiệt độ phòng ( 25-30

1 giờ.
 Sau 1 giờ, tiến hành lọc qua vải lọc.
 Dịch lọc đƣợc đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút.
 Thu lấy dịch ly tâm, định mức tới 100ml, sử dụng nhƣ dịch enzyme thô.
3.2.3. Phƣơng pháp khảo sát động học hệ enzyme amylase:
 Sử dụng chủng Trichoderma có hoạt tính cao, tiến hành nuôi cấy trong môi trƣờng bán
rắn.
 Khảo sát sự biến đổi hoạt tính của hệ enzyme amylase thủy phân chủ yếu theo thời gian
nuôi cấy : 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h.. Tại mỗi thời điểm nuôi cấy, cho khoảng 10 g
môi trƣờng hoà tan trong 100ml nƣớc cất, đem lọc thu dịch lọc. Dịch chiết đƣợc đem xác
định họat tính hệ enzym amylase.

23
3.2.4. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính của enzyme
 Chuẩn bị các dung dịch đệm ở các pH khác nhau
Dung dịch đệm Mc Hvaine ( pH 2,2-8)
A - Dung dịch acid citric 0,1M: 21,008 g acid citric trong 1 lit dung dịch.
B - Dung dịch Na
2
HPO
4
0,2M: 35,62 g Na
2
HPO

dung dịch “A” để đạt thể tích cuối cùng là 20 ml.

24

 Chuẩn bị canh trƣờng nuôi cấy Trichoderma, thời gian nuôi cấy là thời gian tối ƣu đã
đƣợc xác định ở mục trên.
 Sử dụng dịch chiết enzyme thô để khảo sát ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính enzyme.
 Cân 10g canh trƣờng, thêm vào 100ml dung dịch đệm có pH cần khảo sát.
 Dựng đồ thị biểu diễn sự biến thiên của hoạt tính enzyme đối với pH. Suy ra pH tối ƣu
(pH
op
) của enzyme .
3.2.5. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với họat tính của enzyme
 Chuẩn bị canh trƣờng nuôi cấy Trichoderma, thời gian nuôi cấy là thời gian tối ƣu đã
đƣợc xác định .
 Sử dụng dịch chiết enzyme thô để khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với họat tính của
enzyme : cân 10g canh trƣờng, thêm vào 100ml dung dịch đệm có pH tối ƣu đã đƣợc
xác định .
 Xác định hoạt tính của enzyme ở các nhiệt độ : 30
o
C, 40
o
C, 50
o

25
3.2.6.2 Hóa chất
-Dung dịch NaCl 0,1%: hòa tan 0,1g NaCl trong nƣớc thành 100ml.
-Dung dịch Sulfosalicylic acid 20%: hòa tan 20g Sulfosalicylic acid trong nƣớc thành 100ml.
-Dung dịch Iod (I
2
): hòa tan 1g Iod vào 5ml dung dịch có chứa 2g KI, thêm nƣớc cất đến
100ml. Khi dùng pha loãng dung dịch này 450 lần.
-Dung dịch NaH
2
PO
4
0,05M: hòa tan 1,9502 g NaH
2
PO
4
.2H
2
O trong nƣớc thành 250ml.
-Dung dịch Na
2
HPO
4
0,05M: hòa tan 0,8962 g Na
2
HPO
4
.12H
2
O trong nƣớc thành 50ml.

đều và tiếp tục giữ ở 30
o
C trong 30 phút. Lấy ống nghiệm ra khỏi và cho ngay vào 5ml
dung dịch Sulfosalicylic acid 20% để làm ngừng phản ứng.
 Song song với mẫu thí nghiệm, làm mẫu kiểm tra cũng tƣơng tự nhƣ trên nhƣng cho
dung dịch Sulfosalicylic acid 20% vào trƣớc, rồi mới cho enzyme vào sau.