BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA
TỪ LÔNG HEO

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 – 2007
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ NHA TRANG Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007 iii
LỜI CẢM ƠN

Kính dâng Bố và Mẹ, ngƣời đã sinh thành, dạy dỗ và luôn
động viên con để có đƣợc kết quả hôm nay.

Cảm ơn Anh hai đã hỗ trợ và động viên em trong suốt quá
trình học tập.

Cảm ơn gia đình thân yêu của tôi!
Sinh viên thực hiện

NGUYỄN THỊ NHA TRANG
v

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Đề tài “XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG HEO” đƣợc
tiến hành từ ngày 10 – 03 – 2007 đến ngày 10 – 07 – 2007 tại Trung Tâm Phân Tích
Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Hƣớng dẫn đề tài:
1. PGS. TS. Trần Thị Dân
2. KS. Nguyễn Văn Út
Việc ly trích DNA từ mẫu máu, mẫu da, mẫu cơ đã trở nên quen thuộc trong
các thí nghiệm sinh học phân tử trƣớc đây và hiện nay. Tuy nhiên, nhiều khi chúng ta
không thể có những loại mẫu đó, ví dụ trong khoa học hình sự, trong khảo cổ học, hay
khi nghiên cứu về những loài tiệt chủng hay loài quý hiếm, ta chỉ có đƣợc mẫu lông
hay tóc. Do đó, việc lấy mẫu lông hay tóc và ly trích DNA từ loại mẫu này trở nên rất
cần thiết trong những trƣờng hợp này.
Ngoài ra, việc thu thập mẫu lông dễ dàng hơn thu thập các loại mẫu khác (nhƣ
máu, da, cơ…) trên thú sống. Chúng ta có thể nhổ hoặc cắt một vài lông trên thú một
cách dễ dàng mà không phải giết mổ hay gây ra stress cho thú sống. Việc ly trích DNA
từ lông sẽ mở rộng ra cho ly trích DNA từ các cấu trúc tƣơng tự lông nhƣ móng, mỏ,
da, xƣơng…

Mục lục ......................................................................................................................... vii
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................... x
Danh sách các bảng ....................................................................................................... xi
Danh sách các hình và biểu đồ ..................................................................................... xii
PHẦN I. MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu .................................................................................................. 2
1.2.1. Mục tiêu ............................................................................................................. 2
1.2.2. Yêu cầu .............................................................................................................. 2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1. Cấu trúc của lông ...................................................................................................... 3
2.1.1. Cấu trúc tổng quan ............................................................................................. 3
2.1.2. Cấu trúc của melanin ......................................................................................... 4
2.1.3. Cấu trúc của keratin ........................................................................................... 4
2.1.4. Các liên kết trong lông ...................................................................................... 5
2.1.4.1. Liên kết cuộn xoắn A ............................................................................... 5
2.1.4.2. Liên kết trong protein keratin ................................................................... 6
2.1.4.3. Liên kết hydrogen ..................................................................................... 6
2.1.4.4. Liên kết muối ............................................................................................ 6
2.1.4.5. Liên kết cystine ......................................................................................... 6
2.1.4.6. Liên kết đƣờng .......................................................................................... 6
2.1.5. Chu kỳ phát triển của lông heo .......................................................................... 6
2.2. Những công trình tách chiết DNA từ lông ............................................................... 7
2.2.1. Những công trình tách chiết DNA từ lông ở nƣớc ngoài ................................. 7

viii

2.2.2. Những công trình tách chiết DNA từ lông ở trong nƣớc .................................. 9
2.3. Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) ........................................................... 10
2.3.1. Nguyên tắc cơ bản của PCR ............................................................................ 10

3.4.5. Điện di và quan sát kết quả .............................................................................. 22
3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose ............................................................................. 22
3.4.5.2. Đọc kết quả ............................................................................................ 22
3.5. Xử lý số liệu ........................................................................................................... 22
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 23
4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ proteinase K ....................................................... 23
4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ DTT .................................................................... 26
4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ CTAB ................................................................. 27
4.4. Thí nghiệm 4: Áp dụng quy trình ly trích DNA lên các vị trí lông heo ................. 29
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 30
5.1. Kết luận ................................................................................................................... 30
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 30
VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 31

x

Bảng 2.1. Đặc điểm các lớp của lông ............................................................................. 3
Bảng 3.4. Thành phần hỗn hợp PCR xác định gen halothane ...................................... 21
Bảng 3.5. Chu kỳ nhiệt trong PCR xác định gen halothane ......................................... 22
Bảng 4.1. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ proteinase K ............... 23
Bảng 4.2. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ DTT............................ 24
Bảng 4.3. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ CTAB ......................... 25
Bảng 4.4a. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các vị trí của lông heo .................. 26
Bảng 4.4b. Kết quả PCR ứng với các vị trí lông heo .................................................... 27
xii

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ


thịt, cơ… rõ ràng không phức tạp và dễ thành công. Các loại mẫu này thƣờng đƣợc
dùng trong hầu hết các nghiên cứu. Tuy nhiên, một số nguồn mẫu khác nhƣ lông, da,
xƣơng, móng… cũng cần đƣợc quan tâm. Lông có thể là nguồn DNA cho những
nghiên cứu không ảnh hƣởng đến cơ thể sống. Tuy nhiên, lông chứa một lƣợng rất nhỏ
DNA, do đó tìm ra một phƣơng pháp để tách chiết DNA từ lông là hết sức quan trọng.
Vấn đề quan tâm nhất hiện nay đối với mẫu lông là nó có lƣợng nhỏ DNA, chứa nhiều
protein ức chế và quy trình tách chiết không đặc hiệu. Do đó, hoàn thiện quy trình tách
chiết DNA từ lông cho những thí nghiệm xa hơn là cần thiết. Từ việc thử nghiệm
những quy trình ly trích, một bộ kit có thể đƣợc tạo ra sẽ giúp việc tách chiết đƣợc
thực hiện nhanh và có thể đƣợc thƣơng mại hóa.
Sự phát triển của ngành chăn nuôi hiện nay đặt ra những vấn đề nóng bỏng và
cấp bách. Đó là ảnh hƣởng của điều kiện nuôi lên năng suất vật nuôi, chất lƣợng sản
phẩm chăn nuôi, nhu cầu ngày càng tăng của con ngƣời, vấn đề lợi nhuận… Để đáp
ứng yêu cầu trên, các biện pháp chọn lọc và phối giống đã không ngừng đƣợc áp dụng.
Tuy nhiên, trong quá trình chọn lọc, một tình trạng cần quan tâm đó là hội chứng nhạy
cảm với stress. Hội chứng này đƣợc điều khiển bởi gen halothane, chi phối nhiều tính
trạng về tăng trƣởng, phẩm chất quầy thịt, năng suất sinh sản… đã gây nhiều thiệt hại
cho nhà chăn nuôi. Heo nhạy cảm stress có ƣu điểm là tỷ lệ nạc cao, mỡ lƣng thấp, hệ
số chuyển biến thức ăn tốt nhƣng có nhƣợc điểm là khả năng sinh sản kém, tỷ lệ thịt
PSE cao và tỷ lệ chết sau vận chuyển cao. Nhƣ vậy, một gen chi phối nhiều tính trạng,
vừa có lợi vừa không có lợi. Tùy mục đích sử dụng mà ngƣời ta sẽ loại bỏ hay giữ lại
2 gen này. Cho nên, việc phát hiện sớm, nhanh chóng, chính xác gen halothane ở thú
trƣớc khi đƣa vào sử dụng là rất cần thiết.
Đƣợc sự chấp thuận của Bộ môn Công nghệ sinh học - Trƣờng Đại Học Nông
Lâm TP.HCM và sự hƣớng dẫn của PGS. TS. Trần Thị Dân và KS. Nguyễn Văn Út,
tôi đã tiến hành đề tài “ Xác định quy trình ly trích DNA từ lông heo”.
1.2. Mục tiêu và yêu cầu

Lông gồm 3 lớp chính: lớp tủy ở trung tâm, lớp vỏ ở giữa và lớp sừng bao bên
ngoài. Mỗi lớp gồm những tế bào đƣợc phân hóa từ tế bào mầm trong nang lông. Mỗi
lớp của lông đƣợc mô tả theo bảng 2.1.
Bảng 2.1. Đặc điểm các lớp của lông
Đặc điểm Lớp tuỷ Lớp vỏ Lớp sừng
Trọng lƣợng (so với
trọng lƣợng sợi lông)
<2% 88% 10%
Dạng protein chính Trichohyalin Sợi keratin xoắn
α, protein liên kết
keratin (KAP)
Trichohyalin,
protein liên kết
keratin (KAP)
Dạng amino acid
chính
Glutamate, leucine,
glutamine, citrulline
Cysteine, serine,
glutamate
Cysteine, serine,
proline, glycine,
glutamate
Liên kết protein Glutamyl- lysine Cầu nối disulfide,
gốc kỵ nƣớc
Cầu nối disulfide,
nối isopeptide
(Nguồn: McNevin và cs, 2005)
Trong lớp tủy và lớp vỏ có những hạt sắc tố dạng trứng gọi là melanin.
Melanin không tách khỏi DNA bởi những quy trình ly trích thông thƣờng, nó đƣợc biết

Dƣới kính hiển vi, melanin có màu nâu, không khúc xạ và có lớp hạt với rất
nhiều hạt nhỏ đƣờng kính < 800 nm. Hỗn hợp loãng kali permanganate (KMnO
4
) là
một phƣơng pháp tẩy trắng melanin có hiệu quả.
2.1.3. Cấu trúc của keratin
Theo Eggling (2001, 2003), keratin thuộc nhóm protein cấu trúc, là những
protein dạng sợi. Keratin hình thành màng bảo vệ cho toàn bộ động vật có xƣơng
sống: da, lông, tóc, vuốt, móng, sừng, vảy, mỏ. Đơn vị cơ bản của lông là một sợi
protein dài hình thành theo cấu trúc xoắn alpha bậc hai. Ba trong số những protein
xoắn alpha xoắn quanh một sợi khác hình thành nên cấu trúc gọi là tiền fibrin. Một sợi
5 fibrin đƣợc tạo từ bảy tiền fibrin. Sau đó, hàng trăm sợi fibrin gắn vào một loại protein
dạng keo để hình thành nên sợi fibrin lớn. Những sợi fibrin lớn này đƣợc gắn vào tế
bào lông chết.
Keratin là một họ protein cấu trúc sợi, dai và không hoà tan. Keratin ở dạng
cấu trúc cứng nhƣng không bị khoáng hoá, đƣợc tìm thấy ở bò sát, chim, lƣỡng cƣ và
động vật có vú. Keratin cạnh tranh tính bền sinh học với chitin.
Có nhiều loại keratin, đôi khi chỉ trong một động vật nhƣ α-keratin, ß-keratin.
Xét về cấu trúc không gian, đặc tính làm keratin trở nên rắn chắc phụ thuộc vào
sự tập hợp cấu trúc siêu phân tử (thành phần và trình tự các amino acid của những mạch
polypeptide thành phần). Sự phối hợp của các cấu trúc α–helix, ß-sheet và cầu nối
disulfide sẽ quyết định cấu tạo của những protein chức năng, một vài trong số đó điều
khiển tính không hoà tan.
Xét về thành phần hóa học, keratin chứa một tỷ lệ cao glycine và một tỷ lệ
tƣơng đối cao alanine.
Xét về liên kết hóa học, ngoài những liên kết hydro trong phân tử và giữa các
phân tử, keratin còn có một lƣợng lớn sulfur trong các amino acid cysteine, đƣợc liên

phép chúng ta tạm thời thay đổi hình dạng của lông với sự trợ giúp của nƣớc. Những
liên kết này khi bị điện phân sẽ dễ dàng bị bẻ gãy và sữa đổi. Liên kết hydrogen đóng
vai trò trong 35% tính bền và 50% tính đàn hồi của lông (có một vài tranh luận cho
rằng nó đóng vai trò trong 99,9% tính đàn hồi của lông).
2.1.4.4. Liên kết muối
Liên kết muối là một dạng liên kết ion (điều khiển sự điện phân) bởi electron
chuyển từ nhóm amino bazơ (amino acid với nhóm –COO) sang nhóm amino axit
(amino acid với nhóm –NH
3
+
). Điều này xảy ra ở vị trí song song với đƣờng trục của
đƣờng xoắn luân phiên. Liên kết muối đóng vai trò trong 35% tính bền và 50% tính
đàn hồi của lông.
2.1.4.5. Liên kết cystine
Liên kết cystine đƣợc biết là liên kết disulfide, liên kết sulfur, liên kết -S đƣợc
tạo ra bởi những liên kết chéo giữa các cystine của chuỗi polypeptide. Liên kết này
thẳng góc với trục lông và nằm giữa những mạch polypeptide. Do vị trí của nó trong
7 lông, liên kết cystine giữ vai trò trong tính dai của lông và chống lại sự mài mòn lông.
Liên kết này cho phép nếp tóc uốn giữ đƣợc lâu.
2.1.4.6. Liên kết đƣờng
Liên kết đƣờng nằm giữa amino acid có nhóm –OH và nhóm amino axit. Liên
kết này thẳng góc với trục lông. Do vị trí của nó, liên kết đƣờng đóng vai trò trong tính
dai nhƣng không giữ vai trò trong tính bền (5%). Sự ẩm ƣớt ở lông là do một loại sản
phẩm phụ của loại liên kết này.
2.1.5. Chu kỳ phát triển của lông
Chu kỳ phát triển của lông chia làm 3 pha: pha anagen (pha phát triển), pha
catagen (pha chuyển tiếp) và pha telogen (pha nghỉ).