Lời cảm ơn
LỜI CẢM ƠN
Em chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Vũ Tuân, thầy đã hướng dẫn em suốt quá trình
thực hiện đề tài này. Trong quá trình làm việc cùng với thầy, em đã học hỏi được nhiều
điều bổ ích, không chỉ là những kiến thức chuyên môn mà còn cả những kinh nghiệm khi
làm việc. Khi em gặp khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài, thầy đã kòp thời hướng dẫn,
chỉ bảo tận tình.
Em gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lưu Thò Ngọc Anh, những lời truyền đạt của
cô thật sự bổ ích cho em trong quá trình em làm luận văn tại trường.
Em gửi lời cảm ơn đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt, cô đã giúp đỡ chúng em về mặt hóa
chất phục vụ cho việc thực hiện đề tài.
Em cảm ơn cô Thùy Dương - bộ môn Công nghệ Sinh học của trường Đại học Bách
khoa thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em về nguồn vi sinh vật sử dụng trong đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Thực phẩm,
trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện tốt nhất về mọi mặt
giúp chúng em thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp.
Tôi cũng muốn bày tỏ sự cảm ơn đến tất cả các bạn bè của tơi, họ đã giúp đỡ, đặc
biệt là cho tôi thấy được sự gắn bó, sự chia sẻ, sự cảm thông cũng như là những giây phút
thư giãn trong khi làm việc.
Tôi xin cảm ơn với tất cả lòng chân thành.
Tp. HCM, ngày 07 tháng 01 năm 2008
Phan Anh Tuấn
i
Tóm tắt luận văn
TÓM TẮT LUẬN VĂN
Acetobacter xylinum (A. xylinum) là một vi khuẩn Gram âm, có thể sản xuất một loại
polysaccharide ngoại bào được gọi là cellulose vi khuẩn. Cellulose vi khuẩn có khả năng
được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm và các lónh vực khác. Để ứng dụng
cellulose vi khuẩn một cách rộng rãi, đòi hỏi có nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi
dào và ổn đònh. Gần đây, ứng dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao thực phẩm đã được
phát hiện và ứng dụng thực tế. Với mục đích sản xuất cellulose vi khuẩn phục vụ mục đích

,
pH môi trường được chỉnh xung quanh giá trò 5,0.
ii
Tóm tắt luận văn
Với kết quả thu được trong các thí nghiệm, môi trường nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum
có tại Phòng Thí nghiệm Sinh học trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh với
mục đích thu nhận cellulose nên bao gồm các thành phần sau: 15,5 gl
-1
mannitol; 6,5 gl
-1
cao
nấm men; 5,0 gl
-1
Na
2
HPO
4
; 1,115 gl
-1
acid citric; pH được điều chỉnh về 5,0 là thích hợp cho
quá trình nuôi cấy. Các kết quả quả thí nghiệm này cung cấp những thông tin hữu ích cho sự
phát triển khả năng sản xuất cellulose vi khuẩn trên quy mô công nghiệp.
iii
Mục lục
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN.............................................................................................................................i
TÓM TẮT LUẬN VĂN...........................................................................................................ii
MỤC LỤC ............................................................................................................................iv
DANH MỤC HÌNH.................................................................................................................vi
DANH MỤC BẢNG...............................................................................................................vii

iv
Mục lục
2.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH......................................................................................33
2.6.1 Số lượng vi khuẩn...........................................................................................33
2.6.2 Hàm lượng cellulose.......................................................................................33
2.6.3 Phân tích thống kê..........................................................................................34
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..........................................................................35
3.1 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG VI KHUẨN A. XYLINUM..............................................35
3.2 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HP CELLULOSE...........................................................36
3.3 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA PH LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN A.
XYLINUM ...............................................................................................................38
3.4 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CARBON VÀ NITƠ LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HP
CELLULOSE CỦA VI KHUẨN A. XYLINUM .....................................................................40
3.4.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon.........................................................................40
3.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ .............................................................................43
3.5 TỐI ƯU HOÁ NỒNG ĐỘ NGUỒN CARBON VÀ NITƠ................................................................45
BẢNG 4.1: BẢNG KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM TỐI ƯU...................................................................46
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...........................................................................49
4.1 KẾT LUẬN.................................................................................................................49
4.2 ĐỀ NGHỊ....................................................................................................................49
v
Danh mục hình
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn.............................................4
Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b)......................................................6
Hình 2.3: SEM của A. xylinum....................................................................8
Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose trong A. xylinum.......................................................11
Hình 2.5: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn.................................12
Hình 2.6: Sự giải phóng cellulose ra môi trường ngoài từ A. xylinum.....13
Hình 2.7: Cellulose đư c t o thành trong điều kiện nuôi cấy tónh và cóợ ạ

- BASYC®: bacterial synthesised cellulose
- Cel
-
: non-producing mutants – chủng vi khuẩn đột biến không tổng hợp cellulose.
- cfu: cololy-forming units – khuẩn lạc
- CS: cellulose synthase
- CSL: corn steep liquor
- DAP: diamon phosphate
- DP: degree of polymerization
- FK: Fructosekinase
- FBP: Fructose-1,6-biphosphate phosphatase
- Fru-bi-P: Fructose-1,6-bi-phosphate
- Fru-6-P: Fructose-6-phosphate
- GK: Glocosekinase
- G6PDH: Fructose-1-phosphate kinase
- Glc-6-P: Glucose-6-phosphate
- Glc-1-P: Glucose-1-phosphate
- HS: Hestrin-Schramm
viii
Danh mục viết tắt
- HR/MAS
1
H NMR: high resolution/magic angle spinning hidrogen-1 nuclear
magnetic resonance.
- PGI: Phosphoglucoisomerase
- PGM: Phosphoglucomutase
- PTS: Phosphatransferase
- PGA: Phosphogluconic acid
- S/V: surface/volume ratio - tỉ lệ diện tích/thể tích
- SEM: Scanning electronic microscopy

màng. Với mục đích đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn
từ Acetobacter xylinum” dưới điều kiện nuôi cấy tónh với mong muốn thu được các kết quả
hữu ích cho các nghiên cứu trong tương lai.
Trong nội dung thực hiện, chúng tôi tập trung khảo sát các yếu tố sau:
- Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum trên môi trường
HS.
1
Chương 1. Mở đầu
- Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum trên
môi trường HS.
- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A.
xylinum.
- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A.
xylinum.
- Tối ưu hoá thành phần môi trường lên men thu nhận cellulose vi khuẩn nhằm nâng
cao hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum.
Với kết quả thu được, phần nào sẽ cung cấp những thông tin hữu ích cho các nghiên
cứu tiếp theo, đầy đủ hơn để có thể ứng dụng sản xuất cellulose vi khuẩn trên quy mô công
nghiệp.
2
Chương 2. Tổng quan tài liệu
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Cellulose vi khuẩn và vi sinh vật tổng hợp cellulose
2.1.1 Lòch sử nghiên cứu sự sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn.
Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A. xylinum lần đầu tiên được
báo cáo bởi Brown et al. (1986). Theo đó, khi nghiên cứu về vi khuẩn acetic, Brown đã phát
hiện và quan sát thấy một khối rắn mà theo ông lúc đó khối rắn này không nằm trong các
kết quả nghiên cứu ông dự đònh trước. Khối rắn này khó bò phân hủy và giống với mô động
vật. Hợp chất đó sau này được xác đònh là cellulose và vi khuẩn tổng hợp ra nó là
Bacterium xylinum (Brown et al., 1986).

kính của cellulose thực vật (Bielecki et al., 2001) (hình 2.2).
2.1.2.3 Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn.
Ngày nay nhờ vào các kỹ thuật công nghệ hiện đại người ta đã xác đònh được cấu
trúc của cellulose vi khuẩn. Chẳng hạn như kỹ thuật nhiễu xạ tia X giúp xác đònh được kích
4
Chương 2. Tổng quan tài liệu
thước và phân biệt cấu trúc cellulose vi khuẩn. Những kỹ thuật khác như phổ hồng ngoại,
phổ Raman, và phổ cộng hưởng từ hạt nhân giúp xác đònh các dạng kết tinh của cellulose
(Bielecki et al., 2001).
Như các cellulose tự nhiên khác, cellulose vi khuẩn được tạo thành bởi hai loại cấu
trúc tinh thể riêng biệt, cellulose I
α
và I
β
. Trong vi sợi cellulose đều có sự tham gia của hai
loại cấu trúc tinh thể này (Yamamoto & Horii, 1993). Trong khi hầu hết tinh thể I
β
tinh khiết
thu được từ cellulose thực vật thì vẫn chưa có cách nào thu nhận được các tinh thể I
α
tinh
khiết từ nguồn này. Cấu trúc của cellulose được tổng hợp từ vi khuẩn A. xylinum chứa nhiều
tinh thể I
α
hơn cellulose thực vật, hàm lượng loại tinh thể này có thể lên đến hơn 60%. Tỉ lệ
này có thể dao động trong khoảng 64% đến 71% tuỳ vào chủng vi sinh vật và nhiệt độ môi
trường (Yamamoto & Horii, 1994). Ngược lại I
β
chủ yếu có trong thành phần cellulose hình
thành nên thành tế bào của một số loài thực vật bậc cao như cotton và gai. Ở đó, cellulose I

2.1.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulose.
Cellulose vi khuẩn được nhiều loài vi sinh vật tổng hợp trong đó chủng A. xylinum
được biết đến nhiều nhất, đây cũng là loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose hiệu quả nhất
và được tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Cấu trúc của cellulose được tổng hợp bởi các vi
sinh vật khác nhau là khác nhau. Sau đây là bảng tổng quan về các loài vi sinh vật có khả
năng tổng hợp cellulose.
Bảng 2.1 Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose
(Jonas et al., 1998)
Vi sinh vật Cấu trúc cellulose Vai trò sinh học
Acetobacter Lớp màng ngoại bào Để giữ vi khuẩn trong môi trường
6
Chương 2. Tổng quan tài liệu
Dải cellulose hiếu khí
Achromobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải
Aerobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải
Agrobacterium Sợi ngắn Tham gia vào mô thực vật
Alcaligenes Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải
Pseudomonas Các sợi không tách biệt Sự kết bông trong nước thải
Rhizobium Sợi ngắn Tham gia vào hầu hết thực vật
Sarcina Cellulose dò hình Không rõ
Zoogloea Chưa xác đònh rõ cấu trúc Sự kết bông trong nước thải
Trong đó, Acetobacter được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất trong việc sản xuất
cellulose. Đặc biệt là A. xylinum vì những đặc điểm ưu việt của nó như: năng suất tạo
cellulose cao, cấu trúc cellulose phù hợp cho các mục đích sử dụng…
2.1.3.1 Phân loại A. xylinum
A. xylinum là một vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này bao gồm các
giống sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter, Gluconobacter và Kozakia.
Các loài vi khuẩn này trước đây được gọi với các tên gọi Acetobacter xylinus hay
Acetobacter xylinum, sau đó được xếp lại vào giống Gluconacetobacter với tên gọi
Gluconacetobacter xylynus.

8
Chương 2. Tổng quan tài liệu
Đặc điểm sinh trưởng của A. xylinum
Lớp màng cellulose tạo ra gây trở ngại đến khả năng biến dưỡng, vận chuyển chất
dinh dưỡng và oxi đến tế bào. Tuy nhiên lớp màng này có thể giữ nước nên giúp vi khuẩn
có thể phân hủy chất dinh dưỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại tia UV.
A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau và tùy thuộc vào chủng vi
khuẩn mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Chẳng hạn chủng A. xylinum BPR 2001
sử dụng fructose tốt nhất (Matsuoka et al., 1993) trong khi chủng A. xylinum IFO 13693 sử
dụng glucose hiệu quả hơn (Masaoka et al., 1993)… A. xylinum có thể chuyển hóa glucose
thành acid gluconic, điều này là nguyên nhân làm cho pH của môi trường nuôi cấy giảm từ
1 đến 2 đơn vò trong quá trình nuôi cấy.
Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển từ 25
0
C đến 30
0
C và pH từ 5,4 đến 6,3.
Theo Hestrin (1947) thì pH tối ưu để A. xylinum phát triển là 5,5 và không phát triển ở nhiệt
độ 37
0
C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Theo Maccormide et al. (1996) cho
rằng A. xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 đến 8, nhiệt độ từ 12
0
C đến 35
0
C và
có thể phát triển trong môi trường có nồng độ ethanol lên tới 10%.
Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, lúc còn non khuẩn lạc mọc riêng lẻ, khuẩn lạc
nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày. Khi già tế bào mọc dính thành cụm, và
chúng mọc theo đường cấy giống.

qua 3 bước có sự tham gia của 3 loại enzyme. Những bước này là sự phosphoryl hoá của
glucose bởi xúc tác của enzyme glucokinase thành glucose-6-phosphate, sự izomer hoá của
glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate bởi phosphoglucomutase, và sự tổng hợp
UDP-Glucose bởi UDP-Glucose pyrophosphorylase. UDP-Glucose pyrophosphorylase đóng
vai trò then chốt trong sự sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum trong khi các
chủng A. xylinum đột biến không có khả năng tổng hợp cellulose bò thiếu enzyme này (Valla
& Kjosbakken, 1981).
10
Chương 2. Tổng quan tài liệu

Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose trong A. xylinum (Canon &
Anderson, 1991)
2.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn
Quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum trên được chia thành hai giai đoạn
chính: giai đoạn polymer hóa và giai đoạn kết tinh.
2.2.2.1 Giai đoạn polymer hóa
Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển
glucose thành glucose-6-phosphate (Glc-6-P). Sau đó enzyme phosphoglucomutase (PGM)
tiếp tục chuyển hóa glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate (Glc-1-P) thông qua
phản ứng isomer hóa. Glucose-1-phosphate được enzyme UDP-Glucose pyrophospholyase
chuyển hóa thành UDP-Glucose. Cuối cùng, UDP-Glucose được polymer hóa thành
cellulose và cellulose được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là
cellulose synthase (Iguchi et al., 2000).
Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng đường fructose hiệu quả hơn sẽ tạo cellulose
theo con đường sau: lúc này hệ thống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển fructose thành
fructose–1-phosphate. Sau đó fructose-1-phosphate sẽ được chuyển hóa thành fructose-1,6-
biphosphate nhờ enzyme fructose–1-phosphatekinase. Sau đó, enzyme phosphoglucose
isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển hóa fructose-6-phosphate thành glucose-6-
phosphate. Tiếp theo glucose-6-phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hóa tương tự
như trên để tạo ra cellulose (Iguchi et al., 2000).

13
Chương 2. Tổng quan tài liệu
Dù vẫn được sử dụng để sản xuất cellulose nhưng nuôi cấy tónh cho sản lượng thấp
và mang tính thủ công. Do đó, để sản xuất công nghiệp, cần thiết để thiết lập hệ thống sản
xuất hàng loạt sử dụng kó thuật nuôi cấy hiệu quả hơn (Edwards, 1995).
b) Nuôi cấy có khuấy đảo
Tiến hành nuôi cấy trong thiết bò lên men chứa dung dòch môi trường, có cánh
khuấy, thổi khí oxy hoặc lắc. Vi khuẩn phân bố đều trong toàn dung dòch và phát triển theo
chiều sâu của môi trường. Cellulose được tạo ra có dạng viên hình cầu, elip…
Đây là kó thuật nuôi cấy mong đợi sẽ đem lại hiệu quả tạo cellulose cao, có thể ứng
dụng trong sản xuất cellulose vi khuẩn thương mại nhưng hiện nay cellulose vi khuẩn chỉ
mới được sản xuất với sản lượng thấp. Sản xuất cellulose từ A. xylinum bằng phương pháp
nuôi cấy có khuấy đảo gặp phải một số trở ngại, trở ngại lớn nhất cho đến nay là tính không
ổn đònh khi nuôi cấy. Tính không ổn đònh được thể hiện bởi sự mất khả năng sản xuất
cellulose và thay thế dần tế bào sản xuất cellulose bằng chủng đột biến không có khả năng
sản xuất cellulose (Hai-Peng et al., 2002; Chao et al., 1997).
Từ việc quan sát thấy rằng cellulose tổng hợp nhanh khi tế bào A. xylinum được gắn
vào những phần tónh trong bình lên men như điện cực, cánh khuấy, màng ngăn, Vandamme
et al. (1998) đã giới thiệu “điểm dính đa chức năng” trong bình nuôi cấy bằng cách cung cấp
vào môi trường những phần tử nhỏ không tan như diatonit, silicagel, cát biển, những hạt
thủy tinh nhỏ, đất mùn, cellulose thực vật được giã nhỏ... Nồng độ phần tử nhỏ đưa vào
được tối ưu tuỳ theo mức độ khuấy, cũng như mức độ lắc của khay (Yoshinaga et al., 1997).
Sự lựa chọn kỹ thuật nuôi cấy phụ thuộc vào mục đích thương mại của polymer sinh
học, hơn nữa cấu trúc cellulose và đặc tính cơ lý của nó bò ảnh hưởng rất lớn của phương
pháp nuôi cấy (Hai-Peng et al., 2002). Trong điều kiện nuôi cấy bề mặt, màng cellulose dày
được tạo thành trên bề mặt môi trường nuôi cấy. Trong khi dưới điều kiện nuôi cấy chìm,
cellulose lại được sản xuất dưới dạng huyền phù thớ sợi, những khối không đều, dạng viên
kết hay dạng cầu kích thước từ 10 µm đến 1000 µm.
14
Chương 2. Tổng quan tài liệu