TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

VŨ THANH HÀ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP
DICLOFENAC NATRI TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS TRONG
MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý người và động vật

Hà Nội, tháng 5 năm 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

VŨ THANH HÀ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP
DICLOFENAC NATRI TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS TRONG
MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý người và động vật

Người hướng dẫn khoa học

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin khẳng định kết quả khóa luận “Nghiên cứu khả năng giải
phóng thuốc của vật liệu Cellulose nạp Diclofenac Natri tạo ra từ
Gluconacetobacter Xylinus trong môi trường nước dừa già” là kết quả
nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn của ThS. Ngô Thị Hải Yến,
giảng viên trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Những số liệu kết quả trong
khóa luận này là trung thực, không có sự sao chép của đề tài khác. Đề tài này
chưa từng công bố ở đâu và hoàn toàn không trùng với công trình nghiên cứu
của các tác giả khác. Trong đề tài, tôi có trích dẫn một số dữ liệu của một số
tác giả, tôi xin phép tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của
mình.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Vũ Thanh Hà


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

STT

KÍ KIỆU VIẾT TẮT

NỘI DUNG

1

BC


Ultraviolet visible


MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
1. Lý do chọn đề tài ................................................................................................ 1
2. Mục đích của nghiên cứu ................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn............................................................................ 2
5. Tính mới của đề tài (nếu có) .............................................................................. 3
NỘI DUNG ............................................................................................................ 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 4
1.1.Giới thiệu cellulose vi khuẩn ( CVK) .............................................................. 4
1.1.1. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter Xylinus ................................... 4
1.1.2. Màng cellulose vi khuẩn .............................................................................. 4
1.2.Thuốc Diclofenac Natri .................................................................................... 5
1.2.1.Công thức hóa học và tên gọi ....................................................................... 5
1.2.2.Tính chất........................................................................................................ 6
1.2.3.Công dụng và cơ chế tác động của Diclofenac ............................................ 6
1.2.4. Động học giải phóng của thuốc ................................................................... 6
1.2.5.Dược lực học của thuốc ................................................................................ 7
1.2.6.Tác dụng không mong muốn của thuốc ........................................................ 7
1.3.Tình hình trên thế giới và Việt Nam ................................................................ 8
1.3.1. Trên thế giới ................................................................................................. 8
1.3.2. Ở Việt Nam .................................................................................................. 9
CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 10
2.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................... 10

Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men tạo màng Cellulose vi khuẩn ..... 12
Bảng 2.2. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác
nhau (n=3) ở bước sóng 276nm ........................................................ 15
Bảng 2.3. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác
nhau (n=3) ở bước sóng 278nm ........................................................ 16
Bảng 2.4. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác
nhau (n =3) ở bước sóng 281nm ....................................................... 17
Bảng 3.1. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác
nhau trong các môi trường pH khác nhau đối với màng không ép .. 26
Bảng 3.2. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác
nhau trong các môi trường pH khác nhau đối với màng ép ............. 28
Bảng 3.3. Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng chưa ép ở các môi trường pH
khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n=3) ................... 30
Bảng 3.4. Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng ép ở các môi trường pH khác
nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n=3) ........................... 32
Bảng 3.5. Tỷ lệ thuốc Diclofenac được giải phóng cực đại tại 24 giờ của màng
trong các môi trường pH khác nhau ................................................. 34


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Diclofenac .................................................... 6
Hình 2.1. Sơ đồ xử lý CVK sau khi lên men .................................................. 13
Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 276nm ... 15
Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278nm ... 16
Hình 2.4. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 281nm ... 17
Hình 3.1. Màng CVK được nuôi cấy trong môi trường nước dừa già............ 21
Hình 3.2. Màng thu được sau quá trình nuôi cấy ............................................ 22
Hình 3.3. Màng CVK được bảo quản trong tủ lạnh ........................................ 22
Hình 3.4. Màng CVK đang được xả dưới vòi nước........................................ 23
Hình 3.5. Màng CVK thu được sau quá trình hấp thụ .................................... 24

thích hợp những vi khuẩn này có khả năng hình thành trên một lớp màng
cellulose sinh học thuần khiết được gọi là màng cellulose vi khuẩn (CVK) [5].
Màng CVK đang là nguồn vật liệu mới được quan tâm, thu hút sự chú ý
của các nhà nghiên cứu nhờ những đặc tính ưu việt mà nó đem lại như: Màng
CVK có độ tinh khiết cao, độ dẻo dai cơ học lớn và đặc biệt có khả năng hút
nước và giữ nước rất tốt. Hiện nay màng CVK đang được áp dụng trong nhiều
lĩnh vực khác nhau. Điển hình, trong lĩnh vực y học, khi điều trị bỏng màng
CVK đã được ứng dụng làm da nhân tạo thay thế tạm thời. Ngoài ra màng
CVK còn là tác nhân chuyển thuốc và là chất làm co mạch. [12,21].
Ở Việt Nam, màng CVK có nhu cầu sử dụng cao nhưng giá thành
nhập khẩu từ nước ngoài rất lớn và việc nghiên cứu màng CVK còn ở mức
hạn chế.Tuy nhiên, bằng phương pháp lên men tĩnh vi khuẩn
1


Gluconacetobacter Xylinus chúng ta hoàn toàn có thể tự sản xuất màng CVK
để ứng dụng trong thực tiễn.
Với mục đích tạo ra màng CVK dựa trên loài vi khuẩn thuộc chủng
Gluconacetobacter Xylinus, từ đó tìm hiểu khả năng giải phóng của thuốc
Diclofenac ở môi trường nước dừa già, chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên
cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu Cellulose nạp Diclofenac Natri
từ Gluconacebacter Xylinus trong môi trường nước dừa già.”
2. Mục đích của nghiên cứu
Khảo sát, đánh giá khả năng giải phóng thuốc Diclofenac Natri của vật liệu
cellulose trong môi trường nước dừa già thông qua các thí nghiệm đã thiết kế.
3. Nội dung nghiên cứu
- Chế tạo màng CVK từ Gluconacetobacter Xylinus trong môi trường
nước dừa già.
- Nạp Diclofenac vào màng BC.
- Tiến hành giải phóng thuốc Diclofenac qua màng, xác định lượng


từ

chủng


5. Tính mới của đề tài (nếu có)
Bổ sung các dữ liệu khoa học về cơ chế giải phóng thuốc Diclofenac
Natri từ các loại vật liệu CVK nạp thuốc trong các môi trường giải phóng
thuốc mô phỏng theo đường dạ dày – ruột khác nhau.
Kết quả của đề tài có thể là cơ sở định hướng cho việc ứng dụng sản
xuất các chế phẩm chữa bệnh từ vật liệu CVK nạp thuốc.

3


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu cellulose vi khuẩn ( CVK)
1.1.1. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter Xylinus
Gluconacetobacter Xylinus được xếp vào chi Gluconacetobacter, thuộc
họ vi khuẩn Acetobacteraceae [8].
Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc,
hóa dị dưỡng. Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh trong môi trường nuôi cấy dịch
thể, chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng cellulose [8].
Sự phát triển của Gluconacetobacter và khả năng tổng hợp cellulose
tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu có trong môi trường nuôi cấy.
Một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn
Gluconacetobacter Xylinus: độ pH thấp, lượng oxy cần cung cấp rất lớn, nhiệt
độ thích hợp là 25-30ºC [8].

cấy nên ta có thể kiểm soát được kích thước, lý tính cũng như chất lượng của
cellulose trong quá trình nuối cấy [6].
Cellulose được xem là nguồn vật liệu có nhiều ưu thế nên hiện nay ứng
dụng của cellulose đang được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực:
Trong y học: Màng CVK từ Gluconacetobacter Xylinus tẩm mù u có
tác dụng giống màng sinh học trị bỏng. Đặc biệt, người ta đã sử dụng màng
CVK tinh sạch để làm da nhân tạo trong chữa vết thương [12].
Trong thực phẩm: các sản phẩm ứng dụng của CVK như màng bao
thực phẩm, một số món tráng miệng, …
1.2. Thuốc Diclofenac Natri
1.2.1.Công thức hóa học và tên gọi
Diclofenac là một thuốc chống viêm không steroid[2].
+ Công thức phân tử: C14H11Cl2NO2
+ Tên quốc tế: Diclofenac Natri
+ Tên IUPAC: 2-(2-(2,6- dichlorophenylamino)phenyl)acetic acid
+ Công thức cấu tạo: được mô tả ở hình 1.1
5


Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Diclofenac
1.2.2.Tính chất
- Diclofenac Natri là chất bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng, hút ẩm nhẹ.
- Diclofenac Natri dễ tan trong methanol, trong ethanol 96%, hơi tan
trong nước, khó tan trong aceton [4].
- Nóng chảy ở khoảng 280°C [4].
1.2.3.Công dụng và cơ chế tác động của Diclofenac
Diclofenac- một dẫn chất của acid phenylacetic. Diclofenac là thuốc
chống viêm không steroid[2] có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt
mạnh. Ngoài ra, Diclofenac cũng có thể được sử dụng để điều trị các cơn đau
khác (như đau răng, đau sau khi sinh). Tuy nhiên với các cơn đau nghiêm

1.2.5. Dược lực học của thuốc
Diclofenac có cấu trúc liên quan với Meclofenamat Natri và Acid
Meclofenacmic và có tác động dược lí tương tự như các NSAID nguyên thủy
khác. Thuốc có tác dụng kháng viêm, giảm đau và hạ sốt. Tác dụng của thuốc
là làm thoái hóa mạch máu mới sinh trong mô viêm của động vật. Ngoài ra
còn làm ức chế sự hình thành mạch máu. Cơ chế hoạt động của thuốc chưa
được xác lập rõ ràng, nhưng có nhiều tác dụng liên quan đến sự ức chế tổng
hợp prostaglandin [2].
1.2.6.Tác dụng không mong muốn của thuốc
(5 - 15% người bệnh dùng Diclofenac bị ảnh hưởng bởi tác dụng phụ ở
bộ máy tiêu hóa) [2].
Chú ý: Trong số các thuốc chống viêm không steroid, Diclofenac độc
hơn Ibuprofen và Ibuprofen, là thuốc ít độc nhất nhưng vẫn hiệu quả.
Tác dụng phụ thường gặp, ADR > 1/100
Toàn thân: Đau đầu, bồn chồn.

7


Tiêu hóa: Ðau vùng thượng vị, buồn nôn, nôn, ỉa chảy, trướng bụng,
chán ăn, khó tiêu.
Gan: Tăng các transaminase.
Tác dụng phụ ít gặp, 1/1000 < ADR < 1/100
Toàn thân: Phù, dị ứng (đặc biệt co thắt phế quản ở người bệnh hen),
choáng phản vệ kể cả tụt huyết áp, viêm mũi, mày đay.
Tiêu hóa: Ðau bụng, chảy máu đường tiêu hóa, làm ổ loét tiến triển,
nôn máu, ỉa máu, ỉa chảy lẫn máu, kích ứng tại chỗ (khi đặt thuốc vào trực
tràng).
Hệ thần kinh: Buồn ngủ, ngủ gật, trầm cảm, mất ngủ, lo âu, khó chịu,
dễ bị kích thích.

1.3.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam việc nghiên cứu BC làm tác nhân vận chuyển thuốc còn là
một hướng đi mới. Các nghiên cứu và ứng dụng của màng CVK mới dừng lại
ở mức độ khiêm tốn và hầu hết là ở điều kiện phòng thí nghiệm.
Hiện nay, chúng ta đã có thể tự sản xuất màng CVK bằng phương pháp
sản xuất đơn giản là lên men tĩnh. Phương pháp này sử dụng trang thiết bị đơn
giản, giá thành thấp và tốc độ sinh sản nhanh, mang lại nhiều hiệu quả trong
việc sản xuất màng CVK ứng dụng vào thực tiễn.

9


CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Khả năng giải phóng Diclofenac của màng CVK được lên men từ môi
trường nước dừa già.
2.2. Phạm vị nghiên cứu, địa điểm và thời gian
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường
ĐHSP Hà Nội 2.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1.1. Chủng vi sinh
Vi khuẩn cellulose từ Gluconacetobacter Xylinus được nuôi cấy tại
phòng sạch Vi sinh- Động vật, Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng,
Trường ĐHSP Hà Nội 2.
2.3.1.2. Nguyên liệu và hóa chất
Nguyên liệu: nước dừa già, nước cất.

trường nước dừa già
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.3.1.Chế tạo màng CVK từ môi trường nước dừa già
Bước 1: Sấy các bình đựng và dụng cụ ở 200°C, sau khi sấy xong lấy
ra và để nguội
Bước 2: Chuẩn bị môi trường theo Bảng 2.1

11


Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men tạo màng Cellulose vi khuẩn
Môi trường nước dừa già

Thành phần
Glucose

30g

Peptone

10g

Diamoni photphat

0,3g

Amoni sulfat

0,5g


12


+ Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy hấp màng trong
NaOH nóng 3%, nhiệt độ 113°C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử
trùng HV-110/HIRAIAMA để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội
độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1 giờ
+ Sau khi ngâm NaOH, vớt màng đặt dưới vòi nước chảy đến khi màng
trắng trong. Thử quỳ tím kiểm tra môi trường bề mặt màng CVK cần đạt là
trung tính, ta thu được CVK tinh khiết [13,6].
Màng Cellulose vi khuẩn thô được xử lý theo sơ đồ Hình 2.1

Tách màng CVK thô
Ép loại nước
Ngâm trong NaOH 3%
48 giờ, rửa và ép

Ngâm trong HCl 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong nước
48 giờ, kiểm tra tạp chất
Thu CVK tinh chế
Hình 2.1. Sơ đồ xử lý CVK sau khi lên men
Màng sau khi thu được cần đạt những yêu cầu sau:
- Mềm mại, dẻo dai, mỏng, có khả năng áp sát vào da, có tính che phủ tốt
- Có độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nước và dịch mô
- Độ dày thích hợp của màng CVK thô: chọn màng CVK có độ dày
0,5cm và 1cm để tiến hành làm thực nghiệm

13


Bảng 2.2. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ
khác nhau (n=3) ở bước sóng 276nm
STT

Nồng độ

Giá trị OD 276nm(n=3)

( mg/ml)

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Giá trị trung
bình

1

10

0,105

0,108

0,108


0,643

0,638

0,645

0,642 ± 0,003

5

80

0,85

0,86

0,87

0,86 ± 0,006

6

100

1,06

1,075

1,075


5

6

7

Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 276nm

15


Bảng 2.3. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ
khác nhau (n=3) ở bước sóng 278nm
Nồng độ
(mg/ml)

Lần 1

Lần 2

Lần 3

1

10

0,116

0,116


60

0,66

0,76

0,68

0,7 ± 0,04

5

80

0,95

0,94

0,96

0,94 ± 0,006

6

100

1,169

1,173


2

4

6

8

Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278nm

16