Tài liu lun vn s phm 1 of 63.

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

CAO THỊ MAI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP
NEOMYCIN SUFATE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XILINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƢỜNG NƢỚC VO GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

HÀ NỘI - 2019
Footer Page 1 of 63.


Tài liu lun vn s phm 2 of 63.

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

CAO THỊ MAI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP
NEOMYCIN SUFATE TẠO RA TỪ

trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Cao Thị Mai

Footer Page 3 of 63.


Tài liu lun vn s phm 4 of 63.

LỜI CAM ĐOAN
Tôi: Cao Thị Mai xin cam đoan về tính trung thực của đề tài:
Thứ nhất: Đề tài “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu
cellulose nạp Neomycin sufate tạo ra từ Gluconacetobacter xilinus nuôi cấy
trong môi trường nước vo gạo” là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới
sự chỉ đạo hướng dẫn trực tiếp của ThS. Hà Thị Minh Tâm.
Thứ hai: Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa
từng công bố ở đâu.
Thứ ba: Chắc chắn đề tài của tôi không trùng với một đề tài nào khác.
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Cao Thị Mai

Footer Page 4 of 63.


Tài liu lun vn s phm 5 of 63.

. L do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu .................................................................................... 3
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 3
5.

nghĩa khoa học và nghĩa thực ti n.......................................................... 3

6. Phương pháp nghiên cứu............................................................................... 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 5
1.1. Tổng quan về vật liệu cellulose (VLC) ...................................................... 5
. . . Đặc điểm cấu trúc của VLC .................................................................... 5
1.1.2. Tính chất độc đáo của VLC .................................................................... 6
1.1.3. Ứng dụng của VLC ................................................................................. 6
1.2. Tổng quan về thuốc Neomycin sulfate ...................................................... 7
1.2.1. Neomycin sulfate .................................................................................... 7
1.2.2. Tính chất lí hóa........................................................................................ 8
.2.3. Dược l và cơ chế tác dụng ..................................................................... 8
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc Neomycin sulfate ....................... 9
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam .................................. 10
1.3.1. Trên thế giới .......................................................................................... 10
1.3.2. Tại Việt Nam ......................................................................................... 11
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 12
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 12
2.2. Máy móc, thiết bị nghiên cứu .................................................................. 12
2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 13

Footer Page 6 of 63.



Bảng 3.2. Lượng thuốc hấp thụ vào các VLC với độ dày khác nhau ............. 21
Bảng 3.3. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác
nhau trong các môi trường pH khác nhau....................................... 23
Bảng 3.4. Tỉ lệ giải phóng thuốc của các VLC có độ dày 0,3 cm và 0,5 cm
trong các môi trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác
nhau (%) (n =3) ............................................................................... 25

Footer Page 8 of 63.


Tài liu lun vn s phm 9 of 63.

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của neomycin [1]................................................. 7
Hình 2. . Sơ đồ biểu di n quy trình nuôi cấy thu nhận VLC ......................... 14
Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn của Neomycin trong môi trường dung
dịch đệm PBS (pH = 7,4) ................................................................ 16
Hình 3.1. Nuôi cấy VLC từ môi trường nước vo gạo ..................................... 20
Hình 3.2. VLC sau khi tinh chế ....................................................................... 21
Hình 3.3. Lượng thuốc Neomycin sulfate giải phóng ra khỏi VLC ............... 22
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh mật độ quang (OD) của lượng thuốc được giải
phóng ở VLC 0,3 cm và 0,5 cm trong các môi trường pH khác nhau
(n = 3) .............................................................................................. 23

Footer Page 9 of 63.


Tài liu lun vn s phm 10 of 63.


VLC là một quá trình d dàng, năng lượng thấp trong khi thanh lọc PC

Footer Page 10 of 63.

1


Tài liu lun vn s phm 11 of 63.

thường đòi hỏi các hóa chất khắc nghiệt. Các đặc tính độc đáo khác của VLC
là mức độ trùng hợp cao hơn và tính chất bền kéo đáng chú do cấu trúc
mạng. Khi so sánh với PC, sợi VLC cũng có diện tích riêng cao hơn khả năng
giữ nước cao hơn (giữ tới hàng trăm lần trọng lượng của nó trong nước) và
thời gian khô lâu hơn. Hơn nữa, việc sản xuất vật liệu này không đòi hỏi các
phương pháp xử lý hóa học khắc nghiệt để phân lập và tinh chế cellulose.
Trên thế giới nó được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác
nhau: như dùng màng phân tách cho quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt
cho các pin và năng lượng cho tế bào, sử dụng làm chất biến đổi độ nhớt
trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học,
thực phẩm hay thay thế thực phẩm. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, VLC đã
được ứng dụng làm thuốc chống viêm và giảm đau, như trị phong thấp, bị
thâm tím, căng bắp thịt, đau thắt lưng cấp và thoái hoá khớp. Nó còn được
dùng để điều trị đau bụng kinh. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng
VLC còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại
bước đầu nghiên cứu [2].
Nước vo gạo là hợp chất chất gần gũi với cuộc sống hằng ngày có thể
thấy ở mọi nơi đặc biệt trong các gia đình, quán ăn,… hơn nữa giá thành rẻ.
Chính vì vậy nên sử dụng nước vo gạo làm môi trường để lên men những vi
khuẩn cần thiết cho nghiên cứu.
Nhằm tăng sự giải phóng của thuốc đồng thời giảm tác dụng không

4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Khả năng giải phóng thuốc của vật liệu
cellulose nạp thuốc neomycin sulfate tạo ra từ Gluconacetobacte xilinus lên
men từ môi trường nước vo gạo.
- Phạm vi nghiên cứu: trên quy mô phòng thí nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: Viện nghiên cứu khoa học và Ứng dụng Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
5.

ngh a khoa học và ý ngh a th c ti n

5.1. Ý nghĩa khoa học:
- Nghiên cứu về VLC tìm ra được môi trường tạo ra VLC có khả năng
giải phóng kéo dài.
- Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của VLC.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn:
- Thiết kế được quy trình tạo VLC từ chủng Gluconacetobacte xilinus
lên men từ môi trường nước vo gạo.
- Sử dụng VLC dùng làm hệ thống giải phóng thuốc để đưa vào điều
trị bệnh, kéo dài quá trình giải phóng, duy trì nồng độ thuốc trong máu trong

Footer Page 12 of 63.

3


Tài liu lun vn s phm 13 of 63.

một thời gian dài, giảm số lần dùng thuốc cho người bệnh, giảm các tác dụng
phụ không mong muốn và nâng cao được khả năng sử dụng thuốc.
- Từ các kết quả nghiên cứu ta có thể áp dụng vào trong thực ti n.

năng giữ nước, độ kết tinh, khả năng phân hủy sinh học và khả năng tương
thích sinh học.
VLC có cấu tạo từ những chuỗi polyme β-1,4-glucopyranose không
phân nhánh, chủng Gluconacetobacter xylinus là sản phẩm của một số loài vi
khuẩn. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của VLC
giống cellulose của thực vật (plant cellulose - PC), tuy nhiên chúng khác nhau
về cấu trúc đại thể [13, 19].
Theo nghiên cứu AJ. Brown (1886) cho biết VLC có đường kính 1,5nm
gồm nhiều sợi siêu nhỏ kết hợp với nhau thành bó có bản chất là
hemicellulose. Nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng
khoảng 3 – 8nm.
Có hai cách tiếp cận chính để tổng hợp VLC bằng cách sử dụng vi sinh
vật: (i) nuôi cấy tĩnh, dẫn đến sự phát triển của một hạt VLC trắng dày đặc ở
giao diện chất lỏng không khí; và (ii) nuôi cấy động, trong đó cellulose được
sản xuất theo quy trình phân tán trong môi trường nuôi cấy, tạo ra các viên bất
thường hoặc các vi sợi lơ lửng. Việc lựa chọn phương pháp (nghĩa là nuôi cấy

Footer Page 14 of 63.

5


Tài liu lun vn s phm 15 of 63.

tĩnh hoặc động) phụ thuộc vào ứng dụng cuối cùng của VLC vì các đặc tính
vật l , hình thái và cơ học của VLC tổng hợp khác nhau dựa trên quá trình
canh tác. Ví dụ, cellulose thu được thông qua phương pháp nuôi cấy động có
độ bền cơ học thấp hơn so với cellulose được tạo ra bởi nuôi cấy tĩnh. Hơn
nữa, phương pháp nuôi cấy động cho năng suất thấp hơn so với nuôi cấy tĩnh
và đột biến cao hơn ở vi sinh vật là có thể xảy ra, điều này có thể ảnh hưởng

Tài liu lun vn s phm 16 of 63.

Những kết quả ứng dụng trên đã chứng minh rằng VLC có khả năng
giúp vết thương mau lành và ngăn không nhi m trùng [3]. Nó được ứng dụng
để sản xuất màng băng vết thương, sử dụng trong phẫu thuật, ghép mô, cơ
quan [2].
1.2. Tổng quan v thuốc Neomycin sulfate
1.2.1. Neomycin sulfate
- Tên thông thường: Neomycin
- Tên IUPAC: (2R,3S,4R,5R,6R) – 5 – amino – 2 – (aminomethyl) – 6
– [(1R,2R,3S,4R,6S) – 4,6 – diamino – 2 – [(2S,3R,4S,5R) – 4 –
[(2R,3R,4R,5S,6S)– 3 – amino – 6 – (aminomethyl) – 4,5 – dihydroxyoxan –2
– yl] oxy – 3 – hydroxy – 5 – (hydroxymethyl) oxolan – 2 – yl]oxy – 3 –
hydroxycyclohexyl] oxyoxane – 3,4 – diol [10].
- Công thức phân tử: C23H46N6O13

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của neomycin [1]
- Khối lượng phân tử: 614.65g/mol
- Đầu tiên được phân lập từ Streptomyces fradiae và Streptomyces
albogriseus năm 949 (NBRC 2773). Neomycin là một hỗn hợp của
neomycin B (framycetin); và thuốc epomer neomycin C, thành phần sau

Footer Page 16 of 63.

7


Tài liu lun vn s phm 17 of 63.

chiếm khoảng 5–15% hỗn hợp. Nó là một hợp chất cơ bản hoạt động tích cực


Footer Page 17 of 63.

8


Tài liu lun vn s phm 18 of 63.

- Neomycin thường được dùng tại chỗ trong điều trị các nhi m khuẩn ở
tai, mắt, da hoặc dùng uống để sát khuẩn đường tiêu hóa trước khi phẫu thuật
đặc biệt tắc nghẽn thần kinh cơ và liệt hô hấp đã được báo cáo sau khi sử dụng
neomycin đường uống. Cần xem xét khả năng xảy ra tắc nghẽn thần kinh cơ và
liệt hô hấp nếu dùng neomycin, đặc biệt là đối với bệnh nhân dùng thuốc gây
mê, thuốc ức chế thần kinh cơ như ubocurarine, succinylcholine,
decamethonium hoặc ở bệnh nhân truyền máu. Nếu tắc nghẽn xảy ra, muối canxi
có thể đảo ngược các hiện tượng này nhưng có thể cần hỗ trợ hô hấp cơ học [2].
* Dược động học
- Neomycin hấp thu kém qua đường tiêu hóa, khoảng 97% liều uống
được bài tiết dưới dạng không đổi qua phân. Sau khi uống 3g, nồng độ đỉnh
huyết thanh đạt được khoảng 4 microgam/ml và khi thụt thuốc sự hấp thu
cũng tương tự. Trường hợp niêm mạc bị viêm hoặc tổn thương khả năng hấp
thu thuốc có thể tăng lên, thuốc sẽ thải trừ nhanh qua thận dưới dạng hoạt
tính. Nửa đời của thuốc khoảng 2 - 3 giờ.
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc Neomycin sulfate
* Chỉ định:
- Sử dụng tại chỗ bao gồm điều trị nhi m trùng mắt hời hợt do vi khuẩn
nhạy cảm (sử dụng kết hợp với các thuốc chống nhi m trùng khác), điều trị
viêm tai ngoài do vi khuẩn nhạy cảm, điều trị hoặc phòng ngừa nhi m trùng
do vi khuẩn ở da súc rửa để ngăn ngừa nhi m trùng tiểu và nhi m khuẩn que
gram âm ở bệnh nhân nhi m khuẩn bằng ống thông tiểu trong [1].

học trên tìm ra quá trình sinh tổng hợp và khả năng kháng khuẩn của
neomycin.
- Pedersoli W. M. và cs (1994) [14] nghiên cứu về khả năng hấp thụ
của neomycin trên bê con Hà Lan qua đường tiêm. Kết quả tỉ lệ hấp thụ đạt
không cao, đã bị đào thải qua thận rất lớn, việc này gây đầu độc cho thận.
- Nhóm nghiên cứu của Blanchard C. (2015) [16] chỉ ra rằng do
neomycin sulfate ở dạng muối so với neomycin đơn thuần thì ít gây dị ứng
với cơ thể hơn nên cải thiện hoạt động kháng khuẩn.
- Alguacil J. và cs (2015) [10] cũng đưa ra nghiên cứu về khả năng
kháng khuẩn của các dạng thế hệ của neomycin.
- Amita H. và cs (2015) [10] đã tìm ra công thức chế tạo gel chứa
neomycin hướng điều trị viêm giác mạc mắt mục đích tăng thời gian cư trú và
cũng duy trì cơ chế giải phóng của thuốc tại mắt. Điều đó giúp tăng hiệu quả
giải phóng kéo dài tại chỗ của neomycin trong mắt.

Footer Page 19 of 63.

10


Tài liu lun vn s phm 20 of 63.

1.3.2. Tại Việt Nam
Neomycin có trong danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam ban hành lần
thứ 4 năm 999 [1].
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng VLC bắt đầu từ những
năm 2000. Những nghiên cứu trong nước bước đầu đã thành công trong tuyển
chọn chủng có đặc tính quý, sản xuất thử nghiệm VLC và thử nghiệm ứng
dụng trong sản xuất bao bì, gạc và mặt nạ.
Neomycin mới chỉ được bào chế dạng kem, dung dịch pha chế với một

- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu;
- Ống nghiệm, đũa thủy tinh, bình thủy tinh (500 ml) có nút xoáy, bình
tam giác, gạc vô trùng, hộp nhựa, lọ penicilin, giấy bạc, bình định mức loại
100 ml, 500 ml, 1000 ml, pipet chính xác 1 ml, 5 ml, 10 ml,... và nhiều dụng
cụ hóa sinh khác.

Footer Page 21 of 63.

12


Tài liu lun vn s phm 22 of 63.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm 1: Cho VLC nạp Neomycin sulfate vào giải phóng thuốc
ở các điều kiện pH khác nhau rồi tính tốc độ giải phóng thuốc ở mỗi pH đó.
- Thí nghiệm 2: Trong cùng một pH cho VLC có độ dày khác nhau đã
nạp Neomycin sulfate giải phóng thuốc rồi tính tốc độ giải phóng thuốc.
2.3.2. Chuẩn bị VLC
- Chuẩn bị VLC bởi chủng Gluconacetobacte xilinus ở môi trường
nuôi cấy được biểu thị ở bảng 2.1 [23]:

Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng lên men tạo VLC

Thành phần

Khối lƣợng

Nước vo gạo

Footer Page 22 of 63.

13


Tài liu lun vn s phm 23 of 63.

- Trộn môi trường với 10% dịch giống sau đó lắc đều tay đảm bảo
giống phân bố đều.
- Sử dụng đèn cồn khử trùng miệng lọ, dùng gạc vô trùng bịt miệng lọ,
ủ tĩnh trong khoảng 6 – 14 ngày ở 260C.
- Sau khi được ủ tĩnh ở 26°C trong 6 - 14 ngày, đem ngâm nước cất 2
ngày, sau đó lấy VLC đem tinh chế theo quy trình ở sơ đồ 2.2:
Tách VLC thô
Ép loại nước

Bình chứa NaOH 3%
48h, rửa và ép

Bình chứa HCl 3%
48h, rửa và ép
Ngâm trong nước
48h, kiểm tra tạp chất

Thu VLC tinh chế
Hình 2.1. Sơ đồ biểu di n quy trình nuôi cấy thu nhận VLC
2.3.3.Đánh giá độ tinh khiết của màng
2.3.3.1. Mục đích
Kiểm tra xem có sự có mặt của đường glucose trong VLC.
2.3.3.2. Nguyên tắc

nồng độ khác nhau ở bƣớc sóng 277nm

Nồng độ
0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

(mg/ml)
0.0049± 0.0130± 0.0210± 0.0290± 0.0370± 0.0440±
OD(Abs277nm)
0,0001

0,0010

0,0015

0,0010

0,0020

0,0012



0,3

0,4

Hình 2.2. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của Neomycin trong môi trƣờng
dung dịch đệm PBS (pH = 7,4)
Từ Hình 2.1 ta có phương trình đường chuẩn ở bước sóng 277 nm là:
Y = 0.1574x – 0.0027 (R2 = 0.9995) (1)
Trong đó:

x là nồng độ Neomycin sulfate (mg/ml)
y là giá trị OD tương ứng với nồng độ x
R2 là hệ số tương quan

2.3.5. Phương pháp chế tạo VLC nạp Neomycin sulfate
Ta có 2 mẫu sau:
Mẫu 1: VLC có độ dày 0,3 cm.
Mẫu 2: VLC có độ dày 0,5 cm.
Sử dụng 2 mẫu trên để thử nghiệm lượng thuốc Neomycin sulfate hấp
thụ vào VLC.
VLC sau khi tinh chế cho vào sấy khô 60%, sau đó để vào bình có chứa
100 ml dung dịch đệm PBS (pH=7,4)[7] chứa thuốc Neomycin sulfate 2
mg/ml và để rung động ở 180 vòng và 400C trong 2 giờ, để vật liệu được hấp
thụ tối đa nhất [15].

Footer Page 25 of 63.

16