a

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ LAN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP
BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI - 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ LAN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP
BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA TỪ


Nguyễn Thị Lan


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin khẳng định những gì viết trong khóa luận “ Nghiên cứu khả
năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Berberine hydrocloride tạo
ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước dừa già” là
kết qủa nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS. Cao Bá
Cường, giảng viên Khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Tất
cả những số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, đảm
bảo tính chính xác và trung thực.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Thị Lan


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

G.A. xylinus: Gluconacetobacter xylinus
BH: Berberine hydrochloride
cs : Cộng sự


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................. 2

2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất ........................................................................ 14
2.2. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 14
2.2.1. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu......................................... 14
2.2.2. Dụng cụ ........................................................................................... 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 15
2.3.1. Phương pháp tạo màng BC ............................................................. 15
2.3.2. Phương pháp xử lý màng BC trước khi hấp thụ thuốc ................... 17
2.3.3. Phương pháp xây dựng đường chuẩn của BH ................................ 18
2.3.4. Phương pháp pha môi trường đệm PBS ( Phosphate buffered
saline)-....................................................................................................... 20
PBS 1X ............................................................................................................ 20
Môi trường đệm được sử dụng trong đề tài bao gồm 3 môi trường với pH=2,
pH=6,8, pH=12 .............................................................................................. 20
2.3.5. Phương pháp xác định lượng thuốc BH được hấp thụ vào màng ... 20
2.3.6. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng từ màng Cellulose vi
khuẩn ......................................................................................................... 21
2.3.7. Phương pháp xử lý thống kê ........................................................... 22
CHƯƠNG 3..................................................................................................... 23


KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 23
3.1. Màng BC được nuôi cấy từ môi trường nước dừa già............................. 23
3.3. Tinh chế màng CV .................................................................................... 24
3.4. Lượng thuốc hấp thụ vào màng CV ......................................................... 26
3.5. Xác định lượng thuốc BH giải phóng khỏi màng CV .............................. 26
1. Kết luận ....................................................................................................... 33
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 34



1. Lý do chọn đề tài
Berberine được chiết xuất từ cây vàng đằng (hay được gọi là cây hoàng
đắng, hoàng liên, có tên khoa học là Coptis teeta),… (đây là cây dây leo, thân
gỗ, phân nhánh, mọc hoang dại ở nhiều nơi). Một thành phần quan trọng trong
cây vàng đắng là alcaloid. Alcaloid là dẫn xuất của izoquinolein, chủ yếu là
berberine hydrocloride chiếm khoảng 2% [7]
Berberine hydrochloride (BH) có bản chất là một alkaloid thực vật nổi
tiếng, nó có lịch sử nổi tiếng được dùng trong ngành y học cổ truyền ở cả Trung
Quốc và Việt Nam . Berberine có tác dụng chống lại các loại vi khuẩn, kí sinh
trùng gây hại cho đường ruột, ảnh hưởng đến cơ thể gây nên các bệnh về đường
ruột. Nó được bào chế để điều trị các bệnh về tiêu hóa như tiêu chảy, chống
tăng và tính chất chống tiết. Gần đây, một số nhà khoa học cũng đã nghiên cứu
và chứng minh BH còn có tác dụng chống ung thư, chống HIV, chống bệnh
tiểu đường, đau mắt hột, giải lo âu và thuốc giảm đau, nấm da, trị bỏng, …và
một số tác dụng dược lí khác [6]
Berberine có một đặc điểm là không ảnh hưởng đến sự phát triển của vi
khuẩn có ích cho đường ruột, đây chính là một trong những ưu thế trong việc
điều trị các bệnh nhiễm trùng đường ruột. Các nhà khoa học cũng đã chứng
minh, khi dùng kết hợp các thuốc kháng sinh với berberine có thể hạn chế được
các tác dụng không mong muốn khi dùng thuốc kháng sinh với hệ vi sinh đường
ruột [8]
Berberine được cho là một trong những loại thuốc rất ít khi gây dị ứng
cho người sử dụng, rất lành tính và an toàn. Berberine được chống chỉ định
dùng đối với phụ nữ mang thai vì có thể sẽ gây co bóp tử cung, điều này sẽ ảnh
hưởng nghiêm trọng đến thai nhi và với những người quá mẫn cảm với các
thành phần của thuốc [7]
Cellulose vi khuẩn do một loài vi khuẩn sản xuất ra, đặc biệt là chủng
Gluconacetobacter xylinus. Cellulose vi khuẩn tương tự như cellulose thực vật,
chúng giống nhau về mặt hóa học, cellulose vi khuẩn bao gồm các liên kết β1,4-glucan, nhưng cellulose thực vật khác cellulose vi khuẩn về mức độ
polymer hóa. Độ tinh sạch của cellulose vi khuẩn cao hơn độ tinh sạch của các

nạp berberine hydrochloride tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong
môi trường nước dừa.
Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện tại quy mô phòng thí
nghiệm.
2


Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm “Sinh lý học người và động vật”
khoa Sinh- KTNN, Viện Nghiên cứu khoa học và Ứng dụng Trường Đại học
Sư phạm Hà Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu nhằm tăng thêm hiểu biết và ứng dụng của
màng Cellulose vi khuẩn. Mở ra một hướng đi mới trong việc nghiên cứu các
hạn chế cũng như khắc phục của thuốc Berberine và còn có thể nghiên cứu trên
các loại thuốc khác giúp cho ngành y học ngày càng phát triển.
Đồng thời tìm và phát hiện ra các ưu nhược điểm của màng Cellulose vi
khuẩn để có hướng nghiên cứu giúp tăng đặc tính của màng, hạn chế các đặc
tính không tốt của màng ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau.
- Ý nghĩa thực tiễn
+ Định hướng khắc phục những nhược điểm của thuốc Berberine thông thường:
tăng tác dụng của thuốc, rút ngắn thời gian điều trị cho bệnh nhân...
+ Từ việc tạo ra màng Cellulose vi khuẩn dùng làm hệ thống khắc phục các tác
dụng không mong muốn của thuốc.
+ Đưa các nghiên cứu vào thực tiễn cuộc sống.

5. Nội dung nghiên cứu
-

Nghiên cứu quy trình nuôi cấy Gluconacetobacter xylinus từ môi trường


- Họ: Pseudomonadaceae
Gluconacetobacter xylinus có nhiều hình dạng khác nhau như: hình que, hình
hơi cong, thẳng, theo chiều ngang nó có kích thước khoảng 2-3 μm, đây là vi
khuẩn gram âm, không có khả năng di chuyển, không sinh bào tử, xếp đơn lẻ
nhưng đôi khi nếu có sự thay đổi của môi trường nó có thể thành chuỗi, phân
nhánh hoặc không phân nhánh [1].
1.1.2. Cấu trúc của Cellulose vi khuẩn
Cellulose vi khuẩn được nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan, nó là một
chuỗi polymer. Các vi khuẩn tổng hợp chuỗi Glucan lại thành các sợi thứ cấp,
rộng khoảng 1,5nm. Các sợi thứ cấp này là các sợi tự nhiên, mảnh hơn các sợi
sơ cấp trong thượng tầng của một số loại thực vật. Các sợi thứ cấp kết lại tạo
thành vi sợi, vi sợi lại kết lại tạo thành các bó sợi, các bó sợi lại tạo thành các
dải. Dải có chiều dày 3-4 nm, và có chiều dài 130-177 nm (Yamanaka et al,

4


2000). Các dải siêu mịn, có dạng các mắt lưới, được giữ ổn định nhờ các liên
kết có chiều dài từ 1µm-9µm, được gọi là lớp màng film (Bielecki at al, 2001).
Màng Cellulose vi khuẩn được tạo ra do gluconacetobacter xylinus khác
nhau về cấu trúc đồng thể nhưng lại có cấu trúc hóa học đồng nhất [2].
1.1.3. Đặc tính của màng Cellulose vi khuẩn tạo bởi Gluconacetobacter
xylinus
Cellulose vi khuẩn có cấu trúc mạng tinh thể ở dạng nhỏ nhất, nó là

-

Cellulose trong suốt có thành phần tỉ lệ Iα cao.
Màng cellulose vi khuẩn có kích thước cố định, có sức căng và độ bền


vì vậy trong sản xuất các sản phẩm từ cellulose vi khuẩn ta sản xuất một cách
trực tiếp. Cellulose có thể được tổng hợp dưới dạng màng mỏng hoặc dưới dạng
các sợi chỉ cực nhỏ
1.1.4. Môi trường nuôi cấy Gluconacetobacter xylinus
Có thể nuôi cấy gluconacetobacrer Xylinus từ các môi trường dinh dưỡng
khác nhau như nguồn cacbon, nguồn sulfur và phospho, cùng các yếu tố tăng
trưởng và các yếu tố vi lượng khác [3].

5


Môi trường nước dừa già rất thích hợp trong việc nuôi cấy vi khuẩn vì trong
nước dừa già có nhiều thành phần chất dinh dưỡng và chất kích thích tăng
trưởng như 1,3 – diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol, … Vì
vậy gluconacetobacter xylinus rất thích hợp phát triển trong môi trường nước
dừa già [1].
Nước dừa lấy ra sau thu hoạch không để quá 3 ngày, vì nếu để lâu sẽ làm cho
lượng đường và các chất dinh dưỡng trong đó giảm đi đáng kể [1].
Thành phần của nước dừa già [1] được trình bày trong bảng 1.1
Nước (%)
Protein (%)
Chất béo toàn phần (%)

94,99 Đồng (mg/100g)
0,72 Mangan (mg/100g)

0,04
0,142

0,2 Selenium (µg/100g)

(mg/100g)

0,043
Phosphorus (mg/100g)

20 Vitamin

B6

(mg/100g)

0,032
Kali (mg/100g)

250 Folate (µg/100g)

Natri (mg/100g)

105

Kẽm (mg/100g)

0,1

Bảng 1.1 Các thành phần trong nước dừa già

6

3




thể giải phóng thuốc là 0,116 kg/cm2 và có thể kéo dài tác dụng đến 24 giờ
chống lại hoạt động của S.Aureus và B. Subtilis [11]
Năm 1989, Brown đã phân tách màng Cellulose vi khuẩn để làm môi trường
trong quá trình lọc nước, dùng làm chất mang cho pin, và cung cấp năng lượng
cho tế bào [7]
Màng Cellulose vi khuẩn có nhiều tính chất đặc biệt như: tính thấm nước
cao, có thể kết dính và tính trơ hóa học nên màng Cellulose vi khuẩn được coi
như một màng sinh học. Trong y học người ta đã nghiên cứu và ứng dụng màng
sinh học để làm da nhân tạo thay thế cho da người như ở Brazil. Trên thế giới
các ngành dược phẩm và làm đẹp ứng dụng nhiều tác dụng của màng Cellulose
vi khuẩn. Các tác giả: Hamlyn và cs (1997), Cienchansk (2004), Legeza và cs
(2004), Wan và Milon (2005), Czaja và cs (2006) đã tiến hành áp dụng vào
thực tiễn khi dùng màng Cellulose vi khuẩn đặt lên các vết thương hở, các vết
loét, bỏng liên quan về da và đã đạt được kết quả tốt. Một số tác giả đã đăng kí
quyền sử dụng về việc sử dụng màng này trong điều trị cho bệnh nhân( điều trị
bỏng) như nhà khoa học người Canada. Các tác giả Jonas và Farad (1998),
Czaja và cs (2006) đã ứng dụng màng Cellulose vi khuẩn để làm da thay thế da
thật cho bệnh nhân hay ứng dụng làm các sản phẩm làm đẹp cho con người [9].
Năm 2012 Luan J.và Cs [12] đã dùng màng cellulose vi khuẩn để quán các vết
thương nạp sulfadiazine bạ, đây là loại thuốc được dùng trong điều trị vết
thương nhiễm trùng. Kết quả cho thấy sau khi sử dụng màng CV ngâm tẩm bạc
sulfadiazine đắp lên nơi có vết thương, hoạt động kháng khuẩn đối với P.
aeruginosa và Ecoli và S. aureus đạt kết quả tốt hơn dạng kem bôi hay các
dung dịch thông thường.
1.2.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam đã bắt đầu nghiên cứu từ năm 2000 trong lĩnh vực Vi sinhKhoa Dược dùng màng Cellulose vi khuẩn từ Glucoacetobacter xylinus kết hợp
các chất có trong dầu mù u có thể tái sinh để diều trị thực nghiệm vết bỏng và


BH có ở các bộ phận của cây như: rễ, thân rễ, thân, vỏ cây những cây thuộc chi
Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis, BH có nhiều trong thân và rễ
cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5 - 3%, trong đó berberine chiếm 82% so với alcaloid
toàn phần.
BH không tinh khiết mà có lẫn alcaloid như: palmatin, jatrorrhizin. Các tạp chất
palmatin không quá 2%, jatrorrhzin không quá 5%.
1.3.1.3. Tính chất vật lý
Berberine thường tồn tại ở hai dạng: tinh thể hay bột kết tinh, 2 dạng này đều
có màu vàng, không vùi và có vị đắng. Ở dạng bazơ nó tan chảy ở 1450C, ở
dạng này nó tan không nhanh trong nước, có thể tan trong ethanol và tan ít trong
nước. Ở dạng muối clorid tan ở tỷ lệ 1/400 trong nước, tan tốt trong nước sôi
và ethanol, nhưng lại không tan trong cloroform và ether. Dạng muối Sulfat dễ
tan trong nước và ethanol [13].

10


1.3.1.4. Tính chất hóa học
Berberine có đầy đủ tính chất của một bazơ yếu, chúng tạo muối bằng cách
thay thế nhóm OH, muối do Berberine tạo ra có loại nước nên không giống các
alcaloid khác mà muối được tạo thành giống muối của hydroxyd kim loại [4].
Hóa tính của oxy: Trong môi trường kiềm Berberine không có tính ổn định, N
không bền vững trong môi trường kiềm mạnh, dễ hỗ biến mở vòng cho nhóm
chức andehyd gọi là berberial [4].
Hóa tính mạnh kép: Berberine có thể được tạo thành các hydro alkaloid không
màu nếu loại bỏ nhân giữa đi [4].
1.3.1.5. Tác dụng
BH có thể chống lại các loại vi khuẩn, kí sinh trùng gây hại làm rối loại hệ tiêu
hóa gây hại cho sức khỏe con người [13].
Berberine có tác dụng kháng khuẩn với shigella, tụ cầu và liên cầu khuẩn, thể

cứu, nó không chỉ thẩm thấu qua da mà sự giải phóng Berberine còn được thí
nghiệm trên dạ dày và ruột. Kết quả thu được Berberine giải phóng với tốc độ
chậm.
1.4.2. Ở Việt Nam
Việt Nam cũng có một số tác giả nghiên cứu về thuốc Berberine hydrochloride:
- Năm 2010 các tác giả Vũ Bình Dương, Nguyễn Trọng Diệp, Nguyễn Thị
Thùy, Hoàng Văn Lương đã nghiên cứu và bào chế Berberine ở dạng viên nén
100mg giải phóng ở đích đại tràng theo cơ chế phân giải hệ vi sinh vật [5].
- Trong cây thuốc Việt Nam một thành phần quan trọng là alkaloid đã được
Phan Quốc Kinh nghiên cứu [6].
- Nguyễn Liêm - chiết xuất Berberine bằng áp lực nóng.
- Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm - góp phần nghiên cứu cải tiến quy trình sản
xuất Berberine từ cây vàng đắng [2].

12


- Hồ Đắc Trinh - bằng dung dịch acid sulfuric loãng đã chiết xuất Berberine
clorid trong cây vàng đắng [7].

13


CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu sự giải phóng thuốc của vật liệu cellulose vi khuẩn nạp berberine
hydrochloride tạo ra từ Gluconacetobacter nuôi cấy trong môi trường nước dừa
già.


NaOH, HCl



Nước cất



KH2PO4



Na2HPO4.12H2O

2.2. Thiết bị và dụng cụ
2.2.1. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu


Bể ổn nhiệt 1013



Bể rung siêu âm S60/H



Buồng cấy vô trùng (Haraeus)



Bình tam giác định mức các loại 250 ml, 500 ml, 1000 ml, pipet, ... giấy bạc
(hoặc màng bọc thực phẩm), vải lọc, giấy thấm và các dụng cụ trong phòng thí
nghiệm.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tạo màng BC
Môi trường sử dụng là môi trường nước dừa già. Các thành phần có trong môi
trường nước dừa già và khối lượng từng thành phần được thể hiện ở bảng 2.1

STT

Hóa chất

Hàm lượng

1

Nước dừa già

1000ml

2

Glucose

30g

3

KH2PO4


15