TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
NẠP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA
TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG CHUẨN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

HÀ NỘI - 2019


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
NẠP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA
TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG CHUẨN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN XUÂN THÀNH

Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng- Trƣờng đại học Sƣ phạm Hà Nội 2,
dƣới sự trực tiếp hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Xuân Thành. Kết quả nghiên
cứu là của cá nhân tôi, không có sự trùng lặp, không sao chép từ bất kì tài liệu
nào. Kết luận đƣợc đánh giá dựa trên kết quả thực nghiệm đã thực hiện không
bịa đặt. Trong khóa luận có đƣợc sử dụng một số tài liệu tham khảo từ các tác
giả, tôi xin phép các tác giả nhằm bổ sung cho sự chính xác và độ tin cậy của
khóa luận của mình.
Nếu sai tôi xin chịu mọi trách nhiệm trƣớc hội đồng bảo vệ.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Thị Bích Ngọc


CÁC TỪ VIẾT TẮT ĐƢỢC SỬ DỤNG TRONG KHÓA LUẬN

Từ đầy đủ

Từ viết tắt
G. xylinus

Gluconacetobacter xylinus

BH

Berberine hydrochloride

UV - vis


NỘI DUNG ....................................................................................................... 5
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5
1.1. Giới thiệu về vật liệu cellulose (VLC) ....................................................... 5
1.1.1. Cấu trúc màng VLC ................................................................................ 5
1.1.2. Tính chất độc đáo của VLC .................................................................... 6
1.1.3. Màng VLC lên men từ môi trƣờng chuẩn............................................... 7
1.1.4. Ứng dụng của màng VLC ....................................................................... 7
1.2.Giới thiệu về thuốc Berberine hydrochloride ............................................. 8
1.2.1. Công thức hóa học và tính chất ............................................................... 8
1.2.2. Tác dụng dƣợc lí và ứng dụng ................................................................ 9
1.2.3. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc Berberine hydrochloride ............ 9
1.3.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ............................................... 10
1.3.1. Về màng vật liệu cellulose .................................................................... 10
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 11
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................... 11
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 11
2.3. Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ........................................ 11
2.3.1. Thiết bị .................................................................................................. 11


2.3.2. Nguyên liệu – hóa chất.......................................................................... 12
2.4. Môi trƣờng tạo màng VLC....................................................................... 12
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 12
2.5.1. Phƣơng pháp tạo màng VLC từ môi trƣờng chuẩn............................... 12
2.5.2. Phƣơng pháp xử lí màng VLC trƣớc khi hấp thụ thuốc........................ 14
2.5.3. Phƣơng pháp đánh giá độ tinh khiết của màng ..................................... 15
2.5.4. Phƣơng pháp xác định khối lƣợng VLC tạo thành ............................... 15
2.5.5. Xây dựng đƣờng chuẩn của berberine hydrochloride trong cồn 960. ... 15
2.5.6. Phƣơng pháp xác định lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ vào màng VLC....... 17
2.5.7. Phƣơng pháp pha môi trƣờng đệm PBS (Phosphate buffered saline) .. 18

Bảng 3.2. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác
nhau trong các môi trƣờng pH khác nhau ....................................................... 24
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của VLC 6
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của berberine hydrochloride ............................... 8
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tạo màng VLC thô ................................................. 13
Hình 2.2. Sơ đồ tình chế VLC......................................................................... 14
Hình 2.3. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của berberine hydrochloride (n=3) ..... 17
Hình 3.1. Màng VLC sau khi đƣợc thu từ môi trƣờng chuẩn ......................... 21
Hình 3.2. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác
nhau trong các môi trƣờng pH khác nhau ....................................................... 25
Hình 3.2. Tỷ lệ giải phóng thuốc berberine hydrochloride ............................. 26
Hình 3.3. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH=2 ...................................................... 27
Hình 3.4. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH =12. .................................................. 27
Hình 3.5. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH =6,8 .................................................. 28


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay các sản phẩm phục vụ cho nhu cầu chăm sóc sức khỏe,
làm đẹp bằng việc sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ các nguyên
vật liệu sinh học rất phổ biến và đƣợc ƣa chuộng do có tác dụng hiệu quả
cũng nhƣ độ an toàn cao. Chính vì độ an toàn, khả năng tái tạo, sự phân
hủy sinh học và thân thiện với môi trƣờng của các loại vật liệu sinh học
mà chũng đã đƣợc rất nhiều các nhà khoa học nghiên cứu và sử dụng
rộng rãi. Một trong số những vật liệu sinh học đƣợc sử dụng rộng rãi và
phổ biến là vật liệu Cellulose.
Vật liệu Cellulose (VLC) đƣợc tạo ra từ 1 loại vi khuẩn là chủng vi
khuẩn Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus) [3,8]. Cấu tạo của chủng
vi khuẩn này bao gồm các phân tử glucose đƣợc nối với nhau nhờ liên
kết ß- 1 4 glucozit, đây là một loại màng sinh học (VLC) đƣợc tạo nên

hydrochloride là một hợp chất đƣợc tìm thấy từ thực vật, dễ tìm, an toàn
và giá thành thấp, có hoạt tính chống viêm [2]. Chúng đƣợc dùng nhiều
trong việc điều trị các bệnh liên quan đến đƣờng tiêu hóa.
Tuy nhiên, berberine hydrochloride đƣợc sử dụng chủ yếu qua
đƣờng uống với sinh khả dụng thấp, gây tác dụng phụ cho việc vận
chuyển thuốc bên ngoài đƣờng tiêu hóa [24]. Khi sử dụng thuốc có thể
bị các tác nhân khác làm ảnh hƣởng đến hiệu quả sử dụng thuốc. Ngoài
ra, thuốc còn có tác dụng phụ liên quan đến các nhóm cơ và tinh mạch.
Vậy nên cần phải nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc berberine
hydrochloride.
Với mục đích tạo ra màng VLC bằng chủng vi khuẩn G. xylinus, từ
đó tạo ra màng sinh học sử dụng để khảo sát sự giải phóng thuốc qua
màng giúp kéo dài thời gian giải phóng, phát huy những ƣu điểm và
khắc phục những tác dụng không mong muốn, của VLC trong việc điều
trị các bệnh.
Vì vậy tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc
của vật liệu cellulose nạp berberine hydrochloride tạo ra từ
Gluconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn”
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc Berberine
hydochloride từ màng VLC đã nạp thuốc ở môi trƣờng chuẩn có độ pH
khác nhau.

2


3. Phạm vi nghiên cứu
- Đối tƣợng nghiên cứu: Khả năng giải phóng Berberine hydrochloride
của vật liệu Cellulose lên men từ môi trƣờng chuẩn.
- Vật liệu nghiên cứu bao gồm: màng VLC tạo ra từ môi trƣờng

trong môi trƣờng chuẩn ở các độ pH khác nhau.

4


NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về vật liệu cellulose (VLC)
Cellulose là một trong những đại phân tử hữu cơ tồn tại phổ biến
trên trái đất, là thành phần chính tạo nên sinh khối của thực vật, đại diện
cho các polymer ngoại bào của các loại vi sinh vật. Cellulose có thể trao đổi
sơ cấp và tạo màng bảo vệ [[8].
Ngày nay, Gluconacetobacter xylinus đƣợc chứng minh là một
trong số những loại vi khuẩn tạo ra màng VLC hiệu quả nhất trong tự
nhiên. Đây là loại vi khuẩn gram âm, sống hiếu khí không bắt buộc, không
có khả năng sinh bào tử và là loài tiến hóa nhất của nhóm vi khuẩn tía. Mỗi
một tế bào của G. xylinus chuyển hóa đƣợc tới 108 phân tử glucose và phân
tử cellulose chỉ trong vòng 1 giờ nên khả năng tổng hợp cellulose là rất lớn.
G. xylinus dạng hình que thẳng hoặc hơi cong, có thể di chuyển
hoặc không di chuyển và không sinh bào tử. Khi tế bào của vi khuẩn này
già đi hay do tác động của môi trƣờng thì gram của chúng có thể bị biến
đổi. G. xylinus thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc vì thế chúng tăng
trƣởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trƣờng lỏng và môi trƣờng khí và có khả
năng tạo màng cellulose trên môi trƣờng nuôi cấy [12].
Trong môi trƣờng rắn nuôi cấy khoảng 3 đến 7 ngày, khuẩn lạc
G. xylinus phát triển nhỏ, nhày, có màu kem, hơi trong nhƣng để 1 tuần thì
khuẩn lạc phát triển to, đục, khô dần.
Ở môi trƣờng lỏng sau khoảng 24 giờ nuôi cấy thì có 1 lớp màng
dày đục xuất hiện, sau từ 36- 48 giờ hình thành một lớp màng trong và càng
dày.

khuẩn sẽ tập hợp xung quanh đất xốp và hình thành cellulose nhƣ hình dạng
mong muốn.
6


Trong quá trình tổng hợp màng VLC đƣợc biến đổi trực tiếp: màng
này có thể thay đổi thuộc tính khi thêm chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào
trong quá trình tổng hợp.
1.1.3. Màng VLC lên men từ môi trường chuẩn
Trên thế giới, màng từ vật liệu cellulose lên men từ môi trƣờng chuẩn
đƣợc sử dụng rộng rãi và rất phổ biến vì nó bền hơn các loại màng cellulose
lên men từ các môi trƣờng khác.
1.1.4. Ứng dụng của màng VLC
Màng VLC có rất nhiều ƣu điểm: độ kết tinh, độ tinh sạch, độ bền sức
căng, độ bền đàn hồi, độ co dãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả hút
nƣớc và giữ nƣớc cao, bị phân hủy sinh học, có tính tƣơng thích sinh học, tính
trơ chuyển hóa, không độc và không gây dị ứng [18].
Với những ƣu điểm đó thì màng VLC đƣợc con ngƣời ứng dụng trong
rất nhiều lĩnh vực [4, 10, 11, 12, 18, 22, 23, 25, 30] trong bảng 1.1 sau:
Bảng 1.1. Ứng dụng của màng VLC
Lĩnh vực đƣợc

Sản phẩm

ứng dung

ứng dụng
Lớp màng chữa bỏng

Y dƣợc

Tên quốc tế: Berberine hydrochloride
Loại thuốc: kháng khuẩn, chống lại các bệnh về đƣờng ruột do vi khuẩn,
các loại kí sinh trùng đƣờng ruột

1.2.1. Công thức hóa học và tính chất
Berberine hydrochloride là một alkaloid thực vật thuộc nhóm isoquinol có
khung protoberberine [1]. Isoquinolin còn có tên gọi khác là benzo pyridine hay
2- benzamin là một hợp chất hữu cơ thơm heterocyclic.
Công thức cấu tạo:

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của berberine hydrochloride
Công thức phân tử: C20H18NO4Cl.2H2O
Khối lƣợng phân tử: 371,82

Tên
khoa
học:
5,6-đihydro-8,9-đimethoxy-1,3-đioxa-6aazoniaindeno (5,6-a) anthracen clorid dihydrat [1].
Tính chất vật lý:
Tinh thể hay bột có kết tinh màu vàng, không mùi, vị rất đắng. Độ
chảy khi ở dạng base là 145oC (bị phân hủy) [17]. Tan chậm trong nƣớc ở
độ tan dạng base 1/500 [27], trong ethanol ít tan, khó tan trong ether [17].
8


Dễ tan trong nƣớc ở dạng muối sulfat với tỉ lệ 1/30. Không có đồng phân
quang học do không có C bắt đôi [11,17].
Tính chất hóa học:
Tính chất hóa học của N: Tƣơng tự 1 base yếu, thay thế nhóm OH để
tạo muối, muối berberine tạo thành có loại phân tử nƣớc giống muối của

nữ có thai và cho con bú
1.3.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
1.3.1. Về màng vật liệu cellulose
Trên thế giới
Những công trình nghiên cứu về thuốc berberine hydrochloride nhƣ:
Huilixing và Jianping Ye đã xác định hiệu quả an toàn của berberine
hydrochloride trong điều trị bệnh nhân tiểu đƣởng loại 2 [19].
Pyan Bradley, ND, MPH và Bill Walter, ND đã nghiên cứu về
berberine hydrochloride trong bệnh tiểu đƣờng [28].
Jianping Ye, Weiping Jia đã tìm hiểu và tác dụng và cơ chế của
berberine hydrochloride trong điều trị bệnh tiểu đƣờng [20].
Tại Việt Nam
Việc nghiên cứu thuốc berberine hydrochloride ở Việt Nam có một
số công trình nghiên cứu sau:
Phan Quốc Kinh đã nghiên cứu những Alkaloid chiết xuất từ các cây
thuốc Việt Nam [6].
Nguyễn Liêm – chiết xuất berberine hydrochloride bằng áp lục nóng
[9].
Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm – góp phần nghiên cứu và cải tiến
quy trình sản xuất berberine hydrochloride từ cây vàng đắng [9].
Hồ Đắc Trinh – sử dụng dung dịch acid sulfuric loãng để chiết
berberine clorid trong vàng đắng [15].
Trần Công Khánh – gớp phần nghiên cứu phƣơng pháp sản xuất
berberine hydrochloride từ cây vàng đắng Coscinium usitatum Pierre [5].

10


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Các hóa chất thông thƣờng có nguồn gốc của Trung Quốc và Việt Nam:
berberine hydrochloride (độ tinh khiết 98%), cao nấm men, cồn 96º, đƣờng
glucose, pepton, acid axetic, KH2PO4, NaCl, KCl, Na2HPO4, NaOH, acid
HCl đậm đặc, nƣớc cất và một số hóa chất khác.
2.4. Môi trƣờng tạo màng VLC
Môi trƣờng tạo VLC đƣợc trình bày trong bảng 2.1
Bảng 2.1. Môi trường tạo màng VLC
STT

Hóa chất

Khối lƣợng

1

Nƣớc cất 2 lần

1000ml

2

Glucose

20g

3

Cao nấm men

5g


- Cụ thể quy trình VLC lên men từ môi trƣờng chuẩn đƣợc thực
hiện theo quy trình ở sơ đồ 2.1 [14].
Nƣớc cất 2 lần

Bổ sung dinh dƣỡng cần thiết
(bảng 2.1)

Hấp thanh trùng
(113ºC, 20 phút)
Để nguội
Đổ giống và acid acetic vào bình nuôi
cấy thực hiện trong buồng cấy vô trùng
( 10% giống + 2% acid)
Đậy bình bằng vài xô
sạch, đê nơi thoáng mát
Lên men 7-8 ngày

Thu màng VLC

Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tạo màng VLC thô

13


2.5.2. Phương pháp xử lí màng VLC trước khi hấp thụ thuốc
Màng VLC sau khi thu đƣợc chứa một lƣợng lớn môi trƣờng lên men
và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất acid acetic. Vì vậy, trƣớc khi hấp
thụ thuốc ta cần phải tiến hành tinh sạch xử lí màng để quá trình hấp thụ và
giải phóng đƣợc chính xác.

có mặt của đƣờng D – glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
Tiến hành:
- Dịch thử của màng VLC các loại sau khi đã xử lý hóa học.
- Mẫu đối chứng: là nƣớc cất và dung dịch D - glucose.
- Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc
thử Fehling. Ngâm trong nƣớc đun sôi 10 - 15 phút.
- Quan sát tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
2.5.4. Phương pháp xác định khối lượng VLC tạo thành
VLC sau khi đƣợc tách ra khỏi môi trƣờng, sau đó xử lí theo công
đoạn hóa học [15] thu đƣợc VLC tinh chế. VLC tinh chế đƣợc ép áp lực, thu
đƣợc khối lƣợng VLC tạo thành.
2.5.5. Xây dựng đường chuẩn của berberine hydrochloride trong cồn 960.
- Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng: cồn 96º.
- Chuẩn bị dung dịch chứa thuốc berberin ở các nồng độ (mg/ml) khác
nhau: 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% trong cồn 96º.
- Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV - Vis để đo mật độ quang phổ
(OD) của các dung dịch đã pha nhƣ trên ở bƣớc sóng 345nm [24].
- Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc
15


berberin để xây dựng đƣờng chuẩn của thuốc berberine hydrochloride.
Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch thuốc berberine hydrochloride ở các
nồng độ khác nhau đƣợc thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang OD của dung dịch berberine
hydrochloride ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau (n = 3)
Giá trị OD 345nm (n = 3)
STT

Nồng

0,714

0,710

0,712 ± 0,002

3

20

1,523

1,522

1,532

1,526 ± 0,006

4

30

2,031

2,299

2,286

2,205 ± 0,151