Tài liu lun vn s phm 1 of 63.

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
NẠP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA
TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG CHUẨN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

HÀ NỘI - 2019
Footer Page 1 of 63.


Tài liu lun vn s phm 2 of 63.

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
NẠP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA


Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Thị Bích Ngọc

Footer Page 3 of 63.


Tài liu lun vn s phm 4 of 63.

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài khóa luận này đƣợc chính tôi thực hiện tại
Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng- Trƣờng đại học Sƣ phạm Hà Nội 2,
dƣới sự trực tiếp hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Xuân Thành. Kết quả nghiên
cứu là của cá nhân tôi, không có sự trùng lặp, không sao chép từ bất kì tài liệu
nào. Kết luận đƣợc đánh giá dựa trên kết quả thực nghiệm đã thực hiện không
bịa đặt. Trong khóa luận có đƣợc sử dụng một số tài liệu tham khảo từ các tác
giả, tôi xin phép các tác giả nhằm bổ sung cho sự chính xác và độ tin cậy của
khóa luận của mình.
Nếu sai tôi xin chịu mọi trách nhiệm trƣớc hội đồng bảo vệ.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Thị Bích Ngọc

Footer Page 4 of 63.



NCKH và ƢD

Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng

Nxb

Nhà xuất bản

OD

Mật độ quang phổ


Tài liu lun vn s phm 6 of 63.

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Phạm vi nghiên cứu ....................................................................................... 3
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 3
5. Dự kiến kết quả nghiên cứu .......................................................................... 4
NỘI DUNG ....................................................................................................... 5
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5
1.1. Giới thiệu về vật liệu cellulose (VLC) ....................................................... 5
1.1.1. Cấu trúc màng VLC ................................................................................ 5
1.1.2. Tính chất độc đáo của VLC .................................................................... 6
1.1.3. Màng VLC lên men từ môi trƣờng chuẩn............................................... 7
1.1.4. Ứng dụng của màng VLC ....................................................................... 7
1.2.Giới thiệu về thuốc Berberine hydrochloride ............................................. 8

3.1. Kết quả tạo màng và xử lý màng VLC lên men từ môi trƣờng chuẩn..... 21
3.1.1. Màng VLC đƣợc lên men từ môi trƣờng chuẩn.................................... 21
3.1.2. Tinh chế màng VLC .............................................................................. 22
3.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết của màng VLC .................................................. 22
3.2. Khảo sát màng VLC trong quá trình hấp thụ thuốc berberine
hydrochloride .................................................................................................. 23
3.3. Lƣợng thuốc giải phóng từ màng VLC vào các môi trƣờng pH khác nhau
......................................................................................................................... 23
3.3.1. Mật độ quang của berberin khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời
điểm khác nhau trong các môi trƣờng pH khác nhau ..................................... 23
3.3.2. Tỉ lệ giải phóng dƣợc chất của các màng ở các môi trƣờng pH khác
nhau trong các khoảng thời gian khác nhau .................................................... 25

Footer Page 7 of 63.


Tài liu lun vn s phm 8 of 63.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 30

Footer Page 8 of 63.


Tài liu lun vn s phm 9 of 63.

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH

Bảng 1.1. Ứng dụng của màng VLC ................................................................. 7
Bảng 2.1. Môi trƣờng tạo màng VLC ............................................................. 12

hủy sinh học và thân thiện với môi trƣờng của các loại vật liệu sinh học
mà chũng đã đƣợc rất nhiều các nhà khoa học nghiên cứu và sử dụng
rộng rãi. Một trong số những vật liệu sinh học đƣợc sử dụng rộng rãi và
phổ biến là vật liệu Cellulose.
Vật liệu Cellulose (VLC) đƣợc tạo ra từ 1 loại vi khuẩn là chủng vi
khuẩn Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus) [3,8]. Cấu tạo của chủng
vi khuẩn này bao gồm các phân tử glucose đƣợc nối với nhau nhờ liên
kết ß- 1 4 glucozit, đây là một loại màng sinh học (VLC) đƣợc tạo nên
nhờ liên kết hóa học này, loại màng này có cấu trúc và đặc tính tƣơng tự
cellulose ở thực vật. Tuy nhiên, chúng lại có nhiều những đặc điểm ƣu
việt và ứng dụng hơn nhƣ: dù ở trạng thái ẩm vẫn có khả năng hút nƣớc
cao, độ bền và tính dẻo dai của màng cao, độ tinh khiết cao. Cellulose vi
khuẩn còn có những đặc tính vƣợt trội hơn hẳn khi so sánh với cellulose
thực vật: không có các hợp chất cao phân tử nhƣ ligin, hemicellulose,
peptin và sáp nến. Đặc biệt, màng VLC có thể đƣợc sản xuất trên quy
mô lớn vì nguồn nguyên liệu dễ kiếm, giá thành rẻ. Vì vậy, có thể thấy
vật liệu cellulose là một loại nguyên liệu mới sẽ đƣợc ứng dụng rất nhiều
trong các lĩnh vực nhƣ y học, thực phẩm, mỹ phẩm,… [11,18].
Một trong các lĩnh vực mà màng VLC đƣợc ứng dụng nhiều nhất
và rất thành công đó là y học. Màng VLC đƣợc nghiên cứu vào việc ứng
dụng làm hệ thống phân phối và vận chuyển thuốc qua da, từ đó phát
huy đƣợc ƣu điểm và khắc phục các nhƣợc điểm của thuốc khi sử dụng
một cách thông thƣờng. Ƣu điểm vƣợt trội nhất của việc sử dụng màng
VLC là khả năng làm lành lại vết thƣơng, đặc tính bảo vệ và hấp thụ
dịch tiết. Một số hệ thống nạp thuốc có khả năng giải phóng thuốc thời

Footer Page 10 of 63.

1


2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc Berberine
hydochloride từ màng VLC đã nạp thuốc ở môi trƣờng chuẩn có độ pH
khác nhau.

Footer Page 11 of 63.

2


Tài liu lun vn s phm 12 of 63.

3. Phạm vi nghiên cứu
- Đối tƣợng nghiên cứu: Khả năng giải phóng Berberine hydrochloride
của vật liệu Cellulose lên men từ môi trƣờng chuẩn.
- Vật liệu nghiên cứu bao gồm: màng VLC tạo ra từ môi trƣờng
chuẩn.
- Phạm vi nghiên cứu: Các nghiên cứu đƣợc thực hiện trên quy mô
phòng thí nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu:
+ Phòng thí nghiệm sinh lý học ngƣời và động vật Trƣờng đại học
Sƣ phạm Hà Nội 2.
+ Viện nghiên cứ khoa học và ứng dụng Trƣờng đại học Sƣ phạm
Hà Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học:
+ Hiểu đƣợc ứng dụng của màng VLC trong cuộc sống.
+ Việc hạn chế những nhƣợc điểm của thuốc Berberine
hydrochloride khi sử dụng màng VLC sẽ đƣa ra một hƣớng nghiên cứu mới
trong nghiện cứu khoa học, không chỉ ứng dụng để khắc phục hạn chế của

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về vật liệu cellulose (VLC)
Cellulose là một trong những đại phân tử hữu cơ tồn tại phổ biến
trên trái đất, là thành phần chính tạo nên sinh khối của thực vật, đại diện
cho các polymer ngoại bào của các loại vi sinh vật. Cellulose có thể trao đổi
sơ cấp và tạo màng bảo vệ [[8].
Ngày nay, Gluconacetobacter xylinus đƣợc chứng minh là một
trong số những loại vi khuẩn tạo ra màng VLC hiệu quả nhất trong tự
nhiên. Đây là loại vi khuẩn gram âm, sống hiếu khí không bắt buộc, không
có khả năng sinh bào tử và là loài tiến hóa nhất của nhóm vi khuẩn tía. Mỗi
một tế bào của G. xylinus chuyển hóa đƣợc tới 108 phân tử glucose và phân
tử cellulose chỉ trong vòng 1 giờ nên khả năng tổng hợp cellulose là rất lớn.
G. xylinus dạng hình que thẳng hoặc hơi cong, có thể di chuyển
hoặc không di chuyển và không sinh bào tử. Khi tế bào của vi khuẩn này
già đi hay do tác động của môi trƣờng thì gram của chúng có thể bị biến
đổi. G. xylinus thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc vì thế chúng tăng
trƣởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trƣờng lỏng và môi trƣờng khí và có khả
năng tạo màng cellulose trên môi trƣờng nuôi cấy [12].
Trong môi trƣờng rắn nuôi cấy khoảng 3 đến 7 ngày, khuẩn lạc
G. xylinus phát triển nhỏ, nhày, có màu kem, hơi trong nhƣng để 1 tuần thì
khuẩn lạc phát triển to, đục, khô dần.
Ở môi trƣờng lỏng sau khoảng 24 giờ nuôi cấy thì có 1 lớp màng
dày đục xuất hiện, sau từ 36- 48 giờ hình thành một lớp màng trong và càng
dày.
1.1.1. Cấu trúc màng VLC
Màng VLC có cấu trúc hóa học cơ bản giống với cellulose có nguồn
gốc thực vật (plant cellulose– PC), tuy nhiên chúng lại khác nhau ở cấu trúc
đại thể. Các sợi mới của mang VLC kết lại với nhau để hình thành nên các sợi
sơ cấp (subfibril), rộng khoảng 1.5nm. Các sợi sơ cấp này sẽ kết thành vi sợi
5

Footer Page 15 of 63.


Tài liu lun vn s phm 16 of 63.

Trong quá trình tổng hợp màng VLC đƣợc biến đổi trực tiếp: màng
này có thể thay đổi thuộc tính khi thêm chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào
trong quá trình tổng hợp.
1.1.3. Màng VLC lên men từ môi trường chuẩn
Trên thế giới, màng từ vật liệu cellulose lên men từ môi trƣờng chuẩn
đƣợc sử dụng rộng rãi và rất phổ biến vì nó bền hơn các loại màng cellulose
lên men từ các môi trƣờng khác.
1.1.4. Ứng dụng của màng VLC
Màng VLC có rất nhiều ƣu điểm: độ kết tinh, độ tinh sạch, độ bền sức
căng, độ bền đàn hồi, độ co dãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả hút
nƣớc và giữ nƣớc cao, bị phân hủy sinh học, có tính tƣơng thích sinh học, tính
trơ chuyển hóa, không độc và không gây dị ứng [18].
Với những ƣu điểm đó thì màng VLC đƣợc con ngƣời ứng dụng trong
rất nhiều lĩnh vực [4, 10, 11, 12, 18, 22, 23, 25, 30] trong bảng 1.1 sau:
Bảng 1.1. Ứng dụng của màng VLC
Lĩnh vực đƣợc

Sản phẩm

ứng dung

ứng dụng
Lớp màng chữa bỏng

Y dƣợc

phân nhánh, chúng mọc hoang ở rất nhiều nơi. Berberine hydrochloride timg thấy
nhiều nhất ở thân và rễ cây hoàng đằng với tỉ lệ 1,5 – 3%, chiếm ít nhất là 82% so
với alcaloid toàn phần.
Tên quốc tế: Berberine hydrochloride
Loại thuốc: kháng khuẩn, chống lại các bệnh về đƣờng ruột do vi khuẩn,
các loại kí sinh trùng đƣờng ruột

1.2.1. Công thức hóa học và tính chất
Berberine hydrochloride là một alkaloid thực vật thuộc nhóm isoquinol có
khung protoberberine [1]. Isoquinolin còn có tên gọi khác là benzo pyridine hay
2- benzamin là một hợp chất hữu cơ thơm heterocyclic.
Công thức cấu tạo:

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của berberine hydrochloride
Công thức phân tử: C20H18NO4Cl.2H2O
Khối lƣợng phân tử: 371,82

Tên
khoa
học:
5,6-đihydro-8,9-đimethoxy-1,3-đioxa-6aazoniaindeno (5,6-a) anthracen clorid dihydrat [1].
Tính chất vật lý:
Tinh thể hay bột có kết tinh màu vàng, không mùi, vị rất đắng. Độ
chảy khi ở dạng base là 145oC (bị phân hủy) [17]. Tan chậm trong nƣớc ở
độ tan dạng base 1/500 [27], trong ethanol ít tan, khó tan trong ether [17].
8
Footer Page 17 of 63.


Tài liu lun vn s phm 18 of 63.

Footer Page 18 of 63.


Tài liu lun vn s phm 19 of 63.

Chỉ định: tiêu chảy, nhiễm trùng đƣờng ruột, hội chứng lỵ, lỵ trực
tràng, viêm đƣờng ống mật, đau mắt đỏ, đau mắt hột, nhức mỏi mắt, viêm kết
hột, các trƣờng hợp ngứa mắt do bị dị ứng.
Chống chỉ định: mẫn cảm với bất kì thành phần nào của thuốc, phụ
nữ có thai và cho con bú
1.3.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
1.3.1. Về màng vật liệu cellulose
Trên thế giới
Những công trình nghiên cứu về thuốc berberine hydrochloride nhƣ:
Huilixing và Jianping Ye đã xác định hiệu quả an toàn của berberine
hydrochloride trong điều trị bệnh nhân tiểu đƣởng loại 2 [19].
Pyan Bradley, ND, MPH và Bill Walter, ND đã nghiên cứu về
berberine hydrochloride trong bệnh tiểu đƣờng [28].
Jianping Ye, Weiping Jia đã tìm hiểu và tác dụng và cơ chế của
berberine hydrochloride trong điều trị bệnh tiểu đƣờng [20].
Tại Việt Nam
Việc nghiên cứu thuốc berberine hydrochloride ở Việt Nam có một
số công trình nghiên cứu sau:
Phan Quốc Kinh đã nghiên cứu những Alkaloid chiết xuất từ các cây
thuốc Việt Nam [6].
Nguyễn Liêm – chiết xuất berberine hydrochloride bằng áp lục nóng
[9].
Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm – góp phần nghiên cứu và cải tiến
quy trình sản xuất berberine hydrochloride từ cây vàng đắng [9].
Hồ Đắc Trinh – sử dụng dung dịch acid sulfuric loãng để chiết

- Kính hiển vi quang học (Carl Zeiss - Đức);
- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh);
- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu;
- Và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.

11
Footer Page 20 of 63.


Tài liu lun vn s phm 21 of 63.

2.3.2. Nguyên liệu – hóa chất
Nguyên liệu: nƣớc cất 2 lần, gạc vô trùng
Hóa chất:
Hóa chất đặc biệt: Pepton của hãng DIFCO.
Các hóa chất thông thƣờng có nguồn gốc của Trung Quốc và Việt Nam:
berberine hydrochloride (độ tinh khiết 98%), cao nấm men, cồn 96º, đƣờng
glucose, pepton, acid axetic, KH2PO4, NaCl, KCl, Na2HPO4, NaOH, acid
HCl đậm đặc, nƣớc cất và một số hóa chất khác.
2.4. Môi trƣờng tạo màng VLC
Môi trƣờng tạo VLC đƣợc trình bày trong bảng 2.1
Bảng 2.1. Môi trường tạo màng VLC
STT

Hóa chất

Khối lƣợng

1


Axit citric

1,5g

2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp tạo màng VLC từ môi trường chuẩn
- Lên men tĩnh: Môi trƣờng dinh dƣỡng để lên men G. xylinus đƣợc
đựng vào các khay lên men có bề mặt rộng, thoáng. Trong thời gian lên
men, các khay này đƣợc phủ đậy bởi lớp giấy báo có độ xốp để tạo độ
thông khí. Điều chỉnh nhiệt độ thích hợp để lên men vào khoảng 28 –
30oC. Sau đó sợi cellulose nằm ở mặt phân cách giữa không khí và môi
trƣờng lỏng. Cellulose tiếp tục đƣợc tổng hợp và bám lên màng cellulose
phía bên trên. Khoảng 7 – 10 sau đó sẽ thu đƣợc màng VLC [14].
12
Footer Page 21 of 63.


Tài liu lun vn s phm 22 of 63.

- Cụ thể quy trình VLC lên men từ môi trƣờng chuẩn đƣợc thực
hiện theo quy trình ở sơ đồ 2.1 [14].
Nƣớc cất 2 lần

Bổ sung dinh dƣỡng cần thiết
(bảng 2.1)

Hấp thanh trùng
(113ºC, 20 phút)
Để nguội
Đổ giống và acid acetic vào bình nuôi

Ngâm trong nƣớc
48 giờ, kiểm tra tạp chất
Thu màng VLC tinh chế

Hình 2.2. Sơ đồ tình chế VLC
Tách VLC: Trong nuôi cấy tĩnh VLC tạo thành màng dày ở mặt môi
trƣờng nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trƣờng.

14
Footer Page 23 of 63.


Tài liu lun vn s phm 24 of 63.

Ngâm màng trong NaOH 3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải
phóng nội độc tố của vi khuẩn và trong màng chứa một lƣợng lớn vi khuẩn.
Ngâm HCl: sau khi ngâm màng bằng NaOH rửa nƣớc rồi ép màng. Sau
đó, ngâm với HCl 3% khoảng 48 giờ để trung hòa hết NaOH.
Ngâm nƣớc: Màng sau khi ngâm, rửa với nƣớc rồi ép màng. Ngâm
nƣớc đến trung hòa hết acid thời gian khoảng 48h thu đƣợc VLC tinh khiết.
2.5.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng
Mục đích: Đảm bảo màng VLC đã đƣợc tinh sạch, loại bỏ hết tạp
chất gây độc hại, kiểm tra sự có mặt của đƣờng glucose trong màng VLC.
Nguyên tắc: sử dụng thuốc thử Fehling mới pha chế để kiểm tra sự
có mặt của đƣờng D – glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
Tiến hành:
- Dịch thử của màng VLC các loại sau khi đã xử lý hóa học.
- Mẫu đối chứng: là nƣớc cất và dung dịch D - glucose.
- Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc
thử Fehling. Ngâm trong nƣớc đun sôi 10 - 15 phút.

(mg/ml)

Giá trị trung bình
Lần 1

Lần 2

Lần 3

1

5

0,353

0,355

0,354

0,354 ± 0,003

2

10

0,712

0,714

0,710


2,966

3,004

3,046

3,005 ± 0,040

6

50

3,703

3,641

3,504

3,616 ± 0,102

Dựng đồ thị biểu diễn và lập đƣờng chuẩn berberine hydrochloride
bằng phần mềm Excel 2010. kết quả đƣợc đồ thị nhƣ hình 2.3.

16
Footer Page 25 of 63.