Tài liu lun vn s phm 1 of 63.

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

TRẦN THỊ ÁNH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP
NEOMYCIN SULFATE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI
CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG CHUẨN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

Hà Nội, 2019
Footer Page 1 of 63.


Tài liu lun vn s phm 2 of 63.

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

TRẦN THỊ ÁNH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP

thể tránh khỏi những hạn chế và thiếu sót. Vì vậy, em rất mong sẽ nhận được
những góp ý chân thành của quý thầy, cô và bạn bè để khóa luận tốt nghiệp của
em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Trần Thị Ánh

Footer Page 3 of 63.


Tài liu lun vn s phm 4 of 63.

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan khóa luận “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc
của vật liệu cellulose nạp Neomycin Sulfate tạo ra từ Gluconacetobacter
xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn” do chính tôi viết. Các số liệu
trong kết quả nghiên cứu là hoàn toàn khách quan, do chính tôi thực nghiệm
mà có được và không trùng lặp với các kết quả đã công bố. Những trích dẫn
từ các công bố trước đã có ghi chú rõ ràng.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Hà Nội,ngày 20 tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Trần Thị Ánh

Footer Page 4 of 63.



4

OD

Mật độ quang phổ

5

VLC

Vật liệu cellulose


Tài liu lun vn s phm 6 of 63.

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 3
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................. 3
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn .......................................................... 3
NỘI DUNG....................................................................................................... 4
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4
1.1.Vật liệu cellulose (VLC) và vi sinh vật tổng hợp vật liệu cellulose ............ 4
1.1.1.Vật liệu cellulose (VLC) ........................................................................... 4
1.1.2. Vi sinh vật tổng hợp VLC ........................................................................ 6

3.3. Xác định tỉ lệ thuốc NS giải phóng từ các hệ thống đã thiết kế............... 23
3.3.1. Mật độ quang của NS khi tiến hành giải phóng thuốc từ các hệ thống đã
thiết kế ............................................................................................................. 23
3.3.2. Tỉ lệ giải phóng NS của VLC ở các hệ thống đã thiết kế ........................... 26
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 30

Footer Page 7 of 63.


Tài liu lun vn s phm 8 of 63.

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Ứng dụng của VLC........................................................................... 5
Bảng 1.2. Thành phần của các môi trường nuôi cấy thu VLC ......................... 8
Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng của cao nấm men ....................................... 8
Bảng 2.1. Thành phần môi trường chuẩn tạo VLC ......................................... 15
Bảng 2.2. Môi trường đệm pH = 7,4 ............................................................... 17
Bảng 2.3. Mật độ quang của dung dịch NS ở các nồng độ (n = 3) ................. 18
Bảng 3.1. Lượng thuốc NS hấp thụ vào VLC (n = 3) ..................................... 23
Bảng 3.2. Mật độ quang phổ khi tiến hành giải phóng thuốc từ các hệ thống
đã thiết kế (n = 3) ............................................................................................ 25
Bảng 3.3. Tỉ lệ giải phóng thuốc NS từ VLC ở các hệ thống đã thiết kế (n=3)
......................................................................................................................... 26

Footer Page 8 of 63.


Tài liu lun vn s phm 9 of 63.


của thực vật), tuy nhiên, VLC không chứa các hợp chất cao phân tử như
peptin, hemicellulose, ligin và sáp nến. Vì thế, ngoài độ dẻo dai, bền chắc, độ
đàn hồi cao, khả năng chịu nhiệt tốt, chúng còn có những đặc tính vượt trội
như: độ tinh khiết cao, có khả năng hút nước cao ở trạng thái ẩm và có thể
phục hồi, tái chế hay phân hủy hoàn toàn. Trong y học, chúng được quan tâm
vì có bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ bình thường, không độc, không gây dị ứng
và đặc biệt là khả năng cản khuẩn [4, 6]. Ngoài ra VLC còn có tác dụng giữ
thuốc và kéo dài thời gian giải phóng thuốc. Do vậy, VLC được coi là một
hướng đi mới trên con đường tìm ra những nguồn nguyên liệu mới hiện nay.
Trên thế giới, VLC đã ứng dụng rộng rãi trong cuộc sống, ví dụ như:
dùng VLC làm thực phẩm, màng lọc nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho
pin và năng lượng cho tế bào và còn có thể làm môi trường cơ chất trong sinh
học,... [13]. Đặc biệt trong y học, VLC được dùng làm chất bọc ngoài và vật
liệu vận tải thuốc được sử dụng ngoài da, làm da tạm thời trong quá trình điều
trị loét da, trị bỏng và còn làm mạch máu nhân tạo trong điều trị các bệnh tim
mạch. Và trong lĩnh vực làm đẹp, VLC còn được dùng làm mặt nạ dưỡng da
cho con người [8, 13].
Ở Việt Nam, việc dùng VLC trong nghiên cứu và ứng dụng còn chưa
phổ biến. Các nghiên cứu ứng dụng chỉ mới dừng lại ở những bước đầu, chưa
đi sâu vào các bước tiếp theo.
Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng có thể nuôi cấy thu VLC từ nhiều loại
môi trường. Tuy nhiên, trên thế giới, VLC lên men từ môi trường chuẩn được
1
Footer Page 10 of 63.


Tài liu lun vn s phm 11 of 63.

sử dụng phổ biến hơn cả do chúng có độ bền cao hơn VLC lên men từ các
môi trường khác.

- Đối tượng nghiên cứu: Hệ thống giải phóng thuốc của VLC nạp NS
tạo ra từ G. xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn.
-

Phạm vi nghiên cứu: Trong quy mô phòng thí nghiệm.

4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
* Ý nghĩa khoa học
- Tiếp tục nghiên cứu tiềm năng giải phóng thuốc tại chỗ của VLC.
Nghiên cứu sự giải phóng NS từ VLC nạp thuốc có thể khắc phục được hạn
chế của thuốc, tăng hiệu quả cho việc điều trị các bệnh lý.
- Đánh giá tiềm năng của VLC nạp NS để từ đó đề xuất hướng nghiên
cứu trên các loại thuốc khác.
* Ý nghĩa thực tiễn
- Sử dụng VLC làm vật liệu nạp và giải phóng thuốc định hướng khắc
phục những hạn chế của NS dạng thương mại trong điều trị bệnh.
-

Định hướng tăng sinh khả dụng thuốc NS.

3
Footer Page 12 of 63.


Tài liu lun vn s phm 13 of 63.

NỘI DUNG
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.


trọng lượng). Chúng còn có khả năng tương thích sinh học cao, có bề mặt tiếp
xúc lớn hơn gỗ thường, không độc, không gây dị ứng và đặc biệt là có khả
năng cản khuẩn.
1.1.1.3. Ứng dụng của VLC
VLC được ứng dụng rất nhiều trong đời sống [13], cụ thể như sau:
Bảng 1.1. Ứng dụng của VLC
Lĩnh vực
Thực phẩm

Ứng dụng
- Vỏ bao xúc xích, thịt nhân tạo
- Thạch dừa, kem, salad

Y dược

- Da nhân tạo, lớp màng trị bỏng
- Phẫu thuật ghép mô, cơ quan

Làm đẹp
Môi trường

Móng nhân tạo, mặt nạ đẹp da
- Miếng hấp thu chất độc
- Miếng thu hồi dầu

Trang phục
Thể thao

Quần áo, giày dép tự phân hủy
Lều lắp ráp



Bộ: Pseudomonadales



Bộ phụ: Pseudomonadieae



Họ: Pseudomonadaceae



Chi: Acetobacter

1.1.2.2. Đặc điểm của vi khuẩn G. xylinus
G. xylinus thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, không di động và không sinh
bào tử.
G. xylinus có dạng hình que, kích thước ngang khoảng 0,6 - 0,8 µm, dài
khoảng 2 - 3 µm, thẳng hay hơi cong, sắp xếp riêng rẽ và đôi khi xếp thành
chuỗi. Khi điều kiện môi trường nuôi cấy thay đổi hoặc tế bào già thì hình
dạng của chúng có thể bị biến đổi: tế bào phình to ra, dài hơn, phân nhánh
6
Footer Page 15 of 63.


Tài liu lun vn s phm 16 of 63.

hoặc không phân nhánh [8].


Bảng 1.2. Thành phần của các môi trƣờng nuôi cấy thu VLC
Các loại môi trƣờng

Thành phần

MT1

MT2

MT3

Glucose

20 g

20 g

20 g

Pepton

5g

10 g

10 g

Diamoni photphat


Nước vo gạo

1000 ml

Sau đó, thêm dịch giống vào các môi trường tối thiểu 10% thể tích môi
trường. Sau đó, đo pH của môi trường và hiệu chỉnh đến khoảng 4 - 6.
Trong các môi trường trên, môi trường chuẩn (HS) được sử dụng nhiều
hơn cả.
Trong các thành phần trên, chúng ta cần lưu ý đến cao nấm men. Cao
nấm men (CNM) bao gồm các thành phần hòa tan của tế bào nấm men. CNM
được dùng như là nguồn dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy vi khuẩn [8].
Thành phần dinh dưỡng của CNM [18], được thể hiện ở Bảng 1.3.
Bảng 1.3. Thành phần dinh dƣỡng của cao nấm men
Giá trị dinh dƣỡng

100g

Calo

185 kcal

Lipid

0,9 g

Cholesterol

0g

Natri


0 IU

Vitamin C

0 mg

Canxi

67 mg

Sắt

4 mg

Vitamin D

0 IU

Vitamin B6

0 mg

Vitamin B12

0,5µg

Magie

180 mg

Neomycin là một phức hợp kháng sinh gồm 3 thành phần: hai thành
phần đồng phân B và C là các thành phần hoạt tính và neomycin A là thành
phần phụ. Neomycin không thể đảo ngược liên kết với protein 16S rRNA và
S12 của tiểu đơn vị 30S ribosomal của vi khuẩn. Kết quả là tác nhân này cản
trở việc lắp ráp phức hợp khởi đầu giữa mRNA và ribosome của vi khuẩn, do
đó, ức chế sự khởi đầu tổng hợp protein. Ngoài ra, neomycin gây ra sự hiểu

10
Footer Page 19 of 63.


Tài liu lun vn s phm 20 of 63.

lầm của mẫu mRNA và gây ra sự chuyển đổi khung hình, do đó, dẫn đến kết
thúc sớm. Cuối cùng, điều này dẫn đến tế bào vi khuẩn bị chết đi [22].
* Dược động học
NS được hấp thu kém qua đường tiêu hóa bình thường (3%). Phần nhỏ
hấp thu được phân phối nhanh chóng trong các mô và được đào thải qua thận
phù hợp với mức độ của chức năng thận. Phần không được hấp thụ của thuốc
(khoảng 97%) được loại bỏ trong phân.
Các nghiên cứu liên kết với protein đã chỉ ra rằng mức độ gắn kết với
protein aminoglycoside thấp và tùy thuộc vào các phương pháp được sử dụng
để thử nghiệm, điều này có thể nằm trong khoảng từ 0% đến 30%.
Sự tăng trưởng của hầu hết các vi khuẩn đường ruột bị ức chế nhanh
chóng sau khi uống NS và sự ức chế này kéo dài trong 48 - 72 giờ.
Sự giải phóng NS gắn mô xảy ra chậm trong khoảng thời gian vài tuần
sau khi ngừng dùng thuốc [21].
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định
* Chỉ định
NS được dùng tại chỗ để điều trị các nhiễm khuẩn ngoài da, tai và mắt

cứu và ứng dụng chúng mới chỉ dừng lại ở mức độ khiêm tốn. Trong vài năm
trở lại đây, VLC thu được từ việc nuôi cấy vi khuẩn ngày càng được quan tâm
nghiên cứu.
Năm 2006, tại Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Văn
Thanh và cộng sự của mình đã tiến hành nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter
xylium (A. xylinum), sau đó thu và tinh chế VLC đạt hiệu quả cao [8]. Ngoài
ra, ông và cộng sự cũng nghiên cứu ứng dụng VLC trong điều trị bỏng bằng
cách thử nghiệm in vivo với 2 loại VLC gồm 1 loại cho thêm hoạt chất tái
sinh mô và loại kia cho thêm hoạt chất kháng khuẩn cho thấy VLC có thêm
hoạt chất tái sinh mô có tác dụng tốt hơn hẳn.
Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự năm 2012 cũng đã nghiên cứu VLC
ứng dụng trong điều trị bỏng được tạo ra từ vi khuẩn A. xylinum cho thấy A.
xylinum BNH2 có khả năng tổng hợp nên VLC bền, dai, thấu khí cao, hút
nước tốt và có sợi cellulose nhỏ thích hợp để dùng làm màng trị bỏng [6].

12
Footer Page 21 of 63.


Tài liu lun vn s phm 22 of 63.

1.3.2. Thuốc Neomycin Sulfate
* Trên thế giới:
Selman A., Waksman (1949) lần đầu tiên phát hiện thấy NS khi nuôi
cấy nấm Streptomyces fradiae cùng với cơ chế sinh tổng hợp và khả năng
kháng khuẩn của thuốc [10].
Năm 1994 Pedersoli W.M. và cộng sự khi tiến hành tiêm NS cho bê
con Hà Lan đã nhận thấy tỷ lệ hấp thụ NS không cao và tỷ lệ đào thải qua
thận lớn nên có thể là nguyên nhân đầu độc thận [20].
Sau đó, Jong S.C. và cộng sự (2015) trong việc chữa trị cho chuột nhắt

G. xylinus được mua từ Nhật Bản trong môi trường dinh dưỡng.
2.1.2. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus).
- Cân kỹ thuật (Sartorius - TE612).
- Cân phân tích (Sartorius - Thụy sỹ).
- Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức).
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản).
- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh).
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA.
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức) và các dụng cụ hóa sinh thông dụng
khác.
2.1.3. Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo VLC
-

Giống vi khuẩn G. xylinus được mua từ Nhật Bản.

- Đường glucose, peptone, chiết cao nấm men, Disodium phosphate
hydro (Na2HPO4), axit citric, NaOH, HCl,…
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuẩn bị VLC
2.2.1.1. Tạo VLC thô
Tạo VLC bằng cách nuôi cấy vi khuẩn G. xylinus trong môi trường
chuẩn HS. Quá trình lên men thu VLC thô được thực hiện theo các bước

14
Footer Page 23 of 63.


Tài liu lun vn s phm 24 of 63.



- Bước 2: Đem môi trường đi hấp khử trùng ở 113oC trong 15 phút
- Bước 3: Lấy môi trường ra sau đó đem đi khử trùng bằng tia cực tím
trong 15 phút rồi để nguội.
- Bước 4: Cho tối thiểu 10% dịch giống và 2% axid acetic vào môi
trường, lắc đều.
- Bước 5: Dùng gạc đã khử trùng bịt miệng bình rồi đem đi ủ tĩnh ở
26 C trong khoảng từ 6 - 8 ngày cho đến khi màng đạt đến độ dày cần thiết.
o

- Bước 6: Thu VLC thô bằng cách tách màng ra khỏi dung dịch nuôi
cấy rồi mang đi rửa sạch dưới vòi nước.
2.2.1.2. Tinh chế VLC
Nhằm loại bỏ được các tạp chất trong VLC và trung hòa độc tố hoặc
phá hủy tế bào vi khuẩn còn sót lại trên VLC.
Quá trình tinh chế VLC được tiến hành như sau (Hình 2.1) [6]:

15
Footer Page 24 of 63.


Tài liu lun vn s phm 25 of 63.

Hình 2.1. Quy trình tinh chế VLC
* Kiểm tra độ tinh sạch của VLC
Nhằm đảm bảo VLC sau khi tinh chế đã loại bỏ được hết vi khuẩn và
độc tố của chúng hay chưa.
Kiểm tra sự hiện diện của protein trong VLC: Dùng thuốc thử là acid
triclor acetic (CCl3COOH), nếu có protein sẽ làm đục dung dịch trong ống
nghiệm.