TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU SỰ GIẢI PHÓNG THUỐC
CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP DICLOFENAC NATRI
TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG CHUẨN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI - 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU SỰ GIẢI PHÓNG THUỐC
CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP DICLOFENAC NATRI
TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG CHUẨN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

sao chép và trùng lặp với bất kì tài liệu nào.

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Thị Hương


MỤC LỤC
PHẦN 1. MỞ ĐẦU............................................................................................. 1
1. Lý do chọn đề tài............................................................................................. 1
2. Mục đích của nghiên cứu ................................................................................ 2
3. Đối tượng nghiên cứu...................................................................................... 2
4. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn......................................................................... 3
PHẦN 2. NỘI DUNG ......................................................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4
1.1.Màng VLC tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus .......................................... 4
1.1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus ........................................................ 4
1.1.1.1.Cây phân loại vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus................................ 4
1.1.1.2. Đặc điểm sinh học của Gluconacetobacter xylinus. .............................. 4
1.1.2. Cellulose vi khuẩn ( CVK )....................................................................... 4
1.1.3. Môi trường nuôi cấy G. xylinus ................................................................ 5
1.2. Thuốc Dicofenac natri.................................................................................. 5
1.2.1.Công thức phân tử: C14H10Cl2NNaO2 ........................................................ 5
1.2.2. Tính chất.................................................................................................... 6
1.2.3. Tác dụng dược lí và cơ chế tác dụng ........................................................ 6
1.2.4. Dược động học của thuốc.......................................................................... 7
1.2.5. Phân bố - chuyển hoá ................................................................................ 7
1.2.6. Thải trừ ...................................................................................................... 7

Bảng 2.2. Bảng xây dựng đường chuẩn .........................................................13
Bảng 3.1. Khối lượng thuốc hấp thụ vào màng .............................................18
Bảng 3.2. Giá trị OD thu được tại các thời điểm khảo sát tiến hành trên màng
giữ nguyên với 4 loại môi trường khi giải phóng thuốc Diclofenac..............20
Bảng 3.3. Giá trị OD thu được tại các thời điểm khảo sát tiến hành trên màng
ép 50 % với 4 loại môi trường khi giải phóng thuốc Diclofenac...................21
Bảng 3.4. Tỉ lệ giải phóng thuốc (%) của các màng chưa ép ở các môi trường
pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n = 3) ........................24
Bảng 3.5. Tỉ lệ giải phóng thuốc (%) của các màng ép 50% ở các môi trường
pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n = 3) ........................25


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Quy trình tinh chế màng CVK .......................................................11
Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac OD278 nm.................14
Hình 3.1. Màng CVK thu được khi nuôi cấy trong MTC sau 7 ngày ...........17
Hình 3.2. Màng được cho vào dung dịch đệm và dùng máy khuấy từ gia
nhiệt ................................................................................................................19
Hình 3.3. Mẫu được rút ra để đo OD sau các khoảng thời gian ....................19
Hình 3.4. Biểu đồ thể hiện sự khác nhau về mật độ quang của lượng thuốc
được giải phóng ở 2 loại màng nguyên khác nhau trong 4 môi trường khảo
sát....................................................................................................................23
Hình 3.5. Biểu đồ thể hiện sự khác nhau về mật độ quang của lượng thuốc
được giải phóng ở 2 loại màng ép 50% khác nhau trong 4 môi trường khảo
sát....................................................................................................................23


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài


nếu sử dụng thuốc vào lúc đói. Trong huyết tương nồng độ sẽ đạt mức tối đa sau 2

2


tiếng hấp thu, nồng độ trong dịch bao hoạt dịch sau khi sử dụng thuốc từ 4 đến 6
tiếng sẽ đạt mức cao nhất[].
Màng cellulose vi khuẩn (CVK) được tạo ra từ vi khuẩn Gluconacerobacter
xylinus có cấu trúc hóa học gần giống với cellulose thực vật nhưng có 1 số tính
chất ưu việt hơn [1] đó là không có sự kết hợp của các hợp chất cao phân tử như
ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến,… mà được cấu thành từ các sợi
microfibrin, từ đây tạo nên các bó sợi song song cấu thành mạng lưới cellulose
với những vượt bậc hơn cellulose của thực vật. Ngoài ra CVK bền, sức căng lớn
và nó còn là 1 mạng lưới polymer sinh học dẻo dai, có khả năng giữ nước rất lớn
và đặc biệt còn là màng kháng khuẩn[2].
Nhờ những ưu điểm trên mà hiện nay màng CVK được các nhà khoa học
rất quan tâm và được coi là nguồn nguyên liệu mới trong rất nhiều các lĩnh vực
khác nhau như màng bọc thực phẩm, mặt nạ dưỡng da, màng phân tách trong quá
trình xử lí nước, trong lĩnh vực y học, màng CVK được nghiên cứu và ứng dụng
trong quá trình điều trị bỏng, loét da,…[3] đáng chú ý nhất là trong hệ thống kiểm
soát vận chuyển thuốc, kết quả cho thấy màng CVK giúp thuốc được giải phóng
một cách kéo dài làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc.
Với mục đích nghiên cứu để bổ sung dẫn chứng về khả năng giải phóng của
thuốc Diclofenac natri của vật liệu CVK, tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu sự giải
phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp diclofenac natri tạo ra từ
Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn”
2. Mục đích của nghiên cứu
Khảo sát Diclofenac natri được giải phóng tốt nhất trong điều kiện như
thế nào từ loại vật liệu CVK tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy
trong môi trường chuẩn.

1.1.Màng VLC tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus
1.1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus
1.1.1.1.Cây phân loại vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus
Tên: Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus)
Chi: Gluconacetobacter
Họ: Acetobacteraceae.
1.1.1.2. Đặc điểm sinh học của Gluconacetobacter xylinus.
G. xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, hoá dị dưỡng.
Chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả, trong đất. G.
xylinus có dạng trực khuẩn, kích thước khoảng 2 μm, đứng riêng lẻ hoặc xếp
thành từng chuỗi, không có khả năng di động. Bên ngoài các tế bào có một lớp
màng nhày bao bọc, mà cellulose là bản chất của lớp màng nhày này. Khi thử
bằng thuốc thử Iot và acid sunfuric dạng dung dịch thì bắt màu xanh. Ở điều kiện
thích hợp, vi khuẩn phát triển rất mạnh, trong điều kiện tích lũy quá nhiều acid
acetic thì hoạt động của vi khuẩn sẽ bị ức chế[4].
1.1.2. Cellulose vi khuẩn ( CVK )
Năm 1886, A.J. Brown lần đầu tiên trình bày về sự tổng hợp cellulose của vi
khuẩn Gluconacetobacter. Tuy nhiên mãi đến nửa sau thế kỷ XX, cellulose vi
khuẩn mới thực sự được quan tâm và nghiên cứu.
Cấu trúc cellulose vi khuẩn :
Cellulose vi khuẩn đựợc cấu tạo bởi chuỗi β-1,4 glucopyranose mạch thẳng
đươc tổng hợp từ một số loài vi khuẩn, đặc biệt trong tự nhiên phải kể đến là
Gluconacetobacter.[9] Khi nuôi cấy Gluconacetobacter trên môi trường lỏng,
trong điều kiện tĩnh sẽ hình thành nên một lớp màng nhìn giống như thạch dừa,
thực chất trong đó là các tế bào vi khuẩn liên kết với cellulose. Cellulose cấu
trúc trong màng CVK có thành phần hóa học tương tự cellulose thực vật nhưng
cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau, đồng thời khả năng kết tinh cao
5



Bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng, hút ẩm nhẹ. Dễ tan trong methanol, tan trong
ethanol 96%, hơi tan trong nước, khó tan trong aceton.
1.2.3. Tác dụng dược lí và cơ chế tác dụng
Diclofenac, dẫn chất của acid phenylacetic là thuốc chống viêm không steroid.
Thuốc có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh. Diclofenac là một
chất ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase, do đó làm giảm đáng kể sự tạo
thành prostaglandin, prostacyclin và thromboxan là những chất trung gian của quá
trình viêm. Diclofenac cũng điều hòa con đường lipoxygenase và sự kết tụ tiểu
cầu.
Giống như các thuốc chống viêm không steroid khác, diclofenac gây hại
đường tiêu hóa do giảm tổng hợp prostaglandin dẫn đến ức chế tạo mucin (chất có
tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa). Prostaglandin có vai trò duy trì tưới máu thận.
Các thuốc chống viêm không steroid ức chế tổng hợp prostaglandin nên có thể
gây viêm thận kẽ, viêm cầu thận, hoại tử nhú và hội chứng thận hư đặc biệt ở
những người bị bệnh thận hoặc suy tim mạn tính. Với những người bệnh này, các
thuốc chống viêm không steroid có thể làm tăng suy thận cấp và suy tim cấp [6].
Diclofenac được hấp thu dễ dàng qua đường tiêu hóa sau khi uống. Thuốc
được hấp thu nhanh hơn nếu uống lúc đói. Diclofenac gắn rất nhiều với protein
huyết tương, chủ yếu với albumin (99%). Khoảng 50% liều uống được chuyển
hóa qua gan lần đầu và sinh khả dụng trong máu tuần hoàn xấp xỉ 50% sinh khả
dụng của liều tiêm tĩnh mạch. Nồng độ thuốc tối đa trong huyết tương xuất hiện 2
giờ sau khi uống, nồng độ trong dịch bao hoạt dịch đạt mức cao nhất sau khi uống
từ 4 đến 6 giờ. Tác dụng của thuốc xuất hiện 20 - 30 phút sau tiêm bắp, 30 - 60
phút sau khi đặt thuốc vào trực tràng, 60 - 120 phút sau khi uống.
Nửa đời trong huyết tương khoảng 1 - 2 giờ. Nửa đời thải trừ khỏi dịch bao
hoạt dịch là 3 - 6 giờ. Xấp xỉ 60% liều dùng được thải qua thận dưới dạng các chất
chuyển hóa còn một phần hoạt tính và dưới 1% ở dạng thuốc nguyên vẹn; phần
còn lại thải qua mật và phân. Hấp thu, chuyển hóa và đào thải có phụ thuộc vào
tuổi hay không còn đang được xem xét. Nếu liều lượng và khoảng cách giữa các
7

8


- Người uống theo chỉ định của bác sĩ.
1.3. Lịch sử nghiên cứu vấn đề
Trên thế giới:
- Next và Colvin (1957) chứng minh rằng cellulose được G. xylinum tổng hợp
trong môi trường có đường và ATP. Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật,
cấu trúc của cellulose vi khuẩn ngày càng được hiểu khá rõ, đó là các chuỗi
polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan. Saxena
(1990) đã giải thích cơ chế tổng hợp cellulose của G. xylinum bằng việc giải trình
tự đoạn gen tổng hợp cellulose. Ông đã tách chiết được đoạn polypeptide liên
quan đến quá trình tổng hợp cellulose tinh khiết dài 83kDa. Từ đó đến nay đã có
nhiều công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm cấu trúc, cơ chế tổng hợp, ứng
dụng của cellulose vi khuẩn [7].
Ở Việt Nam:
- Việc nghiên cứu về màng CVK cũng như các ứng dụng của nó còn hạn chế,
mới chỉ dừng ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa phổ biến rộng rãi ra ngoài cuộc
sống thực tế.
- Màng CVK và các ứng dụng được nghiên cứu tại Phòng Vi sinh, thuộc Khoa
Sinh - KTNN. Điển hình như nhóm nghiên cứu của GS.TS Đinh Thị Kim Nhung
và cộng sự đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter
xylinum tạo màng BC ứng dụng trong điều trị bỏng “( 2012 ) cho thấy màng BC
tạo ra từ loại vi khuẩn này có sợi cellulose nhỏ, dẻ dai, độ thấu khí cao, độ hút
nước tốt có triển vọng ứng dụng làm màng trị bỏng [8]và một loạt các công trình
khác đã được công nhận.
- Sử dụng màng CVK trong hệ thống vận tải thuốc được nghiên cứu tại Viện
Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng của Khoa Sinh – KTNN.

9


- Và các dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.1.4. Môi trường lên men thu vật liệu CVK
Vật liệu CVK được tạo lên từ môi trường chuẩn:
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo vật liệu CVK
Môi trường

Thành phần

MTC

Glucose

20g

Pepton

5g

Diamoni photphat

2,7g

Cao nấm men

5g

Acid citric

1,5g

Ép loại nước
Ngâm trong NaOH 3%
48 h, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48 h, rửa và ép
Ngâmtrong nước
48 h, kiểm tra tạp chất
Thu CVK tinh

Hình 2.1. Quy trình tinh chế màng CVK
+ Tách CVK: Trong điều kiện nuôi cấy CVK tạo thành một lớp màng có
độ dày tùy thuộc vào khoảng thời gian lấy màng ra, thời gian càng lâu, độ dày
màng càng lớn, lấy màng ra khỏi môi trường.
+ Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn có chứa nội độc tố, vì vậy,
phải hấp màng trong NaOH 3%, nhiệt độ 113°C để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn
và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn.
+ Ngâm HCl: Màng sau khi được ngâm bằng NaOH rửa nước tới khi màng
trắng rồi ép màng. Sau đó ngâm với HCl 3% khoảng 48h để trung hòa hết NaOH.
+ Ngâm nước: Màng sau khi ngâm với HCl rửa sạch bằng nước rồi ép
màng. Ngâm nước để trung hòa hết acid trong khoảng 48h ta thu được CVK
tinh chế.
CVK tinh chế được sấy trong tủ sấy ở 90°C, áp suất thường trong khoảng 4
giờ đến khối lượng không đổi, ta được khối lượng CVK tạo thành.
12


2.1.5. Môi trường pH dùng để xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ
thống được thiết kế
Môi trường pH được sử dụng để tiến hành thử nghiệm là 2; 4,5; 6,8; 7,4.
Pha 4 dung dịch đệm có pH như trên theo công thức pha chế dung dịch

Bảng 2.2. Bảng xây dựng đường chuẩn
Giá trị OD 276 nm (n=3)
Giá trị
STT

Nồng độ

Lần 1

Lần 2

Lần 3

trung bình

1

10%

0.116

0.116

0.119

0.117±0.013

2

20%


0.7±0.04

5

80%

0.95

0.94

0.96

0.94±0.006

6

100%

1.169

1.173

1.171

1.171±0.001

14




× 100%

(2)

Trong đó:
EE: Là phần trăm thuốc được hấp thụ vào màng (%).
Qt: Là lượng thuốc lý thuyết (mg).
Qd: Là lượng thuốc còn lại (mg).
2.2.3. Nghiên cứu sự giải phóng thuốc từ vật liệu CVK nạp thuốc
- Cho màng CVK ở trạng thái ép và giữ nguyên đã hấp thụ Diclofenac có độ
dày màng 0,5 và 1cm vào bình có chứa 900ml môi trường pH tương ứng bằng 2,0;
4,5; 6,8 và 7,4.
Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 100 vòng/phút, nhiệt độ là 37 độ C.
Sau 0,5h, 1h, 2h, 4h, 8h, 12h, 24h tiến hành rút mẫu để đo mật độ quang phổ.
Lượng mẫu được rút ra sau mỗi khoảng thời gian là 5ml và được bổ sung 5ml dung
dịch đệm tương ứng.
Để có kết quả chính xác và tin cậy, ta lặp lại thí nghiệm 3 lần và lấy kết quả
trung bình.

- Tỉ lệ giải phóng Diclofenac từ màng BC được tính theo công thức (3):
15


R% =

�� ×�1 +∑

�� × �2