Tài liu lun vn s phm 1 of 63.

a

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ LAN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP
BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI - 2019

Footer Page 1 of 63.


Tài liu lun vn s phm 2 of 63.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Đặc biệt là sự giúp đỡ, động viên của gia
đình, bạn bè em trong suốt thời gian làm khóa luận.
Mặc dù, đã có nhiều cố gắng để hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất,
tuy nhiên, do lần đầu làm quen với công việc nghiên cứu khoa học cũng như
hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu sót,
em rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy, cô giáo để khóa luận hoàn chỉnh
hơn.
Một lần nữa, em xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Thị Lan

Footer Page 3 of 63.


Tài liu lun vn s phm 4 of 63.

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin khẳng định những gì viết trong khóa luận “ Nghiên cứu khả
năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Berberine hydrocloride tạo
ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước dừa già” là
kết qủa nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS. Cao Bá
Cường, giảng viên Khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Tất
cả những số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, đảm
bảo tính chính xác và trung thực.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Thị Lan

1.1.4. Môi trường nuôi cấy Gluconacetobacter xylinus ............................. 5
1.1.5. Các phương pháp sản xuất BC từ Gluconacetobacter xylinus ......... 7
1.1.5.1. Lên men tĩnh ......................................................................................... 7
1.1.5.2. Lên men động ....................................................................................... 7
1.2.1. Trên thế giới ...................................................................................... 7
1.2.2. Ở Việt Nam ....................................................................................... 8
1.3. Tổng quan về Berberine hydrochloride .................................................... 9
1.3.1. Công thức hóa học và tính chất ........................................................ 9
1.3.1.1. Công thức hóa học ............................................................................... 9
1.3.1.2. Nguồn gốc .......................................................................................... 10
1.3.1.3. Tính chất vật lý ................................................................................... 10
1.3.1.4. Tính chất hóa học ............................................................................... 11

Footer Page 6 of 63.


Tài liu lun vn s phm 7 of 63.

1.3.1.5. Tác dụng ............................................................................................ 11
1.4. Tình hình nghiên cứu Berberine hydrochloride trên thế giới và tại Việt
Nam ................................................................................................................. 12
1.4.1. Trên thế giới .................................................................................... 12
1.4.2. Ở Việt Nam ..................................................................................... 12
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................ 14
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 14
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 14
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất ........................................................................ 14
2.2. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 14
2.2.1. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu......................................... 14
2.2.2. Dụng cụ ........................................................................................... 15



Tài liu lun vn s phm 9 of 63.

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của BH ............................................................. 10
Hình 2.1 Dùng máy khuấy từ khuấy đều môi trường nuôi cấy ...................... 16
Hình 2.2. Sơ đồ tinh chế màng BC. ................................................................ 17
Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của BH................................................. 19
Hình 3.1. Màng CV được nuôi cấy trong môi trường nước dừa già .............. 23
Hình 3.2. Màng CV thô ................................................................................... 24
Hình 3.3. CV ngâm trong HCl
Hình 3.4. Màng CV sau khi được tinh chế
......................................................................................................................... 25
Hình 3.5. Màng CV dày 0.5 cm ...................................................................... 25
Hình 3.6. Màng CV dày 0.3 cm ...................................................................... 25
Hình 3.7. Màng CV đang hấp thụ thuốc ......................................................... 26
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn OD giải phóng thuốc BH của màng CV .............. 28
Hình 3.9. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH =12. .................................................. 30
Hình 3.10. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH = 2. ................................................. 31
Hình 3.11. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH=6.8 ................................................. 31

Footer Page 9 of 63.


Tài liu lun vn s phm 10 of 63.

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần nước dừa già ............................................................... 15

minh, khi dùng kết hợp các thuốc kháng sinh với berberine có thể hạn chế được
các tác dụng không mong muốn khi dùng thuốc kháng sinh với hệ vi sinh đường
ruột [8]
Berberine được cho là một trong những loại thuốc rất ít khi gây dị ứng
cho người sử dụng, rất lành tính và an toàn. Berberine được chống chỉ định
dùng đối với phụ nữ mang thai vì có thể sẽ gây co bóp tử cung, điều này sẽ ảnh
hưởng nghiêm trọng đến thai nhi và với những người quá mẫn cảm với các
thành phần của thuốc [7]
Cellulose vi khuẩn do một loài vi khuẩn sản xuất ra, đặc biệt là chủng
Gluconacetobacter xylinus. Cellulose vi khuẩn tương tự như cellulose thực vật,
chúng giống nhau về mặt hóa học, cellulose vi khuẩn bao gồm các liên kết β1,4-glucan, nhưng cellulose thực vật khác cellulose vi khuẩn về mức độ
polymer hóa. Độ tinh sạch của cellulose vi khuẩn cao hơn độ tinh sạch của các
1
Footer Page 11 of 63.


Tài liu lun vn s phm 12 of 63.

loại cellulose khác rất nhiều, nó không chứa các hợp chất cao phân tử như ligin,
hemicellulose do vậy cellulose vi khuẩn chúng có những đặc tính vượt trội
cellulose khác: dẻo dai, bền chắc [1]
Cellulose vi khuẩn được ứng dụng ở nhiều nơi trên thế giới đặc biệt nó
được quan tâm trong các ngành như: công nghiệp thực phẩm, y học, mỹ phẩm,
khoa học vật liệu, bảo vệ môi trường...Trong lĩnh vực y học là một ví dụ cụ thể,
màng Cellulose vi khuẩn đã được nghiên cứu sử dụng làm da nhân tạo thay thế
da người trong việc điều trị bỏng, các bệnh liên quan về da, đặc biệt được sử
dụng làm mạch máu nhân tạo để điều trị các bệnh tim mạch; trong phẫu thuật
thẩm mĩ. Ở Việt Nam, do hạn chế về trang thiết thị nên việc nghiên cứu về
màng và các ứng dụng còn nhiều hạn chế, chúng ta đang dừng lại ở những bước
đầu nghiên cứu về màng.

màng Cellulose vi khuẩn. Mở ra một hướng đi mới trong việc nghiên cứu các
hạn chế cũng như khắc phục của thuốc Berberine và còn có thể nghiên cứu trên
các loại thuốc khác giúp cho ngành y học ngày càng phát triển.
Đồng thời tìm và phát hiện ra các ưu nhược điểm của màng Cellulose vi
khuẩn để có hướng nghiên cứu giúp tăng đặc tính của màng, hạn chế các đặc
tính không tốt của màng ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau.
- Ý nghĩa thực tiễn
+ Định hướng khắc phục những nhược điểm của thuốc Berberine thông thường:
tăng tác dụng của thuốc, rút ngắn thời gian điều trị cho bệnh nhân...
+ Từ việc tạo ra màng Cellulose vi khuẩn dùng làm hệ thống khắc phục các tác
dụng không mong muốn của thuốc.
+ Đưa các nghiên cứu vào thực tiễn cuộc sống.

5. Nội dung nghiên cứu
-

Nghiên cứu quy trình nuôi cấy Gluconacetobacter xylinus từ môi trường

nước dừa già.
-

Tạo màng Cellulose vi khuẩn từ dịch nuôi cấy và tiến hành xử lí thu

màng sau khi nuôi cấy.
-

Tiến hành thử nghiệm các tác dụng của màng trong quá trình giải phóng

thuốc berberine hydrocholoride.


rộng khoảng 1,5nm. Các sợi thứ cấp này là các sợi tự nhiên, mảnh hơn các sợi
sơ cấp trong thượng tầng của một số loại thực vật. Các sợi thứ cấp kết lại tạo
thành vi sợi, vi sợi lại kết lại tạo thành các bó sợi, các bó sợi lại tạo thành các
dải. Dải có chiều dày 3-4 nm, và có chiều dài 130-177 nm (Yamanaka et al,

4
Footer Page 14 of 63.


Tài liu lun vn s phm 15 of 63.

2000). Các dải siêu mịn, có dạng các mắt lưới, được giữ ổn định nhờ các liên
kết có chiều dài từ 1µm-9µm, được gọi là lớp màng film (Bielecki at al, 2001).
Màng Cellulose vi khuẩn được tạo ra do gluconacetobacter xylinus khác
nhau về cấu trúc đồng thể nhưng lại có cấu trúc hóa học đồng nhất [2].
1.1.3. Đặc tính của màng Cellulose vi khuẩn tạo bởi Gluconacetobacter
xylinus
Cellulose vi khuẩn có cấu trúc mạng tinh thể ở dạng nhỏ nhất, nó là

-

Cellulose trong suốt có thành phần tỉ lệ Iα cao.
Màng cellulose vi khuẩn có kích thước cố định, có sức căng và độ bền

-

đặc biệt là độ bền sinh học cao.
Có khả năng hút nước, cũng như khả năng giữ nước tốt đặc biệt ở trạng

-

trưởng và các yếu tố vi lượng khác [3].

5
Footer Page 15 of 63.


Tài liu lun vn s phm 16 of 63.

Môi trường nước dừa già rất thích hợp trong việc nuôi cấy vi khuẩn vì trong
nước dừa già có nhiều thành phần chất dinh dưỡng và chất kích thích tăng
trưởng như 1,3 – diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol, … Vì
vậy gluconacetobacter xylinus rất thích hợp phát triển trong môi trường nước
dừa già [1].
Nước dừa lấy ra sau thu hoạch không để quá 3 ngày, vì nếu để lâu sẽ làm cho
lượng đường và các chất dinh dưỡng trong đó giảm đi đáng kể [1].
Thành phần của nước dừa già [1] được trình bày trong bảng 1.1
Nước (%)
Protein (%)
Chất béo toàn phần (%)

94,99 Đồng (mg/100g)
0,72 Mangan (mg/100g)

0,04
0,142

0,2 Selenium (µg/100g)

1


Phosphorus (mg/100g)

20 Vitamin

B6

(mg/100g)

0,032
Kali (mg/100g)

250 Folate (µg/100g)

Natri (mg/100g)

105

Kẽm (mg/100g)

0,1

Bảng 1.1 Các thành phần trong nước dừa già

6
Footer Page 16 of 63.

3


Tài liu lun vn s phm 17 of 63.

Footer Page 17 of 63.


Tài liu lun vn s phm 18 of 63.

thể giải phóng thuốc là 0,116 kg/cm2 và có thể kéo dài tác dụng đến 24 giờ
chống lại hoạt động của S.Aureus và B. Subtilis [11]
Năm 1989, Brown đã phân tách màng Cellulose vi khuẩn để làm môi trường
trong quá trình lọc nước, dùng làm chất mang cho pin, và cung cấp năng lượng
cho tế bào [7]
Màng Cellulose vi khuẩn có nhiều tính chất đặc biệt như: tính thấm nước
cao, có thể kết dính và tính trơ hóa học nên màng Cellulose vi khuẩn được coi
như một màng sinh học. Trong y học người ta đã nghiên cứu và ứng dụng màng
sinh học để làm da nhân tạo thay thế cho da người như ở Brazil. Trên thế giới
các ngành dược phẩm và làm đẹp ứng dụng nhiều tác dụng của màng Cellulose
vi khuẩn. Các tác giả: Hamlyn và cs (1997), Cienchansk (2004), Legeza và cs
(2004), Wan và Milon (2005), Czaja và cs (2006) đã tiến hành áp dụng vào
thực tiễn khi dùng màng Cellulose vi khuẩn đặt lên các vết thương hở, các vết
loét, bỏng liên quan về da và đã đạt được kết quả tốt. Một số tác giả đã đăng kí
quyền sử dụng về việc sử dụng màng này trong điều trị cho bệnh nhân( điều trị
bỏng) như nhà khoa học người Canada. Các tác giả Jonas và Farad (1998),
Czaja và cs (2006) đã ứng dụng màng Cellulose vi khuẩn để làm da thay thế da
thật cho bệnh nhân hay ứng dụng làm các sản phẩm làm đẹp cho con người [9].
Năm 2012 Luan J.và Cs [12] đã dùng màng cellulose vi khuẩn để quán các vết
thương nạp sulfadiazine bạ, đây là loại thuốc được dùng trong điều trị vết
thương nhiễm trùng. Kết quả cho thấy sau khi sử dụng màng CV ngâm tẩm bạc
sulfadiazine đắp lên nơi có vết thương, hoạt động kháng khuẩn đối với P.
aeruginosa và Ecoli và S. aureus đạt kết quả tốt hơn dạng kem bôi hay các
dung dịch thông thường.
1.2.2. Ở Việt Nam


9
Footer Page 19 of 63.


Tài liu lun vn s phm 20 of 63.

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của BH
1.3.1.2. Nguồn gốc
BH có ở các bộ phận của cây như: rễ, thân rễ, thân, vỏ cây những cây thuộc chi
Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis, BH có nhiều trong thân và rễ
cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5 - 3%, trong đó berberine chiếm 82% so với alcaloid
toàn phần.
BH không tinh khiết mà có lẫn alcaloid như: palmatin, jatrorrhizin. Các tạp chất
palmatin không quá 2%, jatrorrhzin không quá 5%.
1.3.1.3. Tính chất vật lý
Berberine thường tồn tại ở hai dạng: tinh thể hay bột kết tinh, 2 dạng này đều
có màu vàng, không vùi và có vị đắng. Ở dạng bazơ nó tan chảy ở 1450C, ở
dạng này nó tan không nhanh trong nước, có thể tan trong ethanol và tan ít trong
nước. Ở dạng muối clorid tan ở tỷ lệ 1/400 trong nước, tan tốt trong nước sôi
và ethanol, nhưng lại không tan trong cloroform và ether. Dạng muối Sulfat dễ
tan trong nước và ethanol [13].

10
Footer Page 20 of 63.


Tài liu lun vn s phm 21 of 63.

1.3.1.4. Tính chất hóa học


1.4. Tình hình nghiên cứu Berberine hydrochloride trên thế giới và tại Việt
Nam
1.4.1. Trên thế giới
Trên thế giới người ta đã tiến hành một số công trình nghiên cứu và đạt được
hiệu quả tốt như: Lin Huang, Xiuli Chen, Thanh Nguyen Xuan, Huiru Tang,
Liming Zhang [15] đã nghiên cứu tạo ra Chitosan tráng (bọc) nano-liposome
cho việc phân phối uống berberine hydrochloride. Kết quả cho thấy chitosan
bọc nano-liposome đạt kết quả tốt hơn so với không tráng cho việc cung cấp
bằng miệng của BH.
Berberine có tính an toàn và có kết quả tốt trong việc điều trị bệnh tiểu đường
loại II cho bệnh nhân đã được Huilixing và Jianping Ye xác định [16].
Tác dụng của Berberine về bệnh tiểu đường một lần nữa được Ryan Bradley
tiến hành nghiên cứu thành công [31].
Màng CV kiểm soát invitro thuốc berberine gần đây đã được Lin Huang nghiên
cứu, nó không chỉ thẩm thấu qua da mà sự giải phóng Berberine còn được thí
nghiệm trên dạ dày và ruột. Kết quả thu được Berberine giải phóng với tốc độ
chậm.
1.4.2. Ở Việt Nam
Việt Nam cũng có một số tác giả nghiên cứu về thuốc Berberine hydrochloride:
- Năm 2010 các tác giả Vũ Bình Dương, Nguyễn Trọng Diệp, Nguyễn Thị
Thùy, Hoàng Văn Lương đã nghiên cứu và bào chế Berberine ở dạng viên nén
100mg giải phóng ở đích đại tràng theo cơ chế phân giải hệ vi sinh vật [5].
- Trong cây thuốc Việt Nam một thành phần quan trọng là alkaloid đã được
Phan Quốc Kinh nghiên cứu [6].
- Nguyễn Liêm - chiết xuất Berberine bằng áp lực nóng.
- Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm - góp phần nghiên cứu cải tiến quy trình sản
xuất Berberine từ cây vàng đắng [2].

12



BH dạng tinh khiết > 99%



Đường glucose



Pepton



(NH4)2SO4



Acid acetic



NaOH, HCl



Nước cất




Khuấy từ gia nhiệt (IKA – Đức)



Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản)
14

Footer Page 24 of 63.


Tài liu lun vn s phm 25 of 63.



Nồi hấp khử trùng HV – 110/ HIRAIAMA



Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức)



Máy lắc TEIO TRCH (Hàn Quốc)

2.2.2. Dụng cụ
Bình tam giác định mức các loại 250 ml, 500 ml, 1000 ml, pipet, ... giấy bạc
(hoặc màng bọc thực phẩm), vải lọc, giấy thấm và các dụng cụ trong phòng thí
nghiệm.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tạo màng BC


0,5g

5

Pepton

10g

6

Acid axetic

2%

7

Dịch

giống 10%

gluconacetobacter
xylius
Bảng 2.1: Thành phần nước dừa già

15
Footer Page 25 of 63.