Tài liu lun vn s phm 1 of 63.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
===o0o===

TRẦN THỊ THU YẾN

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG
GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
NẠP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI, 5/2019
Footer Page 1 of 63.


Tài liu lun vn s phm 2 of 63.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
===o0o===

TRẦN THỊ THU YẾN

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG
GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE

của bạn bè, gia đình trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Trần Thị Thu Yến

Footer Page 3 of 63.


Tài liu lun vn s phm 4 of 63.

LỜI CAM ĐOAN

Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp của mình, tôi xin cam
đoan:
1. Đề tài của tôi không sao chép bất cứ tài liệu nào có sẵn.
2. Đây là công trình của bản thân tôi nghiên cứu thực tiễn. Kết quả
trong khóa luận này đảm bảo tính chính xác và trung thực.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Trần Thị Thu Yến

Footer Page 4 of 63.


Tài liu lun vn s phm 5 of 63.

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT


MTG

Môi trường gạo

NCKH & ƯD

Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng

OD

Optical density

UV – vis

Ultraviolet visible


Tài liu lun vn s phm 6 of 63.

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ......................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .................................................................... 2
NỘI DUNG .................................................................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 4
1.1. Đặc điểm, tính chất và ứng dụng của vật liệu cellulose .......................... 4
1.1.1.Đặc điểm cấu trúc màng cenllulose vi khuẩn ......................................... 4

2.2.6. Phương pháp qua môi trường đệm Phosphate buffered saline
(PBS). ........................................................................................................... 17
2.2.7. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống
được thiết kế. ................................................................................................ 17
2.2.8. Phương pháp xử lý thống kê ............................................................... 18
2.2.9. Địa điểm nghiên cứu........................................................................... 19
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 20
3.1. Kết quả tạo màng và xử lý VLC từ các môi trường khác nhau ............... 20
3.1.1. Thu VLC từ các môi trường lên men ................................................... 20
3.1.2. Quá trình xử lý VLC trước khi hấp thu thuốc ...................................... 21
3.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết của VLC .......................................................... 21
3.2. Khảo sát khả năng hấp thụ thuốc Berberine Hydrochloride của VLC
trong các môi trường khác nhau ................................................................... 22
3.3. Tỷ lệ giải phóng thuốc của các VLC ...................................................... 23
3.3.1 Tỷ lệ giải phóng thuốc của các màng chuẩn ........................................ 23
3.3.2. Tỷ lệ giải phóng thuốc BH của màng nước dừa già ............................ 25

Footer Page 7 of 63.


Tài liu lun vn s phm 8 of 63.

3.3.3. Tỷ lệ giải phóng thuốc BH của màng nước vo gạo.............................. 27
3.3.4. So sánh tỷ lệ giải phóng thuốc BH ra các VLC ở các độ dày khác
nhau trong cùng 24 giờ tại pH = 2 ............................................................... 29
3.3.5. So sánh tỷ lệ giải phóng thuốc ra VLC ở các độ dày khác nhau
trong cùng 24 giờ tại pH = 6,8 ..................................................................... 30
3.2.6. So sánh tỷ lệ giải phóng thuốc BH ra các VLC ở các độ dày khác
nhau trong cùng 24 giờ tại pH = 12 ............................................................. 31
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 33

Tài liu lun vn s phm 10 of 63.

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của vật liệu cellulose ................................ 4
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Berberine .................................................... 7
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Berberine Hydrochloride ............................. 7
Hình 2.1. Sơ đồ tinh chế thu VLC ................................................................ 14
Hình 2.2. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn Berberine Hydrochloride ............... 16
Hình 3.3. VLC lên men từ môi trường nước vo gạo .................................... 21
Hình 3.4. VLC tinh thể thu được .................................................................. 21
Hình 3.5. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của VLC ........................................ 22
Hình 3.6. Tỷ lệ giải phóng thuốc Berberine Hydrochloride từ màng
chuẩn với độ dày 0,3 cm và 0,5 cm............................................... 24
Hình 3.7. Tỷ lệ giải phóng thuốc BH của màng dừa với độ dày 0,3 cm và
0,5 cm........................................................................................... 26
Hình 3.8. Tỷ lệ thuốc BH được giải phóng từ màng gạo với độ dày 0,3
cm và 0,5 cm ................................................................................ 28
Hình 3.11. Tỷ lệ giải phóng thuốc BH ra các vật liệu cellulose ở các độ
dày khác nhau ở thời điểm 24 giờ tại pH = 2 ................................ 29
Hình 3.10. Tỷ lệ giải phóng thuốc BH ra các VLC ở các độ dày khác
nhau trong cùng 24 giờ tại pH = 6,8 ............................................. 30
Hình 3.11. Tỷ lệ giải phóng thuốc BH ra các VLC ở các độ dày khác
nhau ở thời điểm 24 giờ tại pH = 12 ............................................. 31

Footer Page 10 of 63.


Tài liu lun vn s phm 11 of 63.



1
Footer Page 11 of 63.


Tài liu lun vn s phm 12 of 63.

Với mục đích tạo ra VLC lên men từ vi khuẩn G. xylinus nuôi cấy trong
một số môi trường nạp Berberine Hydrochloride, sau đó khảo sát, đánh giá sự
giải phóng thuốc. Đó là lý do tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu so sánh khả năng
giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Berberine Hydrochloride tạo ra từ
Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong một số môi trường.”
2. Mục đích nghiên cứu
- Tạo ra vật liệu cellulose đã hấp thụ Berberine Hydrochloride được lên
men từ một số môi trường.
- Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng Berberine Hydrochloride từ
vật liệu cellulose đã nạp thuốc trong một số môi trường pH khác nhau nhằm
tìm ra trường hợp khả năng giải phóng Berberine Hydrochloride tối đa.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: so sánh khả năng giải phóng thuốc Berberine
Hydrochloride của VLC lên men từ một số môi trường.
- Vật liệu nghiên cứu:
+ Môi trường nuôi cấy vi khuẩn G. xylinus tạo vật liệu cellulose (môi
trường chuẩn, môi trường nước dừa già, môi trường nước vo gạo).
+ Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus.
- Phạm vi nghiên cứu: quy mô phòng thí nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Sinh lý người và động vật
khoa Sinh – KTNN, Trường ĐHSP Hà Nội 2, Viện NCKH & ƯD Trường
ĐHSP Hà Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

thành từng chuỗi và không có khả năng di động. Tế bào thường được tìm thấy
trong dịch rượu, giấm, nước ép hoa quả, trong đất. Ngoài ra, khả năng tổng
hợp cellulose rất lớn.
Trên môi trường nuôi cấy lỏng, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn
G. xylinus sử dụng đường để chuyển hóa tạo một lớp màng cellulose dẻo dai,
dày, có màu trắng trong hơi ngả vàng. Màng này có bản chất là tập hợp các vi
khuẩn liên kết với phân tử cellulose [27].
Vật liệu cellulose và cellulose thực vật tương tự nhau về mặt hóa học
tuy nhiên cấu trúc và đặc tính lại khác nhau. VLC là một chuỗi polymer do
các glucopyranose nối với nhau bởi liên kết β – 1,4 – glucan xếp song song
quanh trục. VLC gồm nhiều sợi siêu nhỏ, đường kính 1,5 nm. Các sợi này kết
hợp với nhau tạo thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100
nm, rộng 3 – 8 nm [21]. Đặc tính cấu trúc của vật liệu cellulose phụ thuộc rất
nhiều vào môi trường nuôi cấy.

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của vật liệu cellulose

4
Footer Page 14 of 63.


Tài liu lun vn s phm 15 of 63.

1.1.2. Tính chất của vật liệu cellulose
- Ở điều kiện nuôi cấy tĩnh trong môi trường thể dịch, vật liệu cellulose
được tạo thành có tính chất như: khả năng kết tinh cao, độ polymer hóa lớn
nên VLC có độ bền cơ học cao, khả năng thấm và hút nước tốt do đó có thể
điều chỉnh được độ xốp, độ tinh sạch cao, kích thước ổn định,.... Đặc biệt,
VLC có những đặc tính ưu việt hơn hẳn VLC thực vật: độ chịu lực, độ bền cơ
học, tính đàn hồi,…

có ý nghĩa đối với các cơ sở sản xuất thạch dừa. Ngoài ra, sản phẩm VLC còn
được làm màng bao xúc xích, làm màng bảo quản dừa tươi, thịt tươi được sơ
chế tôi thiểu ở nhiệt độ mát, vật liệu ổn định huyền phù, có tác dụng như chất
làm đặc trong nước ép, mứt kẹo, kem, salad,…
- Trong lĩnh vực mỹ phẩm: sản phẩm VLC vừa có khả năng giữ ẩm cao
lại không bám lại trên da sau khi rửa và không gây tác dụng phụ như sản
phẩm dưỡng da khác. Vì vậy, chúng được làm mặt nạ dưỡng da, móng tay
nhân tạo, kem dưỡng da, sơn móng tay,…
- Trong lĩnh vực môi trường: VLC được ứng dụng làm miếng xốp làm
sạch những vết dầu tràn; làm chất hấp thu trong các vật liệu để loại bỏ chất
độc hại; quần áo, dày dép tự phân hủy,…
1.2. Giới thiệu về thuốc Berberine Hydrochloride
1.2.1. Nguồn gốc
Berberine, tên khác là Berberine sulfate hoặc chlorhydrate. Berberine là
một alkaloid được chiết xuất từ cây Hoằng đằng (còn có tên vàng đắng, hoàng
liên, tên khoa học là Coptis teet) là loại cây dây leo than gỗ có phân nhánh,
mọc hoang ở nhiều nơi. Trong Hoằng đằng có nhiều alkaloid dẫn xuất của
izoquinolein, chủ yếu là Berberine tỷ lệ từ 1,5 – 2,3 %. Alkaloid Berberine có
thể được tìm thấy trong thân cây, vỏ cây, rễ và thân rễ (thân cây dưới lòng
đất) của cây [5], [8], [15].
Berberine thường có lẫn các tạp chất alkaloid khác như: palmatin,
jatrorrhizine. Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2 %, jatrorrhizin không
quá 5% [1], [5], [15].
1.2.2. Cấu trúc
Berberine thuộc nhóm isoquinol có khung protoberberine [1].
Isoquinolin còn được gọi là benzo pyridine hay 2 – benzamin là một họp chất
hữu cơ thơm heterocylic.
Công thức cấu tạo:

6


vành, mặt khác, với liều lượng lớn gây ức chế hô hấp khiến trung khu hô hấp
bị tê liệt trong khi tim vẫn đập [25].
Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng: Berberine Hydrochloride có
thể làm giảm lượng đường trong máu, giúp ngăn ngừa và điều trị tiểu đường
type 2 và các biến chứng của nó, như biến chứng về tim mạch và thần kinh
ngoại biên [16]. Berberine Hydrochloride có tác dụng làm giảm mạnh lượng
cholesterol, LD cholesterol, triglyceride xơ vữa nhưng có cơ chế hoạt động
không giống với statin làm cho Berberine Hydrochloride không gây ra tác
dụng phụ. Không những thế, Berberine Hydrochloride còn có thể dùng trong
bệnh động kinh với khả năng chống co giật, trong các trường hợp tổn thương
não do tắc mạch máu não gây ra, Berberine Hydrochloride bảo vệ các tế bào
thần kinh và có tác dụng chống trầm cảm. Đặc biệt, Berberine Hydrochloride
còn có tác dụng chống ưng thư, nó được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển
của nhiều loại tế bào ung thư mà không gây tác động đến sự phát triển của tế
bào bình thường ở nồng độ nhất định [25].
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc Berberine Hydrochloride
- Chỉ định: Viêm đường ruột, tiêu chảy, lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ,
viêm ống mật, các chứng đau mỏi mắt và ngứa mắt do dị ứng [10].
- Chống chỉ định: quá mẫn cảm với các thành phần của thuốc, phụ nữa
có thai và cho con bú vì có khả năng gây co bóp tử cung làm ảnh hưởng tới
thai nhi [1], [10].
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc Berberine Hydrochloride
1.3.1.1. Trên thế giới
Trên thế giới đã có những công trình nghiên cứu về berberin như sau:
Huilixing và Jianping Ye đã xác định hiệu quả và tính an toàn của
berberin trong điều trị bệnh nhân tiểu đường loại 2 [22].
Ryan Bradley, ND, MPH và Bill Walter, ND đã nghiên cứu về berberin
trong điều trị bệnh tiểu đường [26].

1.3.2. Tình hình nghiên cứu vật liệu cellulose
1.3.2.1. Trên thế giới
Trên thế giới, nhiều nước đã nghiên cứu về VLC từ vi khuẩn G. xylinus
và những ứng dụng của nó. Tác giả Brown 1989, sử dụng VLC làm môi
trường phân tách cho quá trình xử lý nước, là chất mang đặc biệt cho các pin
và năng lượng tế bào [20]. Ngoài ra, ông và cộng sự sử dụng VLC như và một

9
Footer Page 19 of 63.


Tài liu lun vn s phm 20 of 63.

chất biến dổi độ nhớt, để tạo ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất
trong sinh học, thực thực phẩm thay thế thực phẩm [20]. Không những thế,
VLC còn được ông sử dụng làm vải đặc biệt, để sản xuất giấy chất lượng cao,
làm cơ chất để cố định proteinhay cho sắc kí.
1.3.2.2. Ở Việt Nam
Ở nước ta, tình hình điều trị bỏng ngày càng được cải tiến. Việc điều trị
bỏng bao gồm: cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số màng trị bỏng như màng
ối, da ếch, trung bì da lợn, màng chitosan,… Từ năm 2000, tác giả Nguyễn
Văn Thanh [7] và cộng sự đã có một số công trình nghiên cứu về VLC, đây là
cơ sở để chế tạo màng sinh học dùng trong điều trị bỏng [7].

10
Footer Page 20 of 63.


Tài liu lun vn s phm 21 of 63.



Tài liu lun vn s phm 22 of 63.

Hộp nhựa, ống nghiệm, cốc đọng thủy tinh, đũa thủy tinh, bình thủy
tinh có nút xoáy, lọ penicillin, đèn cồn, kẹp gỗ, bình hút ẩm, giấy lọc, giấy
quỳ tím, bình định mức 100 ml, 500 ml, 1000 ml, pipet 1 ml, 5 ml, 10 ml,
thước kẹp panme,… và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.1.4. Nguyên liệu – hóa chất
Nguyên liệu: Nước dừa già, nước vo gạo, nước cất 2 lần, gạc vô trùng.
Hóa chất:
- Thuốc Berberine dạng tinh khiết (98%)
- Các hóa chất thông thường: amoni sunfat, diamoni phosphate hydro,
Na2 HPO4 , acid acetic, NaOH, HCL, đường glucose, pepton.
- Hóa chất dùng để pha môi trường pH: HCldd , KCl, acid citric,
Na2 HPO4 .12H2O, ethanol 96°, thuốc thử Fehling.
- Các hóa chất trên đảm bảo tiêu chuẩn phân tích, có nguồn gốc từ Việt
Nam và Trung Quốc.
2.1.5. Môi trường lên men tạo vật liệu cellulose
Bảng 2.1. Thành phần của các môi trường lên men tạo VLC

Thành phần
Glucose
Pepton
Diamoni photphat hydro
Disodium phosphate hdro
Amoni sulfat
Acid citric
Cao nấm men
Acid acetic
Nước dừa già


12
Footer Page 22 of 63.

Môi trường
MTD
30 g
10 g
0,3 g

10%

10%


Tài liu lun vn s phm 23 of 63.

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lên men thu vật liệu cellulose từ một số môi trường
- Bước 1: Pha môi trường với các thành phần như bảng 2.2.
- Bước 2: Khử trùng các môi trường đó bằng cách hấp ở 113°C trong
15 phút.
- Bước 3: Sử dụng tia UV để khử trùng các môi trường trong 15 phút
rồi để nguội.
- Bước 4: Thêm 10% dịch giống và 2% acid acetic, lắc nhẹ và đều cho
giống phân bố đều trong dung dịch.
- Bước 5: Đậy kín các bình lên men bằng vải xo, ủ tĩnh trong khoảng 7
– 10 ngày ở khoảng 26 ℃.
- Bước 6: Thu VLC thô và làm sạch màng dưới với nước.
2.2.2. Phương pháp xử lý VLC trước khi hấp thụ thuốc

hiện trong ống nghiệm.
2.2.4. Phương pháp xác định đường chuẩn
Chuẩn bị dung dịch cồn 96° và các dung dịch với nồng độ Berberine
Hydrochloride ở (mg/ml) khác nhau là: 5%, 10%, 20%, 30%, 40% trong dung
dịch cồn 96°.
Đo cường độ quang phổ của các dung dịch đã pha ở bước sóng 345 nm
bằng máy đo quang phổ UV – Vis 2450 [14], [21].
Bằng phần mềm Excel 2010 xây dựng đồ thị đường chuẩn là lập
phương trình đường chuẩn Berberine Hydrochloride.
Thực hiện 3 lần đo như trên rồi lấy kết quả trung bình.
Kết quả trung bình giá trị OD 345 nm của các nồng độ thuốc khác nhau
được thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch Berberine Hydrochloride ở các
nồng độ (mg/ml) khác nhau (n=3)

Giá trị OD 345 nm (n=3)

STT

Nồng độ
(mg/ml)

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Giá trị trung
bình


1,522

1,532

1,526 ± 0,006

4

30

2,031

2,299

2,286

2,205 ± 0,151

5

40

2,966

3,004

3,046

3,005 ± 0,040