TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH –KTNN
======

TRẦN THỊ THÙY TRANG

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC
CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP NEOMYCIN SUFATE
TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XILINUS NUÔI CẤY
TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI
HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI, 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH –KTNN
======

TRẦN THỊ THÙY TRANG

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC
CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP NEOMYCIN SUFATE
TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XILINUS NUÔI CẤY
TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI
HỌC


LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan nội dung được trình bày trong khóa luận không sao chép
hay trùng lặp ở đề tài khóa luận nào. Kết quả, số liệu được nghiên cứu và thu được từ
thực nghiệm được em xử lý thống kê, đảm bảo tính trung thực và chưa được công bố
trong công trình khoa học hoặc tạo chí chuyên ngành hay các hội thảo khoa học, sách
chuyên khảo,… nào khác. Em có tham khảo một số tài liệu của các tác giả để hoàn
thành đề tài khóa luận của mình.
Nếu lời cam đoan sai em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Hà Nội, tháng 5

năm 2019

Sinh viên

Trần Thị Thùy Trang


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

STT

Từ viết tắt

Từ đầy đủ

1


PBS

Phosphate buffered saline

7

NCKH & CGCN

8

MT1

Môi trường 1

9

MT2

Môi trường 2

10

MT3

Môi trường 3

11

G.xylinus


2.2.1. Chuẩn bị màng CVK....................................................................................10
2.2.1.1. Lên men thu màng CVK thô .....................................................................10
2.2.1.2. Tạo màng CVK tinh chế ...........................................................................11


2.2.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết màng CVK tinh chế ...............................................11
2.2.1.4. Phương trình đường chuẩn NS trong PBS (pH = 7,4)...............................11
2.2.3. Phương pháp xác định khối lượng CVK tạo thành .......................................12
2.2.4. Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK ........................12
2.2.5. Phương pháp pha môi trường đệm PBS........................................................13
2.2.6. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống được thiết
kế ..........................................................................................................................14
2.2.7. Phương pháp xử lí thống kê .........................................................................15
2.3. Địa điểm nghiên cứu.......................................................................................15
2.4. Cách bố trí thí nghiệm ....................................................................................15
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................16
3.1. Thu màng CVK và tinh chế màng...................................................................16
3.1.1. Thu màng CVK từ các môi trường lên men .................................................16
3.1.2. Quá trình xử lý màng CVK trước khi hấp thu thuốc.....................................17
3.1.3. Xác định điều kiện nuôi cấy để có độ dày màng CVK thích hợp..................17
3.1.2. Tinh chế màng CVK ....................................................................................18
3.1.3. Xác định lượng thuốc giải phóng của các màng CVK ..................................18
3.2. Tỷ lệ giải phóng thuốc của các màng CVK .....................................................19
3.2.1. Tỷ lệ giải phóng thuốc của màng cao nấm men ............................................19
3.2.2. Tỷ lệ giải phóng thuốc của màng nước dừa già ............................................23
3.2.3. Tỷ lệ giải phóng thuốc của màng nước vo gạo .............................................25
3.3. So sánh tỉ lệ giải phóng thuốc ra các màng CVK ở các độ dày khác nhau trong
cùng 24 giờ tại pH=6,8 ..........................................................................................27
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................................30
TÀI LIỆU THAM KHẢO

cm và 0,5 cm trong môi trường chuẩn có pH và thời gian khác nhau (n=3) ...........21
Bảng 3.4. Mật độ quang phổ khi tiến hành giải phóng thuốc trong môi trường nước
dừa già pH khác nhau tại các thời điểm khác nhau (n = 3) .....................................23
Bảng 3.5. Tỉ lệ (%) giải phóng thuốc Neomycin Sulfate từ màng CVK ở độ dày 0,3
cm và 0,5 cm trong môi trường nước dừa già có pH và thời gian khác nhau (n=3) 24
Bảng 3.6. Mật độ quang phổ khi tiến hành giải phóng thuốc trong môi trường nước
vo gạo pH khác nhau tại các thời điểm khác nhau (n = 3) ......................................25
Bảng 3.7. Tỉ lệ (%) giải phóng thuốc Neomycin Sulfate từ màng CVK ở độ dày 0,3
cm và 0,5 cm trong môi trường nước vo gạo có pH và thời gian khác nhau (n=3)..26
Bảng 3.8. Tỷ lệ (%) giải phóng thuốc từ các màng CVK dày 0,3 cm và 0,5 cm trong
cùng 24 giờ tại pH = 6,8 ........................................................................................27


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài

1


Neomycin là một kháng sinh aminoglycoside được tìm thấy trong nhiều loại
thuốc bôi tại chỗ như kem, thuốc mỡ và thuốc nhỏ mắt. Chúng được tìm thấy trong
phòng thí nghiệm của nhà khoa học Selman Waksman vào năm 1945 . Neomycin
thuộc nhóm kháng sinh aminoglycoside chứa hai hoặc nhiều đường amino liên kết
với nhau bằng liên kết glycosidic [1].
Thuốc Neomycin thường được dùng dưới dạng thuốc bôi (Neosporin). Khi
neomycin kết hợp với thuốc khác có thể được dùng để uống. Neomycin không được
hấp thụ qua đường tiêu hóa và được sử dụng dự phòng cho bệnh não gan và tăng
cholesterol máu. Bằng cách tiêu diệt vi khuẩn trong đường ruột, kháng sinh này giúp
giữ mức amoniac thấp và ngăn ngừa bệnh não gan. Chúng hoạt động để tiêu diệt vi
khuẩn kháng streptomycin, kể cả trong trường hợp các vi khuẩn lao. Thuốc này cũng

Gluconacetobacter xylinus trong một số môi trường”.

2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu quy trình chế tạo màng.
- Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc của vật liệu Cellulose nạp Neomycin
sufate tạo ra từ Gluconacetobacter xilinus nuôi trong một số môi trường.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng: “So sánh khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp
neomycin sulfate tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus trong một số môi trường.”
- Vật liệu nghiên cứu: Màng CVK từ môi trường chuẩn, nước dừa già, nước vo
gạo.
- Phạm vi nghiên cứu: Phòng Thí nghiệm Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng
Trường ĐHSP Hà Nội 2.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tạo màng CVK từ một số môi trường: môi trường chuẩn, nước dừa già, nước vo
gạo.
- Thiết kế hệ thống giải phóng thuốc qua màng CVK.
- Khảo sát, đánh giá khả năng giải phóng thuốc Neomycin sufate từ màng CVK đã
nạp thuốc trong môi trường pH khác nhau.

3


5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
- Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK.
- Mong muốn khắc phục được một số tác dụng phụ của thuốc neomycin sulfate
trong chữa bệnh, nâng cao tối đa hiệu quả của thuốc mà tiết kiệm được chi phí
- Bên cạnh đó ta cũng có thể tìm ra được những ưu nhược điểm của
màng CVK để từ đó có những hướng nghiên cứu làm tăng các đặc tính cả

Bộ phụ: Pseudomonadieae

•

Họ: Pseudomonadaceae

1.1.2. Đặc điểm vi khuẩn G.xylinus
G.xylinus có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang khoảng 0,60,8 µm, dài khoảng 2-3 µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm, không di động,
sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào già hay do điều kiện môi
trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào dài hơn, phình to ra, phân nhánh
hoặc không phân nhánh[9].
Trong môi trường nuôi cấy rắn, sau khoảng từ 3 – 7 ngày nuôi cấy, sẽ thu
được khuẩn lạc nhỏ rồi lớn dần, đường kính hạt từ 2 – 5 mm, tròn, rìa mép trơn, có
màu kem, hơi trong. Nhưng sau một tuần khuẩn lạc to, đục, có màu cafe sữa rồi khô
dần.
1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn G. xylinus
G.xylinus là loài vi khuẩn hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn phát triển
từ 25 – 300C. Ở nhiệt độ 370C tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn. Nhiệt độ thích hợp
nhất là 250 C. Vi khuẩn tăng trưởng trong khoảng pH từ 3- 8, pH tối ưu để sản xuất
cellulose là 5,5.
G.xylinus sử dụng cacbon từ nhiều loại đường khác nhau, tùy thuộc vào
chủng mà lượng đường có thể thay đổi, nhưng đường hay được sử dụng và cho
hiệu suất cao là: glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đường cho hiệu suất thấp
hơn là glycerol, galactose, sucrose, maltose [8,9].
4


Khi nuôi cấy, để tránh nhiễm các loài vi khuẩn lạ, người ta thường bổ sung
acid acetic vào môi trường.
Trong môi trường nuôi cấy lỏng, vi khuẩn sử dụng đường để chuyển hóa


5g

Acid citric

1,5 g

Acid acetic

2%

Nước cất 2 lần

1000 ml

Dịch giống

10%

5


Bảng 1.2: Thành phần môi trường nước vo gạo
Thành phần

Khối lượng

Glucose

20 g


Diamoni photphat

0,3 g

Amoni sulfat

0,5 g

Nước dừa già

1000 ml

1.2. Neomycin Sulfate
Tên quốc tế: Neomycin Sulfate
Loại thuốc: Là dạng muối sulfat của neomycin, một kháng sinh nhóm aminoglycoside
Công thức hóa học: C23H46N6O13.XH2SO4

Neomycin là một kháng sinh aminoglycoside được tìm thấy trong nhiều loại
6


thuốc bôi tại chỗ như kem, thuốc mỡ và thuốc nhỏ mắt. Neomycin được phát hiện từ
năm 1949. Chúng được tìm thấy trong phòng thí nghiệm của nhà khoa học Selman
Waksman. Neomycin thuộc nhóm kháng sinh aminoglycoside có chứa hai hoặc
nhiều đường amino liên kết với nhau bằng liên kết glycosidic [11].
Neomycin thường được sử dụng như dưới dạng thuốc bôi tại chỗ, chẳng hạn
như Neosporin. Chúng cũng có thể được uống, nếu dùng theo cách này thì neomycin
thường được kết hợp với các thuốc kháng sinh khác. Neomycin không được hấp thụ
qua đường tiêu hóa và được sử dụng như một biện pháp dự phòng cho bệnh não gan

trường khác nhau [13].
Tại Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Văn Thanh cùng nhóm
nghiên cứu đã thành công với đề tài “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ
Acetobacter xylinum” [14].
Mong muốn khắc phục được một số tác dụng phụ của thuốc neomycin sulfate
trong chữa bệnh, nâng cao tối đa hiệu quả của thuốc mà tiết kiệm được chi phí. Màng
CVK có thể tự sản xuất trong nước từ những nguồn nguyên liệu dễ kiếm và giá thành
thấp, có những đặc tính phù hợp trong việc thiết kế, chế tạo hệ thống hấp thụ thuốc
neomycin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn.
Neomycin sulfate có trong danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam ban hành lần
thứ 4 năm 1999. Neomycin sulfate được bào chế dạng kem, dung dịch pha chế với
một sô hoạt chất khác. Tuy nhiên hướng nghiên cứu sử dụng màng CVK để hấp thuốc
Neomycin thì chưa có công trình nào nghiên cứu [14].
1.3.2. Tình hình trên thế giới
Trên thế giới đã có rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng màng CVK trong
nhiều các lĩnh vực khác nhau như: lĩnh vực thực phẩm (màng bảo quản trái cây, chất
ổn định thực phẩm,...) lĩnh vực y học (tạo ruột giả, màng trị bỏng, mạch máu nhân
tạo trong điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da,...).

8


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc của vật liệu Cellulose nạp
Neomycin sufate tạo ra từ Gluconacetobacter xilinus nuôi trong một số môi trường.
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất




-

Buồng cấy vô trùng (Haraeus)

-

Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức)

-

Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức)

-

Máy nước cất 2 lần (Hamilton - Anh)

-

Bể ổn nhiệt (Đức)

Dụng cụ:
-

Bình định mức 10 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml

-

Pipet 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml



30 g

Pepton

5g

10 g

10 g

2.7 g

0.3 g

0.3 g

0.5 g

0.5 g

Thành phần

Disodium phosphate
Amoni sulfat
Cao nấm men
Acid citric
Nước cất 2 lần

5g

-

Bước 5: Bịt miệng lọ bằng gạc vô trùng sau đó ủ tĩnh trong khoảng 6 – 8 ngày
ở 260C.
10


-

Bước 6: Thu màng CVK thô và rửa sạch dưới vòi nước.
Chọn màng CVK có độ dày từ 0,3 - 0,5 cm làm hấp thụ và giải phóng thuốc.

2.2.1.2. Tạo màng CVK tinh chế
- Sau khi màng được ủ tĩnh ở 26°C trong 6 - 14 ngày, đem màng CVK nhúng
vào nước cất 2 ngày, sau đó lấy màng CVK đem tinh chế bằng cách rửa nhiều lần
theo quy trình ở HÌNH 2.1:

Tách màng CVK thô
Ép loại nước
Ngâm trong NaOH 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong nước
48 giờ, kiểm tra tạp chất
Thu CVK tinh chế
Hình 2.1. Quy trình nuôi cấy thu nhận CVK
Trong màng CVK chứa một lượng lớn vi khuẩn, vì vậy, ta ngâm màng trong
NaOH 3% giúp phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố tế bào vi khuẩn.
Sau khi ngâm màng trong NaOH ta rửa nước rồi ép màng. Sau đó để trung hòa

g
c m 0.015
ố ( 0.01
u
th 0.005
ộ
đ
0
g
n
0
ồ
N

y = 0.1574x - 0.0027
R² = 0.9995

O
D277nm
Linear (OD277nm)

0.1

0.2

0.3

0.4

Mật độ hấp thụ OD 277nm

Q
Trong đó: EE - Phần trăm thuốc nạp vào màng.
2.2.5. Phương pháp pha môi trường đệm PBS
pH được dung trong đề tài gồm: pH=2, pH = 4,5, pH=6,8.
Nghiên cứu sự giải phóng từ chế phẩm trong 3 môi
trường (dung dịch đệm) với pH tương ứng :
Bảng 2.2. Môi trường đệm với pH=2; pH=4,5; pH=6,8
Hóa chất

Cách pha

Thành phần

Khối lượng

NaCl

0,8 g

KCl

0,2 g

Lấy hóa chất cho vào cốc đong. Sau đó
thêm nước cất đến 800 ml.
Dùng HCl điều chỉnh đến môi trường
đệm cần sử dụng pH=2; pH=4,5;
pH=6,8.

Na2HPO4.12H2O

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện 3 lần sau đó ta lấy giá trị trung bình. Tỷ lệ giải
phóng thuốc được tính theo công thức [20]:

���(%) =

೔೔೔೔೔೔
×೔ ା೔∑೔೔೔
೔ ೔

೔೔ ×೔೔

೔

× 100%

(3)

Trong đó:
Ct: nồng độ của NS trong môi trường đệm tại thời điểm t;
V1: Thể tích của dung dịch đệm tại các giá trị pH khác nhau;
n: Số lượng mẫu lấy ra từ dung dịch giải phóng;
V2: Lượng dung dịch đệm thêm vào;
m: khối lượng thuốc hấp thu vào màng CVK.

14


2.2.7. Phương pháp xử lí thống kê
Sử dụng Excel phân tích thống kê sự khác biệt trong các tính chất xác định của
nhóm. Kết quả nghiên cứu được trình bày dạng “số trung bình ± SD”. Những khác