TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

CAO THỊ MAI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP
NEOMYCIN SUFATE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XILINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI - 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

CAO THỊ MAI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP
NEOMYCIN SUFATE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XILINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

LỜI CAM ĐOAN
Tôi: Cao Thị Mai xin cam đoan về tính trung thực của đề tài:
Thứ nhất: Đề tài “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu
cellulose nạp Neomycin sufate tạo ra từ Gluconacetobacter xilinus nuôi cấy
trong môi trường nước vo gạo” là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới
sự chỉ đạo hướng dẫn trực tiếp của ThS. Hà Thị Minh Tâm.
Thứ hai: Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa
từng công bố ở đâu.
Thứ ba: Chắc chắn đề tài của tôi không trùng với một đề tài nào khác.
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Cao Thị Mai


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
VLC

Vật liệu Cellulose

ThS

Thạc sĩ

OD

Mật độ quang phổ

PC


1.3.2. Tại Việt Nam......................................................................................... 11
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 12
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 12
2.2. Máy móc, thiết bị nghiên cứu .................................................................. 12
2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 13


2.3.1. Bố trí thí nghiệm ................................................................................... 13
2.3.2. Chuẩn bị VLC ....................................................................................... 13
2.3.3.Đánh giá độ tinh khiết của màng ........................................................... 14
2.3.4. Phương pháp dựng đường chuẩn .......................................................... 15
2.3.5. Phương pháp chế tạo VLC nạp Neomycin sulfate................................ 16
2.3.6. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng của VLC đã nạp thuốc
Neomycin sulfate............................................................................................. 18
2.3.7. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả................................................ 19
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................... 20
3.1. Kết quả tạo VLC từ môi trường nước vo gạo .......................................... 20
3.2. Tinh chế VLC........................................................................................... 21
3.3. Xác định lượng thuốc Neomycin sulfate nạp vào VLC........................... 21
3.4. Xác định lượng thuốc Neomycin sulfate giải phóng ra khỏi VLC .......... 22
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men tạo VLC ..................................... 13
Bảng 2.2. Mật độ quang (OD) trung bình của dung dịch Neomycin sulfate ở
các nồng độ khác nhau ở bước sóng 277nm................................... 15
Bảng 2.3. Môi trường đệm PBS (pH = 7,4) .................................................... 17

Neomycin được sử dụng để giảm nguy cơ nhi m trùng trong quá trình
phẫu thuật đường ruột của bạn, Neomycin cũng được sử dụng để giảm các
triệu chứng hôn mê gan. Trong việc sử dụng không cần thiết hoặc lạm dụng
bất kì một loại kháng sinh nào có thể dẫn đến làm giảm hiệu quả thuốc.
Neomycin cũng có thể được sử dụng cùng với chế độ ăn uống đặc biệt
để điều trị một vấn đề nghiêm trọng nhất định về não. Tình trạng này được
gây ra bởi quá nhiều chất tự nhiên (amoniac). Thông thường, gan được loại bỏ
amoniac, nhưng bệnh gan có thể gây ra quá nhiều amoniac tích tụ trong cơ
thể. Thuốc này giúp điều trị bệnh não bằng cách tiêu diệt một số vi khuẩn
đường ruột tạo ra amoniac. Quá trình sử dụng Neomycin sulfate có tác dụng
làm giảm bớt nguy cơ nhi m trùng sau khi phẫu thuật đường ruột. Nó cũng đã
được sử dụng để điều trị phát triển quá mức vi khuẩn đường ruột nhỏ,
Neomycin cực kỳ độc với thận (gây ra tổn thương thận), ngay cả khi so sánh
với các Aminoglycosid khác. Trường hợp ngoại lệ là số lượng Neomycin rất
nhỏ nó như một chất bảo quản trong một số vắc-xin thường là 25 μg mỗi liều.
Neomycin sulfate là một tác nhân kháng khuẩn hữu ích để điều chị vết
thương. Tuy nhiên, một số nhược điểm do kem Neomycin sulfate gây ra làm
ảnh hưởng đến phương pháp điều trị như khả năng thảm thấu qua da đạt
không cao 45%, nhanh bị khô bề mặt trên da….[ ].
Vật liệu Cellulose (VLC) là sản phẩm của một số loài vi khuẩn, đặc
biệt là chủng Gluconacetobacter xylinus. Mặc dù có chung công thức phân tử
(C6H10O5) n với cellulose thực vật (PC), VLC không có lignin, hemiaelluloses
và pectin, thường có trong cellulose có nguồn gốc thực vật; do đó thanh lọc
VLC là một quá trình d dàng, năng lượng thấp trong khi thanh lọc PC

1


thường đòi hỏi các hóa chất khắc nghiệt. Các đặc tính độc đáo khác của VLC
là mức độ trùng hợp cao hơn và tính chất bền kéo đáng chú do cấu trúc



môi trường nước vo gạo từ các độ dày màng khác nhau trong môi trường pH
khác nhau mô phỏng đường tiêu hóa.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Nghiên cứu sự giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp thuốc
neomycin sulfate tạo ra từ Gluconacetobacte xilinus lên men từ môi trường
nước vo gạo và viên thuốc thương mại (đối chứng) trong các môi trường giải
phóng thuốc mô phỏng theo đường dạ dày – ruột khác nhau.
- Nghiên cứu sự xuyên thấm và quá trình giải phóng qua màng thẩm
tích của vật liệu cellulose nạp thuốc neomycin sulfate tạo ra từ
Gluconacetobacte xilinus lên men từ môi trường nước vo gạo và viên thuốc
thương mại (đối chứng) trong các môi trường giải phóng thuốc mô phỏng
theo đường dạ dày – ruột khác nhau.
- Nghiên cứu động học giải phóng thuốc từ các loại VLC nạp thuốc.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Khả năng giải phóng thuốc của vật liệu
cellulose nạp thuốc neomycin sulfate tạo ra từ Gluconacetobacte xilinus lên
men từ môi trường nước vo gạo.
- Phạm vi nghiên cứu: trên quy mô phòng thí nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: Viện nghiên cứu khoa học và Ứng dụng Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
5.

ngh a khoa học và ý ngh a th c ti n

5.1. Ý nghĩa khoa học:
- Nghiên cứu về VLC tìm ra được môi trường tạo ra VLC có khả năng
giải phóng kéo dài.
- Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của VLC.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn:

vì khả năng tạo ra một lượng VLC tương đối lớn từ nhiều nguồn carbon và
nitơ trong nuôi cấy lỏng và đã trở thành chủng phổ biến nhất để sản xuất các
vật liệu khác nhau, bao gồm giấy, bao bì thực phẩm, vật liệu y tế và nuôi cấy
tế bào. Rất khó để có được năng suất cao bằng Gluconacetobacter xylinus
trong một hệ thống lên men quy mô lớn do năng suất thấp của nó trong môi
trường nuôi cấy khuấy trộn. Tuy nhiên, VLC do Gluconacetobacter xylinus
tiết ra có các đặc tính độc đáo bao gồm chất lượng cao về độ bền cơ học, khả
năng giữ nước, độ kết tinh, khả năng phân hủy sinh học và khả năng tương
thích sinh học.
VLC có cấu tạo từ những chuỗi polyme β-1,4-glucopyranose không
phân nhánh, chủng Gluconacetobacter xylinus là sản phẩm của một số loài vi
khuẩn. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của VLC
giống cellulose của thực vật (plant cellulose - PC), tuy nhiên chúng khác nhau
về cấu trúc đại thể [13, 19].
Theo nghiên cứu AJ. Brown (1886) cho biết VLC có đường kính 1,5nm
gồm nhiều sợi siêu nhỏ kết hợp với nhau thành bó có bản chất là
hemicellulose. Nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng
khoảng 3 – 8nm.
Có hai cách tiếp cận chính để tổng hợp VLC bằng cách sử dụng vi sinh
vật: (i) nuôi cấy tĩnh, dẫn đến sự phát triển của một hạt VLC trắng dày đặc ở
giao diện chất lỏng không khí; và (ii) nuôi cấy động, trong đó cellulose được
sản xuất theo quy trình phân tán trong môi trường nuôi cấy, tạo ra các viên bất
thường hoặc các vi sợi lơ lửng. Việc lựa chọn phương pháp (nghĩa là nuôi cấy

5


tĩnh hoặc động) phụ thuộc vào ứng dụng cuối cùng của VLC vì các đặc tính
vật l , hình thái và cơ học của VLC tổng hợp khác nhau dựa trên quá trình
canh tác. Ví dụ, cellulose thu được thông qua phương pháp nuôi cấy động có


Những kết quả ứng dụng trên đã chứng minh rằng VLC có khả năng
giúp vết thương mau lành và ngăn không nhi m trùng [3]. Nó được ứng dụng
để sản xuất màng băng vết thương, sử dụng trong phẫu thuật, ghép mô, cơ
quan [2].
1.2. Tổng quan v thuốc Neomycin sulfate
1.2.1. Neomycin sulfate
- Tên thông thường: Neomycin
- Tên IUPAC: (2R,3S,4R,5R,6R) – 5 – amino – 2 – (aminomethyl) – 6
– [(1R,2R,3S,4R,6S) – 4,6 – diamino – 2 – [(2S,3R,4S,5R) – 4 –
[(2R,3R,4R,5S,6S)– 3 – amino – 6 – (aminomethyl) – 4,5 – dihydroxyoxan –2
– yl] oxy – 3 – hydroxy – 5 – (hydroxymethyl) oxolan – 2 – yl]oxy – 3 –
hydroxycyclohexyl] oxyoxane – 3,4 – diol [10].
- Công thức phân tử: C23H46N6O13

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của neomycin [1]
- Khối lượng phân tử: 614.65g/mol
- Đầu tiên được phân lập từ Streptomyces fradiae và Streptomyces
albogriseus năm 949 (NBRC 2773). Neomycin là một hỗn hợp của
neomycin B (framycetin); và thuốc epomer neomycin C, thành phần sau

7


chiếm khoảng 5–15% hỗn hợp. Nó là một hợp chất cơ bản hoạt động tích cực
nhất với phản ứng kiềm. Nó có khả năng chịu nhiệt hòa tan trong nước trong
khi không tan trong dung môi hữu cơ. Neomycin có hoạt tính tốt chống lại vi
khuẩn Gram dương và Gram âm, nhưng rất độc. Do đó, việc sử dụng nó bị
hạn chế trong việc điều trị nhi m trùng đường ruột [1].
- Một gen Neomycin sufate thường được bao gồm trong DNA plasmid

ở tai, mắt, da hoặc dùng uống để sát khuẩn đường tiêu hóa trước khi phẫu
thuật đặc biệt tắc nghẽn thần kinh cơ và liệt hô hấp đã được báo cáo sau khi sử
dụng neomycin đường uống. Cần xem xét khả năng xảy ra tắc nghẽn thần kinh
cơ và liệt hô hấp nếu dùng neomycin, đặc biệt là đối với bệnh nhân dùng thuốc
gây mê,
thuốc
ức
chế
thần
kinh
cơ
như
ubocurarine,
succinylcholine, decamethonium hoặc ở bệnh nhân truyền máu. Nếu tắc nghẽn
xảy ra, muối canxi có thể đảo ngược các hiện tượng này nhưng có thể cần hỗ
trợ hô hấp cơ học [2].
* Dược động học
- Neomycin hấp thu kém qua đường tiêu hóa, khoảng 97% liều uống
được bài tiết dưới dạng không đổi qua phân. Sau khi uống 3g, nồng độ đỉnh
huyết thanh đạt được khoảng 4 microgam/ml và khi thụt thuốc sự hấp thu
cũng tương tự. Trường hợp niêm mạc bị viêm hoặc tổn thương khả năng hấp
thu thuốc có thể tăng lên, thuốc sẽ thải trừ nhanh qua thận dưới dạng hoạt
tính. Nửa đời của thuốc khoảng 2 - 3 giờ.
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc Neomycin sulfate
* Chỉ định:
- Sử dụng tại chỗ bao gồm điều trị nhi m trùng mắt hời hợt do vi khuẩn
nhạy cảm (sử dụng kết hợp với các thuốc chống nhi m trùng khác), điều trị
viêm tai ngoài do vi khuẩn nhạy cảm, điều trị hoặc phòng ngừa nhi m trùng
do vi khuẩn ở da súc rửa để ngăn ngừa nhi m trùng tiểu và nhi m khuẩn que
gram âm ở bệnh nhân nhi m khuẩn bằng ống thông tiểu trong [1].

- Nhóm nghiên cứu của Blanchard C. (2015) [16] chỉ ra rằng do
neomycin sulfate ở dạng muối so với neomycin đơn thuần thì ít gây dị ứng
với cơ thể hơn nên cải thiện hoạt động kháng khuẩn.
- Alguacil J. và cs (2015) [10] cũng đưa ra nghiên cứu về khả năng
kháng khuẩn của các dạng thế hệ của neomycin.
- Amita H. và cs (2015) [10] đã tìm ra công thức chế tạo gel chứa
neomycin hướng điều trị viêm giác mạc mắt mục đích tăng thời gian cư trú và
cũng duy trì cơ chế giải phóng của thuốc tại mắt. Điều đó giúp tăng hiệu quả
giải phóng kéo dài tại chỗ của neomycin trong mắt.

10


1.3.2. Tại Việt Nam
Neomycin có trong danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam ban hành lần
thứ 4 năm 999 [1].
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng VLC bắt đầu từ những
năm 2000. Những nghiên cứu trong nước bước đầu đã thành công trong tuyển
chọn chủng có đặc tính quý, sản xuất thử nghiệm VLC và thử nghiệm ứng
dụng trong sản xuất bao bì, gạc và mặt nạ.
Neomycin mới chỉ được bào chế dạng kem, dung dịch pha chế với một
số hoạt chất khác. Trong đó hướng nghiên cứu sử dụng VLC để hấp thụ thuốc
neomycin thì chưa có công trình nào nghiên cứu.

11


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Neomycin (98%) được mua từ Trung Quốc.

- Thí nghiệm 2: Trong cùng một pH cho VLC có độ dày khác nhau đã
nạp Neomycin sulfate giải phóng thuốc rồi tính tốc độ giải phóng thuốc.
2.3.2. Chuẩn bị VLC
- Chuẩn bị VLC bởi chủng Gluconacetobacte xilinus ở môi trường
nuôi cấy được biểu thị ở bảng 2.1 [23]:

Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men tạo VLC

Thành phần

Khối lượng

Nước vo gạo

1000ml

C6H12O6

30g

(NH4)2HPO4

0.3g

(NH4)2SO4

0.5g

Pepton


Bình chứa HCl 3%
48h, rửa và ép
Ngâm trong nước
48h, kiểm tra tạp chất
Thu VLC tinh chế
Hình 2.1. Sơ đồ biểu di n quy trình nuôi cấy thu nhận VLC
2.3.3.Đánh giá độ tinh khiết của màng
2.3.3.1. Mục đích
Kiểm tra xem có sự có mặt của đường glucose trong VLC.
2.3.3.2. Nguyên tắc
Dùng thuốc thử Fehling để phát hiện sự có mặt của đường D – glucose,
nếu có thì sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
2.3.3.3. Tiến hành

14


- Bước 1: Dịch thử của VLC các loại sau khi đã xử lý hóa học.
Mẫu đối chứng là nước cất và dung dịch D – glucose.
- Bước 2: Mỗi ống nghiệm chứa 1 ml thuốc thử Fehling. Đun dưới
ngọn lửa đèn cồn 10 – 15 phút.
- Bước 3: Quan sát tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
2.3.4. Phương pháp dựng đường chuẩn
- Các nồng độ: 0,05 mg/ml; 0,1 mg/ml; 0,15 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,25
mg/ml; 0,3 mg/ml được pha từ Neomycin.
- Nguyên tắc: sử dụng máy đo quang phổ UV - Vis 2450 để đo các mẫu
dung dịch chuẩn (6 mẫu) ở bước sóng 277 nm.
- Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV - 2450 để đo cường độ quang
phổ của các dung dịch như trên ở bước sóng 277 nm trong các dung dịch mẫu
chuẩn [4].


0,0010

0,0020

0,0012

Sử dụng phần mềm Excel 2010 thiết kế đồ thị biểu di n và lập đường
chuẩn Neomycin sulfate, kết quả biểu thị như hình 2.1:

15


OD277nm
0,05

y = 0,1574x - 0,0027
R² = 0,9995

0,04
0,03

OD277nm

0,02

Linear (OD277nm)

0,01
0

100 ml dung dịch đệm PBS (pH=7,4)[7] chứa thuốc Neomycin sulfate 2
0

mg/ml và để rung động ở 180 vòng và 40 C trong 2 giờ, để vật liệu được hấp
thụ tối đa nhất [15].

16