a

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ LAN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP
BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI - 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ LAN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP
BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA TỪ


Nguyễn Thị Lan


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin khẳng định những gì viết trong khóa luận “ Nghiên cứu khả
năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Berberine hydrocloride tạo
ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước dừa già”
là kết qủa nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS. Cao
Bá Cường, giảng viên Khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
Tất cả những số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê,
đảm bảo tính chính xác và trung thực.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Thị Lan


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

G.A. xylinus: Gluconacetobacter xylinus
BH: Berberine hydrochloride
cs : Cộng sự


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 2

2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất........................................................................ 14
2.2. Thiết bị và dụng cụ................................................................................... 14
2.2.1. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu......................................... 14
2.2.2. Dụng cụ........................................................................................... 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 15
2.3.1. Phương pháp tạo màng BC ............................................................. 15
2.3.2. Phương pháp xử lý màng BC trước khi hấp thụ thuốc ................... 17
2.3.3. Phương pháp xây dựng đường chuẩn của BH ................................ 18
2.3.4. Phương pháp pha môi trường đệm PBS ( Phosphate buffered
saline)-....................................................................................................... 20
PBS 1X............................................................................................................ 20
Môi trường đệm được sử dụng trong đề tài bao gồm 3 môi trường với pH=2,
pH=6,8, pH=12.............................................................................................. 20
2.3.5. Phương pháp xác định lượng thuốc BH được hấp thụ vào màng... 20
2.3.6. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng từ màng Cellulose vi
khuẩn......................................................................................................... 21
2.3.7. Phương pháp xử lý thống kê ........................................................... 22
CHƯƠNG 3..................................................................................................... 23


KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 23
3.1. Màng BC được nuôi cấy từ môi trường nước dừa già............................. 23
3.3. Tinh chế màng CV.................................................................................... 24
3.4. Lượng thuốc hấp thụ vào màng CV ......................................................... 26
3.5. Xác định lượng thuốc BH giải phóng khỏi màng CV .............................. 26
1. Kết luận ....................................................................................................... 33
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 34



1. Lý do chọn đề tài

1


Berberine được chiết xuất từ cây vàng đằng (hay được gọi là cây hoàng
đắng, hoàng liên, có tên khoa học là Coptis teeta),… (đây là cây dây leo, thân
gỗ, phân nhánh, mọc hoang dại ở nhiều nơi). Một thành phần quan trọng trong
cây vàng đắng là alcaloid. Alcaloid là dẫn xuất của izoquinolein, chủ yếu là
berberine hydrocloride chiếm khoảng 2% [7]
Berberine hydrochloride (BH) có bản chất là một alkaloid thực vật nổi
tiếng, nó có lịch sử nổi tiếng được dùng trong ngành y học cổ truyền ở cả
Trung Quốc và Việt Nam . Berberine có tác dụng chống lại các loại vi khuẩn,
kí sinh trùng gây hại cho đường ruột, ảnh hưởng đến cơ thể gây nên các bệnh
về đường ruột. Nó được bào chế để điều trị các bệnh về tiêu hóa như tiêu
chảy, chống tăng và tính chất chống tiết. Gần đây, một số nhà khoa học cũng
đã nghiên cứu và chứng minh BH còn có tác dụng chống ung thư, chống HIV,
chống bệnh tiểu đường, đau mắt hột, giải lo âu và thuốc giảm đau, nấm da, trị
bỏng, …và một số tác dụng dược lí khác [6]
Berberine có một đặc điểm là không ảnh hưởng đến sự phát triển của vi
khuẩn có ích cho đường ruột, đây chính là một trong những ưu thế trong việc
điều trị các bệnh nhiễm trùng đường ruột. Các nhà khoa học cũng đã chứng
minh, khi dùng kết hợp các thuốc kháng sinh với berberine có thể hạn chế
được các tác dụng không mong muốn khi dùng thuốc kháng sinh với hệ vi
sinh đường ruột [8]
Berberine được cho là một trong những loại thuốc rất ít khi gây dị ứng
cho người sử dụng, rất lành tính và an toàn. Berberine được chống chỉ định
dùng đối với phụ nữ mang thai vì có thể sẽ gây co bóp tử cung, điều này sẽ
ảnh hưởng nghiêm trọng đến thai nhi và với những người quá mẫn cảm với
các thành phần của thuốc [7]

2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu , chế tạo màng cellulose vi khuẩn từ chủng Gluconacetobacter
xylinus.
- Thiết kế, hệ thống hấp thụ và nghiên cứu sự giải phóng thuốc là tốt nhất.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Nghiên cứu sự giải phóng thuốc của vật liệu
cellulose nạp berberine hydrochloride tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi
cấy trong môi trường nước dừa.
Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện tại quy mô phòng thí
nghiệm.

3


Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm “Sinh lý học người và động vật”
khoa Sinh- KTNN, Viện Nghiên cứu khoa học và Ứng dụng Trường Đại học
Sư phạm Hà Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu nhằm tăng thêm hiểu biết và ứng dụng của
màng Cellulose vi khuẩn. Mở ra một hướng đi mới trong việc nghiên cứu các
hạn chế cũng như khắc phục của thuốc Berberine và còn có thể nghiên cứu
trên các loại thuốc khác giúp cho ngành y học ngày càng phát triển.
Đồng thời tìm và phát hiện ra các ưu nhược điểm của màng Cellulose vi
khuẩn để có hướng nghiên cứu giúp tăng đặc tính của màng, hạn chế các đặc
tính không tốt của màng ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau.
- Ý nghĩa thực tiễn
+ Định hướng khắc phục những nhược điểm của thuốc Berberine thông
thường:
tăng tác dụng của thuốc, rút ngắn thời gian điều trị cho bệnh nhân...
+ Từ việc tạo ra màng Cellulose vi khuẩn dùng làm hệ thống khắc phục các

Gluconacetobacter xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, thuộc chi
Acetobacter. Đây là nhóm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất
cellulose ngoại bào [1].
Theo khóa phân loại của Bergey, Gluconacetobacter xylinus thuộc:
- Lớp: Schizomycetes
- Bộ: Pseudomonadales
- Bộ phụ: Pseudomonadieae
- Họ: Pseudomonadaceae
Gluconacetobacter xylinus có nhiều hình dạng khác nhau như: hình que, hình
hơi cong, thẳng, theo chiều ngang nó có kích thước khoảng 2-3 μm, đây là vi
khuẩn gram âm, không có khả năng di chuyển, không sinh bào tử, xếp đơn lẻ
nhưng đôi khi nếu có sự thay đổi của môi trường nó có thể thành chuỗi, phân
nhánh hoặc không phân nhánh [1].
1.1.2. Cấu trúc của Cellulose vi khuẩn
Cellulose vi khuẩn được nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan, nó là một
chuỗi polymer. Các vi khuẩn tổng hợp chuỗi Glucan lại thành các sợi thứ cấp,
rộng khoảng 1,5nm. Các sợi thứ cấp này là các sợi tự nhiên, mảnh hơn các sợi
sơ cấp trong thượng tầng của một số loại thực vật. Các sợi thứ cấp kết lại tạo
thành vi sợi, vi sợi lại kết lại tạo thành các bó sợi, các bó sợi lại tạo thành các
dải. Dải có chiều dày 3-4 nm, và có chiều dài 130-177 nm (Yamanaka et al,

5


2000). Các dải siêu mịn, có dạng các mắt lưới, được giữ ổn định nhờ các liên
kết có chiều dài từ 1µm-9µm, được gọi là lớp màng film (Bielecki at al,
2001).
Màng Cellulose vi khuẩn được tạo ra do gluconacetobacter xylinus khác
nhau về cấu trúc đồng thể nhưng lại có cấu trúc hóa học đồng nhất [2].
1.1.3. Đặc tính của màng Cellulose vi khuẩn tạo bởi Gluconacetobacter

Màng cellulose vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt nên tính bền cơ tốt,
trọng
lượng nhẹ.
-

Tổng hợp màng cellulose vi khuẩn không cần qua các bước trung gian,

vì vậy trong sản xuất các sản phẩm từ cellulose vi khuẩn ta sản xuất một cách
trực tiếp. Cellulose có thể được tổng hợp dưới dạng màng mỏng hoặc dưới
dạng các sợi chỉ cực nhỏ
1.1.4. Môi trường nuôi cấy Gluconacetobacter xylinus
Có thể nuôi cấy gluconacetobacrer Xylinus từ các môi trường dinh dưỡng
khác nhau như nguồn cacbon, nguồn sulfur và phospho, cùng các yếu tố tăng
trưởng và các yếu tố vi lượng khác [3].
6


Môi trường nước dừa già rất thích hợp trong việc nuôi cấy vi khuẩn vì trong
nước dừa già có nhiều thành phần chất dinh dưỡng và chất kích thích tăng
trưởng như 1,3 – diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol, …
Vì vậy gluconacetobacter xylinus rất thích hợp phát triển trong môi trường
nước dừa già [1].
Nước dừa lấy ra sau thu hoạch không để quá 3 ngày, vì nếu để lâu sẽ làm cho
lượng đường và các chất dinh dưỡng trong đó giảm đi đáng kể [1].
Thành phần của nước dừa già [1] được trình bày trong bảng 1.1
Nước (%)
Protein (%)
Chất béo toàn phần (%)

94,99 Đồng (mg/100g)


Magie (mg/100g)

25 Acid

Panthenic

0,08
(mg/100g)

0,043
Phosphorus (mg/100g)

20 Vitamin

B6

(mg/100g)

0,032
Kali (mg/100g)

250 Folate (µg/100g)

Natri (mg/100g)

105

Kẽm (mg/100g)


để lên men [3, 31].1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng Cellulose vi
trên thế giới và tại Việt Nam
1.2.1. Trên thế giới
Nhiều nước trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu về màng Cellulose vi khuẩn
và những ứng dụng của nó thuộc chủng Gluconacetobacter xylinus. Năm
2011, Wei B và cs đã tiến hành nghiên cứu và chỉ ra rằng màng Cellulose vi
khuẩn khô thu được sau khi ngâm Benzzalkonium chloride, trên mỗi đơn vị bề
mặt có
8


thể giải phóng thuốc là 0,116 kg/cm2 và có thể kéo dài tác dụng đến 24 giờ
chống lại hoạt động của S.Aureus và B. Subtilis [11]
Năm 1989, Brown đã phân tách màng Cellulose vi khuẩn để làm môi trường
trong quá trình lọc nước, dùng làm chất mang cho pin, và cung cấp năng
lượng cho tế bào [7]
Màng Cellulose vi khuẩn có nhiều tính chất đặc biệt như: tính thấm
nước cao, có thể kết dính và tính trơ hóa học nên màng Cellulose vi khuẩn
được coi như một màng sinh học. Trong y học người ta đã nghiên cứu và ứng
dụng màng sinh học để làm da nhân tạo thay thế cho da người như ở Brazil.
Trên thế giới các ngành dược phẩm và làm đẹp ứng dụng nhiều tác dụng của
màng Cellulose vi khuẩn. Các tác giả: Hamlyn và cs (1997), Cienchansk
(2004), Legeza và cs (2004), Wan và Milon (2005), Czaja và cs (2006) đã tiến
hành áp dụng vào thực tiễn khi dùng màng Cellulose vi khuẩn đặt lên các vết
thương hở, các vết loét, bỏng liên quan về da và đã đạt được kết quả tốt. Một
số tác giả đã đăng kí quyền sử dụng về việc sử dụng màng này trong điều trị
cho bệnh nhân( điều trị bỏng) như nhà khoa học người Canada. Các tác giả
Jonas và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã ứng dụng màng Cellulose vi
khuẩn để làm da thay thế da thật cho bệnh nhân hay ứng dụng làm các sản
phẩm làm đẹp cho con người [9]. Năm 2012 Luan J.và Cs [12] đã dùng màng

- a) anthracen clorid dihydrat.
- Công thức hóa học: C20H18NO4Cl.2H2O
- Khối lượng phân tử: 372

10


11


Hình 1.1: Công thức cấu tạo của BH
1.3.1.2. Nguồn gốc
BH có ở các bộ phận của cây như: rễ, thân rễ, thân, vỏ cây những cây thuộc
chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis, BH có nhiều trong thân và
rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5 - 3%, trong đó berberine chiếm 82% so với
alcaloid toàn phần.
BH không tinh khiết mà có lẫn alcaloid như: palmatin, jatrorrhizin. Các tạp
chất palmatin không quá 2%, jatrorrhzin không quá 5%.
1.3.1.3. Tính chất vật lý
Berberine thường tồn tại ở hai dạng: tinh thể hay bột kết tinh, 2 dạng này đều
có màu vàng, không vùi và có vị đắng. Ở dạng bazơ nó tan chảy ở 1450C, ở
dạng này nó tan không nhanh trong nước, có thể tan trong ethanol và tan ít
trong nước. Ở dạng muối clorid tan ở tỷ lệ 1/400 trong nước, tan tốt trong
nước sôi và ethanol, nhưng lại không tan trong cloroform và ether. Dạng muối
Sulfat dễ tan trong nước và ethanol [13].

12


1.3.1.4. Tính chất hóa học

Trên thế giới người ta đã tiến hành một số công trình nghiên cứu và đạt được
hiệu quả tốt như: Lin Huang, Xiuli Chen, Thanh Nguyen Xuan, Huiru Tang,
Liming Zhang [15] đã nghiên cứu tạo ra Chitosan tráng (bọc) nano-liposome
cho việc phân phối uống berberine hydrochloride. Kết quả cho thấy chitosan
bọc nano-liposome đạt kết quả tốt hơn so với không tráng cho việc cung cấp
bằng miệng của BH.
Berberine có tính an toàn và có kết quả tốt trong việc điều trị bệnh tiểu đường
loại II cho bệnh nhân đã được Huilixing và Jianping Ye xác định [16].
Tác dụng của Berberine về bệnh tiểu đường một lần nữa được Ryan Bradley
tiến hành nghiên cứu thành công [31].
Màng CV kiểm soát invitro thuốc berberine gần đây đã được Lin Huang
nghiên cứu, nó không chỉ thẩm thấu qua da mà sự giải phóng Berberine còn
được thí nghiệm trên dạ dày và ruột. Kết quả thu được Berberine giải phóng
với tốc độ chậm.
1.4.2. Ở Việt Nam
Việt Nam cũng có một số tác giả nghiên cứu về thuốc Berberine
hydrochloride:
- Năm 2010 các tác giả Vũ Bình Dương, Nguyễn Trọng Diệp, Nguyễn Thị
Thùy, Hoàng Văn Lương đã nghiên cứu và bào chế Berberine ở dạng viên nén
100mg giải phóng ở đích đại tràng theo cơ chế phân giải hệ vi sinh vật [5].
- Trong cây thuốc Việt Nam một thành phần quan trọng là alkaloid đã được
Phan Quốc Kinh nghiên cứu [6].
- Nguyễn Liêm - chiết xuất Berberine bằng áp lực nóng.
- Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm - góp phần nghiên cứu cải tiến quy trình
sản xuất Berberine từ cây vàng đắng [2].


- Hồ Đắc Trinh - bằng dung dịch acid sulfuric loãng đã chiết xuất Berberine
clorid trong cây vàng đắng [7].