TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

TRẦN THỊ ÁNH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP
NEOMYCIN SULFATE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI
CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG CHUẨN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

Hà Nội, 2019


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

TRẦN THỊ ÁNH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP
NEOMYCIN SULFATE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI
CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG CHUẨN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan khóa luận “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc
của vật liệu cellulose nạp Neomycin Sulfate tạo ra từ Gluconacetobacter
xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn” do chính tôi viết. Các số liệu
trong kết quả nghiên cứu là hoàn toàn khách quan, do chính tôi thực nghiệm
mà có được và không trùng lặp với các kết quả đã công bố. Những trích dẫn
từ các công bố trước đã có ghi chú rõ ràng.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Hà Nội,ngày 20 tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Trần Thị Ánh


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
STT

Tên viết tắt

Tên đầy đủ

1

CNM

Cao nấm men

2

2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 3
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................. 3
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn .......................................................... 3
NỘI DUNG....................................................................................................... 4
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4
1.1.Vật liệu cellulose (VLC) và vi sinh vật tổng hợp vật liệu cellulose ............ 4
1.1.1.Vật liệu cellulose (VLC) ........................................................................... 4
1.1.2. Vi sinh vật tổng hợp VLC ........................................................................ 6
1.1.3. Môi trường nuôi cấy G. xylinus ............................................................. 7
1.2. Tổng quan về thuốc Neomycin Sulfate (NS) ............................................. 9
1.2.1. Công thức cấu tạo ................................................................................... 9
1.2.2. Tính chất lý hóa ..................................................................................... 10
1.2.3. Dược lý và dược động học .................................................................... 10
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định.................................................................... 11
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .............................................. 12
1.3.1. Vật liệu cellulose (VLC) ........................................................................ 12
1.3.2. Thuốc Neomycin Sulfate ........................................................................ 13
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 14
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 14
2.1.1. Hóa chất và dung môi sử dụng trong nghiên cứu ................................. 14
2.1.2. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ....................................................... 14
2.1.3. Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo VLC .......................... 14


2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 14
2.2.1. Chuẩn bị VLC ........................................................................................ 14
2.2.2. Chế tạo VLC nạp thuốc NS .................................................................... 17
2.2.3. Xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống được thiết kế .... 19
2.2.4. Xử lý thống kê........................................................................................ 20
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 21

Hình 2.1. Quy trình tinh chế VLC .................................................................. 16
Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn của NS trong môi trường pH = 7,4 ..... 18
Hình 3.1. VLC thô lên men từ môi trường chuẩn ........................................... 21
Hình 3.2. VLC sau khi tinh chế ...................................................................... 22
Hình 3.3. Thí nghiệm kiểm tra sự hiện diện của protein trong màng ............. 22
Hình 3.4. Hiệu chỉnh pH ................................................................................. 23
Hình 3.5. Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 50 vòng/phút, nhiệt độ
37 ± 0,50C ........................................................................................................ 24
Hình 3.6. Các mẫu được rút ra để đo quang phổ ............................................ 24
Hình 3.7. Giá trị OD trung bình giải phóng thuốc NS của VLC .................... 25
Hình 3.8. Tỷ lệ giải phóng thuốc NS của VLC ............................................... 27


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Trong nhiều năm trở lại đây, các nhà nghiên cứu đã đặc biệt quan tâm
tới việc ứng dụng các vật liệu sinh học trong đời sống, nhất là trong chăm sóc
sức khỏe. Trong đó được quan tâm và chú trọng hơn cả đó là vật liệu cellulose
(VLC).
Vật liệu cellulose (VLC) là sản phẩm do vi khuẩn tổng hợp ra, ví dụ
như chủng Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus). Chúng gồm các phân tử
glucose liên kết với nhau bằng liên kết β - 1,4 glucorit (rất giống với cellulose
của thực vật), tuy nhiên, VLC không chứa các hợp chất cao phân tử như
peptin, hemicellulose, ligin và sáp nến. Vì thế, ngoài độ dẻo dai, bền chắc, độ
đàn hồi cao, khả năng chịu nhiệt tốt, chúng còn có những đặc tính vượt trội
như: độ tinh khiết cao, có khả năng hút nước cao ở trạng thái ẩm và có thể
phục hồi, tái chế hay phân hủy hoàn toàn. Trong y học, chúng được quan tâm
vì có bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ bình thường, không độc, không gây dị ứng
và đặc biệt là khả năng cản khuẩn [4, 6]. Ngoài ra VLC còn có tác dụng giữ
thuốc và kéo dài thời gian giải phóng thuốc. Do vậy, VLC được coi là một

để khảo sát sự giải phóng thuốc qua màng nhằm tăng khả năng và thời gian
giải phóng từ đó tăng sinh khả dụng của thuốc. Tôi quyết định chọn đề tài
nghiên cứu: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose
nạp Neomycin Sulfate tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong
môi trƣờng chuẩn”.

2


2. Mục đích nghiên cứu
- Tạo VLC lên men từ môi trường chuẩn nạp NS.
- Thiết kế hệ thống giải phóng thuốc của VLC nạp NS ở các độ dày
màng và pH môi trường khác nhau. Đánh giá khả năng giải phóng thuốc trong
các trường hợp đó rồi từ đó định hướng khả năng giải phóng thuốc trong cơ
thể.
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Hệ thống giải phóng thuốc của VLC nạp NS
tạo ra từ G. xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn.
-

Phạm vi nghiên cứu: Trong quy mô phòng thí nghiệm.

4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
* Ý nghĩa khoa học
- Tiếp tục nghiên cứu tiềm năng giải phóng thuốc tại chỗ của VLC.
Nghiên cứu sự giải phóng NS từ VLC nạp thuốc có thể khắc phục được hạn
chế của thuốc, tăng hiệu quả cho việc điều trị các bệnh lý.
- Đánh giá tiềm năng của VLC nạp NS để từ đó đề xuất hướng nghiên
cứu trên các loại thuốc khác.
* Ý nghĩa thực tiễn

1.1.1.2. Đặc tính của VLC
4


VLC xuất hiện thành một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường dinh
dưỡng lỏng. Khi được đem đi làm khô, chúng có dạng bản mỏng với độ dày
khoảng 0,01 – 0,5 nm giống như giấy da.
VLC còn có những đặc tính nổi trội như: Trọng lượng nhẹ với độ tinh
sạch cao, độ bền cơ học lớn (độ bền dai và chịu được lực kéo cao), có khả
năng chịu nhiệt tốt và khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm (60 - 700 lần
trọng lượng). Chúng còn có khả năng tương thích sinh học cao, có bề mặt tiếp
xúc lớn hơn gỗ thường, không độc, không gây dị ứng và đặc biệt là có khả
năng cản khuẩn.
1.1.1.3. Ứng dụng của VLC
VLC được ứng dụng rất nhiều trong đời sống [13], cụ thể như sau:
Bảng 1.1. Ứng dụng của VLC
Lĩnh vực
Thực phẩm

Ứng dụng
- Vỏ bao xúc xích, thịt nhân tạo
- Thạch dừa, kem, salad

Y dược

- Da nhân tạo, lớp màng trị bỏng
- Phẫu thuật ghép mô, cơ quan

Làm đẹp
Môi trường

G. xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Acetic. Là vi khuẩn có chu mao, hiếu
khí bắt buộc và sản xuất cellulose ngoại bào [8].
G. xylinus thuộc:


Lớp: Schizomycetes



Bộ: Pseudomonadales



Bộ phụ: Pseudomonadieae



Họ: Pseudomonadaceae



Chi: Acetobacter

1.1.2.2. Đặc điểm của vi khuẩn G. xylinus
G. xylinus thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, không di động và không sinh
bào tử.
G. xylinus có dạng hình que, kích thước ngang khoảng 0,6 - 0,8 µm, dài
khoảng 2 - 3 µm, thẳng hay hơi cong, sắp xếp riêng rẽ và đôi khi xếp thành
chuỗi. Khi điều kiện môi trường nuôi cấy thay đổi hoặc tế bào già thì hình
dạng của chúng có thể bị biến đổi: tế bào phình to ra, dài hơn, phân nhánh



Bảng 1.2. Thành phần của các môi trƣờng nuôi cấy thu VLC
Các loại môi trƣờng

Thành phần

MT1

MT2

MT3

Glucose

20 g

20 g

20 g

Pepton

5g

10 g

10 g

Diamoni photphat


Nước vo gạo

1000 ml

Sau đó, thêm dịch giống vào các môi trường tối thiểu 10% thể tích môi
trường. Sau đó, đo pH của môi trường và hiệu chỉnh đến khoảng 4 - 6.
Trong các môi trường trên, môi trường chuẩn (HS) được sử dụng nhiều
hơn cả.
Trong các thành phần trên, chúng ta cần lưu ý đến cao nấm men. Cao
nấm men (CNM) bao gồm các thành phần hòa tan của tế bào nấm men. CNM
được dùng như là nguồn dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy vi khuẩn [8].
Thành phần dinh dưỡng của CNM [18], được thể hiện ở Bảng 1.3.
Bảng 1.3. Thành phần dinh dƣỡng của cao nấm men
Giá trị dinh dƣỡng

100g

Calo

185 kcal

Lipid

0,9 g

Cholesterol

0g


Vitamin C

0 mg

Canxi

67 mg

Sắt

4 mg

Vitamin D

0 IU

Vitamin B6

0 mg

Vitamin B12

0,5µg

Magie

180 mg

1.2. Tổng quan về thuốc Neomycin Sulfate (NS)
Neomycin Sulfate là dạng muối sulfat của neomycin, một kháng sinh


10


lầm của mẫu mRNA và gây ra sự chuyển đổi khung hình, do đó, dẫn đến kết
thúc sớm. Cuối cùng, điều này dẫn đến tế bào vi khuẩn bị chết đi [22].
* Dược động học
NS được hấp thu kém qua đường tiêu hóa bình thường (3%). Phần nhỏ
hấp thu được phân phối nhanh chóng trong các mô và được đào thải qua thận
phù hợp với mức độ của chức năng thận. Phần không được hấp thụ của thuốc
(khoảng 97%) được loại bỏ trong phân.
Các nghiên cứu liên kết với protein đã chỉ ra rằng mức độ gắn kết với
protein aminoglycoside thấp và tùy thuộc vào các phương pháp được sử dụng
để thử nghiệm, điều này có thể nằm trong khoảng từ 0% đến 30%.
Sự tăng trưởng của hầu hết các vi khuẩn đường ruột bị ức chế nhanh
chóng sau khi uống NS và sự ức chế này kéo dài trong 48 - 72 giờ.
Sự giải phóng NS gắn mô xảy ra chậm trong khoảng thời gian vài tuần
sau khi ngừng dùng thuốc [21].
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định
* Chỉ định
NS được dùng tại chỗ để điều trị các nhiễm khuẩn ngoài da, tai và mắt
do tụ cầu và các vi khuẩn khác nhạy cảm [1].
Dùng uống để sát khuẩn đường ruột trước khi phẫu thuật, điều trị ỉa chảy
do E. Coli và hỗ trợ trong điều trị hôn mê gan do làm giảm vi khuẩn tạo NH3
trong ruột [2].
* Chống chỉ định
Mẫn cảm với neomycin hoặc với các aminoglycosid hay với bất cứ thành
phần nào trong chế phẩm.
Tắc ruột, viêm - loét đường tiêu hóa.
Trẻ em dưới 1 tuổi [21].

xylinum BNH2 có khả năng tổng hợp nên VLC bền, dai, thấu khí cao, hút
nước tốt và có sợi cellulose nhỏ thích hợp để dùng làm màng trị bỏng [6].

12


1.3.2. Thuốc Neomycin Sulfate
* Trên thế giới:
Selman A., Waksman (1949) lần đầu tiên phát hiện thấy NS khi nuôi
cấy nấm Streptomyces fradiae cùng với cơ chế sinh tổng hợp và khả năng
kháng khuẩn của thuốc [10].
Năm 1994 Pedersoli W.M. và cộng sự khi tiến hành tiêm NS cho bê
con Hà Lan đã nhận thấy tỷ lệ hấp thụ NS không cao và tỷ lệ đào thải qua
thận lớn nên có thể là nguyên nhân đầu độc thận [20].
Sau đó, Jong S.C. và cộng sự (2015) trong việc chữa trị cho chuột nhắt
mắc bệnh tiểu đường bị vết thương mô đã sử dụng NS nạp hydrogel cho thấy
NS nạp hydrogel có khả năng chữa lành vết thương cao hơn so với thuốc trên
thị trường do khả năng cản khuẩn và giải phóng của thuốc [17].
Bên cạnh đó Blanchard C. và nhóm nghiên cứu (2015) cũng chỉ ra rằng
neomycin ở dạng muối (ví dụ NS) ít gây dị ứng với cơ thể hơn nên NS đã
khắc phục được nhược điểm của neomycin đơn thuần [11].
Cũng vào năm 2015, Amita H. và cộng sự đã tìm ra hướng mới giúp
tăng cường sinh khả dụng và kéo dài thời gian giải phóng tại chỗ của NS
trong mắt qua việc tìm ra công thức chế tạo gel chứa NS điều trị viêm giác
mạc mắt [14].
* Tại Việt Nam
Năm 1999, danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam được ban hành lần thứ
4 trong đó bao gồm cả NS [1].
Hiện nay, NS có thể được bào chế ở dạng viên nén, dạng kem hay dung
dịch pha chế với hoạt chất khác. Việc sử dụng VLC để làm chất bọc ngoài và

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuẩn bị VLC
2.2.1.1. Tạo VLC thô
Tạo VLC bằng cách nuôi cấy vi khuẩn G. xylinus trong môi trường
chuẩn HS. Quá trình lên men thu VLC thô được thực hiện theo các bước

14


sau [8, 16]:
- Bước 1: Pha môi trường theo Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng chuẩn tạo VLC
Thành phần

Trọng lƣợng

Glucose

20 g

Peptone

5g

Cao nấm men

5g

Dinatri hidrophotphat (khan) (Na2HPO4)


* Kiểm tra độ tinh sạch của VLC
Nhằm đảm bảo VLC sau khi tinh chế đã loại bỏ được hết vi khuẩn và
độc tố của chúng hay chưa.
Kiểm tra sự hiện diện của protein trong VLC: Dùng thuốc thử là acid
triclor acetic (CCl3COOH), nếu có protein sẽ làm đục dung dịch trong ống
nghiệm.
Tiến hành:
- VLC tinh chế được đục nhỏ bằng khuôn, cho vào 2 ống nghiệm:
Ống 1 (ống đối chứng) chứa màng và 10 ml nước cất 2 lần, ống 2
(ống thí nghiệm) chứa 10 ml nước.
- Nhỏ vài giọt acid triclor acetic vào ống 2, lắc đều.
- Quan sát dung dịch trong ống nghiệm.

16