TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
-------------------------------------

TRẦN THỊ HƯỜNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT
LIỆU CELLULOSE NẠP DICLOFENAC NATRI TẠO TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI
TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành : Sinh lý học người và động vật

Hà Nội, 5/2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
-------------------------------------

TRẦN THỊ HƯỜNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC
CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP DICLOFENAC NATRI
TẠO TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành : Sinh lý học người và động vật


Trần Thị Hường


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận tốt nghiệp với đề tài:
“Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac
Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo
gạo” đều là sự thật, là kết quả nghiên cứu của cá nhân em, không sao chép,
không trùng lặp với bất kì đề tài nào. Trong quá trình viết luận văn tốt nghiệp
em có tham khảo, trích dẫn một số tài liệu có nguồn gốc rõ ràng, dưới sự
hướng dẫn của Th.S. Phạm Thị Kim Dung.
Nếu đề tài có vấn đề gì em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Hà Nội, Ngày 20 Tháng 05 Năm 2019
Sinh viên

Trần Thị Hường


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
1

G.xylium

Gluconacetobacter xylinus

2

OD


1.1. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu ....................................... 4
1.1.1. Tổng quan về vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus 4
1.1.2. Tổng quan về thuốc Diclofenac Natri.................................................. 5
1.1.2.1. Công thức hoá học .............................................................................. 5
1.1.2.2. Tính chất hóa lý .................................................................................. 5
1.1.2.3. Độ ổn định ........................................................................................... 5
1.1.2.4. Hấp thụ ................................................................................................ 6
1.1.2.5. Tác dụng và chỉ định .......................................................................... 6
1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ......................... 6
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................ 6
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ........................................................ 6
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
........................................................................................................................... 7
2.1. Đối tượng ................................................................................................... 7
2.1.1. Đối tượng................................................................................................ 7
2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu .................................................................. 7
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ................................................................................ 8


2.1.3.1. Thiết bị ................................................................................................ 8
2.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 9
2.3. Phương pháp nghiên cứu......................................................................... 9
2.3.1. Bố trí thí nghiệm.................................................................................... 9
2.3.2. Chuẩn bị màng BC ................................................................................ 9
2.3.3. Xử lí và kiểm tra độ tinh khiết của VLC .......................................... 11
2.3.4. Phương pháp dựng đường chuẩn ...................................................... 11
2.3.5. Tạo VLC nạp Diclofenac Natri .......................................................... 14
2.3.6. Pha dung dịch đệm .............................................................................. 14
2.3.7. Xác định lượng thuốc giải phóng của VLC nạp thuốc Diclofenac
Natri nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo ............................................ 15

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của thuốc Diclofenac Natri ............................... 5
Hình 2.1. Sơ đồ quá trình tạo Vật liệu cellulose thô .................................... 10
Hình 2.2. Sơ đồ chu trình tinh chế VLC ....................................................... 11
Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278nm
......................................................................................................................... 13
Hình 2.4. Pha dung dịch đệm ........................................................................ 15
Hình 2.5. Máy khuấy từ ra nhiệt ở trong tủ ấm .......................................... 16
Hình 3.1. Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo....................... 17
Hình 3.2. Rung siêu âm ................................................................................. 18
Hình 3.3. Máy xác định lượng thuốc giải phóng ......................................... 19
Hình 3.4. Mẫu rút ra để đo quang phổ ......................................................... 19
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh mật độ quang phổ của lượng thuốc giải phóng ở
màng 0,5cm và 1cm chưa ép nước trong các môi trường pH khác nhau
(n=3) ................................................................................................................ 22
Hình 3.6. Biểu đồ so sánh mật độ quang phổ của lượng thuốc giải phóng ở
màng 0,5cm và 1cm ép nước trong các môi trường pH khác nhau (n=3) .. 22
Hình 3.7. Tỉ lệ giải phóng thuốc tại các nồng độ pH khác nhau trong các
thời điểm khác nhau đối với màng gạo chưa ép nước( % ) (n=3) ............... 26
Hình 3.8. Tỉ lệ giải phóng thuốc tại các nồng độ pH khác nhau trong các
thời điểm khác nhau đối với màng gạo ép 50% nước( % ) (n=3) ................ 27
Hình 3.9. Tỉ lệ giải phóng thuốc tại các nồng độ pH khác nhau thời điểm
24 giờ đối với màng chưa ép và màng ép 50% nước (% ) (n=3).................. 28


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Vật liệu cellulose (VLC) có giá thành thấp được tạo nên từ các nguyên
liệu dễ kiếm, rẻ và có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp.
VLC có cấu trúc hóa học rất giống cellulose thực vật nhưng có một số
tính chất hóa lí đặc biệt như: độ tinh sạch lớn, độ kết tinh và độ bền cơ học

Do đó, với mục tiêu tạo ra màng cellulose vi khuẩn dựa trên loài vi
khuẩn thuộc chủng G. xylium, từ đó chế tạo màng sinh học để khảo sát sự
giải phóng thuốc qua màng nhằm kéo dài thời gian giải phóng, hạn chế tác
dụng phụ, kháng lại tác động của acid và khả dụng sinh học của vật liệu
cellulose trong việc điều trị bệnh. Đó là lý do tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu
khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac Natri tạo từ
Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp
Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường
nước vo gạo.
3. Nội dung nghiên cứu
Tạo và thu VLC tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi
trường môi trường nước vo gạo.
Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp
Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường
nước vo gạo.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu tiềm năng của VLC trong sự giải phóng thuốc.
Nghiên cứu tiềm năng của môi trường nuôi cấy trong nước vo gạo.
Nghiên cứu ứng dụng của VLC nhằm khắc phục hạn chế của thuốc
Diclofenac Natri để mang lại lợi ích cho việc điều trị.
Đánh giá những ưu nhược điểm khả năng giải phóng thuốc của VLC
nạp thuốc Diclofenac Natri để từ đó đề xuất hướng nghiên cứu với các thuốc
khác.

2



thuốc [3, 4, 8].
Ngoài ra, Vật liệu cellulose còn được ứng dụng làm màng băng vết
thương, trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan [9].
Amin và cộng sự đã báo cáo việc sử dụng vật liệu cellulose làm màng
bọc cho paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ. Kết quả cho thấy
vật liệu cellulose giúp cho thuốc được giải phóng một cách kéo dài làm tăng
hiệu quả sử dụng của thuốc [11].
Ở Brazil, Vật liệu cellulose ướt tinh sạch được sản xuất và bán ra thị
trường như một loại ra nhân tạo dùng đắp vết thương [9].
Vật liệu cellulose được mong đợi là vật liệu hóa sinh mới với nhiều ứng
dụng và đang được nghiên cứu, sản xuất hàng loạt.

4


1.1.2. Tổng quan về thuốc Diclofenac Natri
Diclofenac là một dẫn chất của acid 2-amino benzen acetic, có sinh khả
dụng thấp do kém nước (độ tan trong nước ở 25oc khoảng 0.06 mM) [17]. Vì
vậy dạng được dùng thường là muối của nó (có độ tan lớn hơn, ổn định hơn),
đặc biệt muối được sử dụng nhiều là muối Natri Diclofenac [5].
1.1.2.1. Công thức hoá học
Tên khoa học: [2- (2,6- dicloro anilino) phenyl] acetat natri.
Công thức phân tử: C14H10Cl2NNaO2.
Khối lượng phân tử: 318,13 [5].

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của thuốc Diclofenac Natri
1.1.2.2. Tính chất hóa lý
Diclofenac là một axit yếu, dạng tồn tại bột kết tinh hoặc tinh thể màu
trắng đến trắng hơi vàng.
Độ tan: dễ tan trong ethanol 96%, methanol, hơi tan trong axit acetic,

Nghiên cứu VLC làm tác nhân vận chuyển thuốc vẫn còn là một hướng
nghiên cứu mới.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Trên thế giới, đã có 18 công trình nghiên cứu ứng dụng màng cellulose
vi khuẩn trong hệ thống phân phối thuốc (năm 2014) [11]
Nghiên cứu của Wei B. Và CS (2011) màng cellulose vi khuẩn thu
được sau khi ngâm trong benzalkkonium chloride có khả năng giải phóng
thuốc trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đã được tìm thấy là 0,116 kg/cm2, và
tác dụng của thuốc kéo dài ít nhất 24 giờ chống lại hoạt động của S. Aureus
và B. Subtilis [19].

6


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng
2.1.1. Đối tượng
Vật liệu cellulose nạp thuốc Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter
Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo.
2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu
Bảng 2.1. Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu
Tên nguyên liệu

Nguồn gốc

1

Diclofenac Natri dạng tinh khiết

Trung Quốc


7

Axit axetic

Việt Nam

8

Nước vo gạo

VNCKH&UD

9

vi khuẩn G. xylinum

Nhật Bản

10

NaOH

Việt Nam

11

HCL

Việt Nam


Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản)

3

Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA

4

Buồng cấy vô trùng (Haraeus)

5

Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức)

6

Bể ổn nhiệt 1013, bể rửa siêu âm TCP 280

7

Máy khuấy từ gia nhiệt CC162 (IKA- Đức)

8

Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump – Anh)

9

Máy đo pH


6

Gạc vô trùng, vải xô, giấy nhớ,… và nhiều dụng cụ khác.

8


2.2. Phạm vi nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm
Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu khoa học và Ứng dụng-Trường
ĐHSP Hà Nội 2.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo.
Thí nghiệm 2: Xử lý và kiểm tra độ tinh khiết của màng VLC.
Thí nghiệm 3: Tìm quang phổ hấp thụ và giải phóng của thuốc
Diclofenac Natri.
Thí nghiệm 4: Xây Dựng đường chuẩn Diclofenac Natri.
Thí nghiệm 5: Cho màng nạp thuốc Diclofenac Natri trong 2 giờ.
Thí nghiệm 6: Tính tỉ lệ thuốc giải phóng thuốc Diclofenac Natri của
VLC nạp Diclofenac Natri ở các môi trường pH khác nhau.
Thí nghiệm 7: Tính tỉ lệ giải phóng thuốc Diclofenac Natri của VLC
nạp Diclofenac Natri ở độ dày khác nhau.
2.3.2. Chuẩn bị màng BC
Pha môi trường nuôi cấy tạo màng cellulose vi khuẩn được thể hiện ở
bảng 2.1 [13]

9


0,3g

5

Axit axetic

2%

6

Nước vo gạo

1000ml

7

Dịch giống

10%

Qua bảng 2.4. Tạo VLC trong môi trường nuôi cấynước vo gạo ta có quá
trình tạo VLC được thể hiện ở hình 2.1:
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Hấp khử trùng môi trường trong 113oC, 15 phút

Khử trùng môi trường bằng tia UV (15 phút)

Bổ Sung 10% Dịch Giống, 2% Acid Acetic
Ủ tĩnh trong buồng nuôi cấy tế bào khoảng 5 đến 14 ngày ở 28oC

sáng đơn sắc trong dải từ 200 – 800nm.

11


Sử dụng hai cuvet đo dùng cho dung dịch thử và dung dịch đối chiếu
được làm từ chất liệu thạch anh, dung sai về độ dài quang trình của cốc đo là ±
0,005cm. Các cuvet đo được làm sạch và thao tác thận trọng [3].
Pha dãy dung dịch Diclofenac Natri trong Metanol ở các nồng độ (mg/ml)
khác nhau: 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%. Dùng máy đo quang phổ tử ngoại
UV – 2450 để đo mật độ quang phổ (OD) của dung dịch Diclofenac Natri có
nồng độ 50% ở bước sóng 278nm (bước sóng tại đó dung dịch Diclofenac Natri
đạt cực đại (λmax) hấp thụ).
Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn bị theo dãy trên tại bước sóng đã
lựa chọn với mẫu trắng là dung dịch Metanol 900ml và xây dựng đường chuẩn
biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ thuốc Diclofenac Natri.
Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc Diclofenac
Natri để xây dựng đường chuẩn của thuốc.
Phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ có dạng:
y = ax + b với R2 là hệ số tương quan
Trong đó:

y: độ hấp thu của dung dịch tại λmax
x: nồng độ của dung dịch

Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau.
Làm tương tự trên khảo sát phổ diclofenac natri và xây dựng khoảng
tuyến tính định lượng (đường chuẩn) của Diclofenac Natri trong môi trường pH
= 2; 4,5; 6,8 và 7,4.
Giá trị mật độ quang phổ của dung dịch thuốc Diclofenac Natri thể hiện ở


0,49

0,66

0,95

1,169

Lần 2

0,116

0,25

0,46

0,76

0,94

1,173

(n=3)

Lần 3

0,119

0,23


Giá trị OD nm

Dựa vào bảng 2.2 dựng đồ thị biểu diễn, lập đường chuẩn Diclofenac
Natri bằng phần mềm Excel 2010, ta được hình 2.1, hình 2.2, hình 2.3
1,20
y = -0.1583+0.218x
R² = 0,9917

1,00
0,80
0,60
0,40

OD 278nm

0,20
0,00
10

20

30

40
50
60
STT Nồng độ dung dịch Diclofenac mg/ml

Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278nm

dung dịch acid hydrocloric 0,1M và thêm nước vừa đủ 1.000ml; đo pH và hiệu
chỉnh pH nếu cần (dùng HCl hoặc NaOH).
Dung dịch đệm pH = 4,5: Hòa tan 6,8g kali dihydro phosphate trong
1.000ml nước; đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (dùng H3PO4 hoặc KOH).

14


Dung dịch đệm pH = 6,8: Hòa tan 68g dinatri hydrophosphat và 11,45g
kali dihydrophosphat trong nước vừa đủ 1.000ml; đo pH và hiệu chỉnh pH nếu
cần (dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH).
Dung dịch đệm pH = 7,4: Hoà tan 0,6g kali dihydrophosphat; 6,4g dinatri
hydrophosphat và 5,85g natri clorid trong nước vừa đủ 1.000 ml; đo pH và hiệu
chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH).

Hình 2.4. Pha dung dịch đệm
2.3.7. Xác định lượng thuốc giải phóng của VLC nạp thuốc Diclofenac Natri
nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo
Môi trường khảo sát là pH = 2; pH = 4,5; pH = 6,8; pH = 7,4[1][17]
Lấy màng cellulose vi khuẩn đã được nạp thuốc Diclofenac Natri với độ
dày 0,5cm hoặc 1cm và độ rộng (1,5x1,5), mỗi loại lấy 4 mẫu cho vào các bình
chứa 900ml môi trường pH như trên.
Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 50 vòng/phút, nhiệt độ 37oC ±
0,50C.Sau các khoảng thời gian 0,5 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ,
12 giờ, 24 giờ, tiến hành rút mẫu để đo mật độ quang phổ của các mẫu đó.
Số lượng mẫu được rút ra sau mỗi khoảng thời gian là 5ml và được bổ
sung lại 5ml dung dịch đệm tương ứng.

15