CHƯƠNG V.
KỸ THUẬT GÂY RỤNG TRỨNG VÀ CẤY TRUYỀN PHÔI CHO
GIA SÚC
Mục đích: Giới thiệu các bước cơ bản trong cấy truyền phôi cùng các kỹ thuật
như siêu bài noãn và gây động dục nhân tạo cho gia súc. Ngoài ra trong
chương này cũng trình bày tóm tắt các kỹ thuật khác đang được ứng dụng trong
sinh sản: xác định giới tính tinh trùng và phôi, thụ tinh ống nghiệm...
Thời lượng giảng dạy: 9 tiết
I. Khái niệm
Cấy truyền phôi là quá trình đưa phôi từ gia súc cái này sang gia súc cái khác (gia
súc cái cho phôi sang gia súc cái nhận phôi). Phôi vẫn sống, phát triển bình thường
trên cơ sở trạng thái sinh lí sinh dục của gia súc nhận phôi phù hợp với trạng thái
sinh lí sinh dục của gia súc cho phôi hoặc phù hợp với tuổi phôi (sự phù hợp này gọi
là đồng pha).
Cấy truyền phôi là một quá trình điều khiển sinh sản và phát triển của con vật một
cách trực tiếp ở giai đoạn tiền phôi và phôi. Đây là biện pháp tạo giống hoàn chỉnh
nhất tổng hợp một lúc các thành tựu sinh học sinh sản và di truyền hiện đại. 124
Hình 50. Đàn bò được tạo ra từ kỹ thuật CTP
II. MỤC ĐÍCH, Ý NGHĨA VÀ LỢI ÍCH CỦA CẤY TRUYỀN PHÔI
- Khai thác triệt để tiềm năng di truyền ở những cá thể cái cao sản thông qua việc lấy
phôi của chúng. Trên cơ sở đó phổ biến nhanh những gene tốt, quí ra thực tế.
- Nâng cao cường độ chọn lọc, làm tăng tiến bộ di truyền hàng năm, do đó thúc đẩy
công tác giống nhanh, đạt được mục đích.
- Nâng cao hiệu quả chọn lọc, đẩy mạnh công tác giống.
- Bảo quản phôi gọn nhẹ, vận chuyển dễ dàng, đồng thời cũng là kho bảo tồn quĩ
- Có thể tiến hành gây siêu bài noãn để nâng cao sức sinh sản của bò cái cao sản,
thông qua xử lí hợp lý kích tố sinh sản.
- Có thể thu gom được hợp tử khi chúng chưa làm tổ.
- Có thể đưa hợp tử vào tử cung của những con cái khác đồng pha sinh lý với trứng
như thế mới phù hợp yêu cầu phát triển của trứng - phôi thai, thông qua sự làm tổ và
cầu nối nhau thai.
2. Cơ sở thực tiễn.
2.1. Hiện nay con người đã chế tạo thành công một loạt hormon sinh dục như: FSH,
LH, Ostrogen, Progesteron, Prostaglanding... Với những hormon đó, con người có
thể sử dụng nó để điều hòa chu kì sinh dục nhân tạo, các qúa trình sinh lí sinh sản
của gia súc.
2.2. Các nhà khoa học đã nghiên cứu ra phương pháp sản xuất những dụng cụ thu
lượm phôi và xây dựng được cả những qui trình thu lượm, đánh giá và phân loại
phôi.
2.3. Tạo ra được môi trường nuôi cấy trứng và hợp tử ở ngoài cơ thể gia súc.
Phương pháp bảo tồn phôi đông lạnh.
2.4. Đã có nhiều cơ thể sinh vật ra đời từ phương pháp cấy truyền hợp tử và thụ tinh
trong ống nghiệm:
Phương pháp cấy truyền hợp tử và thụ tinh trong ống nghiệm không chỉ thành công
trên gia súc mà nó cũng thành công tương đối phổ biến trên người, đặc biệt ở một số
nước tư bản như Mĩ. [1, 2]
127
IV. KĨ THUẬT CÔNG NGHỆ CẤY TRUYỀN PHÔI TRÊN BÒ
Tổng quát kĩ thuật của công nghệ cấy truyền phôi như sau :
1. Chọn cái cho phôi.
Cái cho phôi phải đạt yêu cầu sau:
+ Phải đặc cấp hoặc cấp kỉ lục (tùy theo mục đích sản xuất mà chọn cho phù hợp).
+ Chú ý khi chọn cần quan tâm đến các tính trạng có hệ số di truyền cao.
và lựa chọn những con ở
giữa ngày 8-14 của chu kỳ
để đưa vào chương trình
cấy phôi.
Tiêm một liều
prostaglandin:
Phải nhận biết được động
dục của tất cả bò cho phôi,
loại bỏ những con ở ngày
3-4 của của kỳ và tiêm cho
tất cả những con còn lại bằng một liều prostaglandin (PG) để gây động dục đồng pha.
Tiêm 2 liều prostaglandin:
129
Tiêm tất cả bò cho bằng một liều PG ở ngày 1. Sau đó 11 ngày tiêm PG lần 2. Quan sát
động dục trong 4-5 ngày. Bắt đầu gây rụng nhiều trứng 10 ngày sau khi động dục của đa
số bò cho phôi.
Synchromate-B:
Đặt SMB ở ngày 1, prostaglandin vào sáng ngày 9 và rút SMB vào chiều cùng ngày.
Quan sát động dục trong 3 ngày. Đưa tất cả bò động dục vào chương trình cấy phôi.
3.2. Kĩ thuật gây siêu bài noãn (rụng trứng nhiều).
Nguyên tắc của siêu bài noãn khá đơn giản, đó là làm cho nhiều noãn xuất hơn bình
thường bằng cách dùng kích dục tố ở thời điểm quan trọng của nang noãn đang phát
triển. Sau đó, kiểm soát sự thoái hóa thể vàng, gây xuất noãn đồng loạt, thụ tinh nhiều
noãn và phát triển phôi giai đoạn sớm. phần lớn bò đáp ứng tốt nếu xử lý trong ngày 8-
14 của chu kỳ sinh dục.
Điều quan trọng là phải sờ khám buồng trứng của bò cho phôi một ngày trước khi bắt
đầu tiến hành gây rụng nhiều trứng để đảm bảo chắc chắn sự có mặt của thể vàng vì
130
4. Phối giống cho cái cho phôi
Sau khi tiêm FSH và
PGF2α nếu bình
thường bò sẽ động dục
vào ngày thứ 5, 6 (kể từ
lúc bắt đầu tiêm). Ta sẽ
phối giống bằng
phương pháp thụ tinh
nhân tạo bào thời điểm
9-24 giờ kể từ lúc bắt
đầu có biểu hiện động
dục.
5. Thu hoạch phôi
5.1. Thời gian thu
hoạch phôi trong
khoảng 5-9 ngày sau
khi phối (tốt nhất là vào
ngày thứ 7 - 8).
5.2. Kỹ thuật thu hoạch
phôi
A. Phương pháp thu hoạch phôi
bằng phẫu thuật (Rowson và
Newcomb, 1975).
B. Phương pháp thu hoạch phôi
không phẫu thuật.
- Nguyên tắc: đưa dụng cụ và dung
Kỹ thuật này giống thụ tinh nhân tạo (tiện lợi, dễ làm, an toàn).
* Chú ý: nếu cấy một phôi
nên cấy ở sừng tử cung bên
phải, còn nếu cấy hai phôi thì
cấy ở cả hai sừng.
2.6.2. Kỹ thuật cấy truyền
phôi bằng phương pháp
phẫu thuật.
+ Vị trí phẫu tthuật (tại vị trí
phẫu thuật để thu hoạch
phôi).
+ Tiến hành phẫu thuật, đưa
tử cung ra ngoài.
+ Tiến hành cấy phôi.
* Chú ý: cũng như cấy truyền
không phẫu thuật nếu cấy ở
sừng tử cung bên phải, còn
nếu cấy hai phôi thì cấy ở cả
hai sừng.
+ Đưa tử cung lại vị trí ban
đầu.
+ Khâu vết mổ lại (khâu giống như sau khi phẫu thuật thu hoạch phôi).
+ Công tác hậu phẫu và chăm sóc
nuôi dưỡng.
* Chú ý: dù cấy truyền bằng phương
pháp nào thì trước khi cấy cũng phải
xác định trạng thái sinh lí của cái nhận
phôi và tuổi của phôi (trạng thái sinh lí
sinh sản của cái nhận phải tương
đương với trạng thái sinh sí của phôi).
với sự sống của phôi và nơi mà phôi phải có mặt trong tử cung ở ngày thứ 12,5 sau
động dục ở cừu để ngăn cản sự thoái hoá của thể vàng. Nghiên cứu ở cừu cắt buồng
trứng ở thời điểm cấy phôi 3-4 ngày sau khi phối với cừu đực vô sinh đã chứng minh rõ
ràng sự cần thiết của phân tiết progestrerone sau rụng trứng, nhưng vai trò đối với
estradiol trong sự di chuyển của phôi hay sự sống sót của chúng không thể chứng minh
được. Cấy phôi giữa các giống có thời gian mang thai khác nhau đã chứng minh rằng
kiểu gen xác định thời gian mang thai. Nghiên cứu liên quan đến sử lý phôi hai tế bào đã
chứng minh rằng mỗi phôi bào có thể phát triển độc lập. Khía cạnh quan trọng khác của
cấy phôi là khả năng ngăn cản sự lây truyền bệnh tật từ con cho phôi bị truyền nhiễm
cho đời con của chúng từ phôi của chúng và tạo ra con cừu-dê thông qua tiêm tế bào
136
ICM vào xoang bào. Các kỹ thuật áp dụng trong thời gian đó đã chứng minh có thể có
giá trị và đã được sử dụng trong nhiều năm làm công cụ nghiên cứu trong các phòng thí
nghiệm, nhưng áp dụng của chúng đối với chăn nuôi tiểu gia súc nhai lại đòi hỏi phải cải
tiến. Cấy phôi rất có lợi đối với việc nhập khẩu gia súc ở dạng phôi đông lạnh và số
lượng tương đối lớn phôi cừu và dê được cấy đã được báo cáo ở úc và Nam Phi. Smith
(1986) đã gợi ý rằng MOET (gây rụng trứng nhiều và cấy phôi có thể có lợi cho việc thúc
đâỷ tiến bộ di truyền cao hơn cho mỗi tính trạng có liên quan. Tuy nhiên, sự chấp nhận
của kỹ thuật này trong chăn nuôi cừu và dê vẫn còn chậm, chủ yếu do sự dao động của
phản ứng buồng trứng đối với xử lý gây rụng trứng nhiều.
2. Tăng hiệu quả của kỹ thuật gây rụng trứng nhiều
Do thực tế rằng cừu dê là những gia súc sinh sản theo mùa nên chúng không phải lúc
nào cũng biểu hiện động dục. Vì lý do đó nên sử lý trước bằng progestagen sau đó bằng
gonadotrophin đối với con cho phôi. Không có sự khác biệt giữa những con cừu được
gây rụng trứng nhiều bằng hai CIDR và những con cưù được sử lý bằng xốp có tẩm
progestagen, nhưng sản lượng phôi thấp hơn sau khi gây động dục đồng pha bằng một
CIDR hay xốp có tẩm progestagen ở liều thấp.
Các chế phẩm gonadotrophin được dùng cho gây rụng trứng nhiều
Gonadotrophin đầu tiên được dùng rộng rãi cho gây rụng trứng nhiều là PMSG (bây giờ
ứng, đặc biệt là trong mùa không sinh sản ở cừu và dê, để tăng phản ứng rụng trứng
nhiều và số phôi có khả năng cấy thu được.
Gây rụng trứng nhiều lặp lại và thu phôi
Các kỹ thuật thu phôi bằng phẫu thuật đối với cừu và dê được sử dụng ngày nay tương
tự với các kỹ thuật đã được xuất bản trước đây. Lôi đường sinh dục ra ngoài thường
dẫn đến viêm dính sau phẫu thuật, làm giảm sản lượng phôi ở lần phẫu thuật lặp lại sau
đó. Với sự phát triển của các phương pháp không phẫu thuật liên quan đến việc sử dụng
nội soi, bây giờ có thể thu phôi nhiều lần từ một con cái mà không bị viêm dính sau phẫu
thuật. Tuy nhiên, gây rụng trứng nhiều lặp lại bằng pFSH ở dê thường đi cùng với việc
xuất hiện các kháng thể kháng FSH và giảm tỷ lệ rụng trứng sau lần điều trị thứ ba. Tuy
nhiên, phản ứng gây rụng trứng nhiều được duy trì ở dê bằng điều trị nhiểu lần với một
chế phẩm FSH của cừu.
Sự dao động trong phản ứng gây rụng trứng nhiều
Phổ biến ở bò là mức độ dao động cao về tỷ lệ rụng trứng và số phôi thu được sau khi
gây rụng trứng nhiều đã được chứng minh, dao động này trong phản ứng là yếu tố hạn
chế chính trong các chương trình cấy phôi ở tiểu gia súc nhai lại. Những con cho phôi
không có phản ứng (<5 trứng rụng) (cừu :20%; dê :10%) không có giá trị đối với thu phôi
dường như là các yếu tố mùa vụ, di truyền và dinh dưỡng làm cho dao động kết quả gây
rụng trứng nhiều không kể đến các kỹ thuật gây rụng trứng nhiều được sử dụng. ảnh
hưởng của dinh dưỡng không đủ lên sự thoái hoá của thể vàng trước lúc trưởng thành
đã được báo cáo nhưng các cơ chế gây ra điều đó vẫn cần phải nghiên cứu thêm. Tuy
nhiên, sự đóng góp của dao động sinh lý như tình trạng của quần thể nang trứng ở thời
điểm bắt đầu điều trị gonadotrophin cũng không thể loại bỏ. Gần đây rBST (recombinant
bovine somatotrophin) sãn có và cùng với hocmôn sinh trưởng (GH) trong việc điều hoà
sinh trưởng của nang trứng ở bò đã được báo cáo. Điều trị bò hậu bị với GH trước các
hocmôn gonadotrophin dẫn đến phản ứng gây rụng trứng nhiều tốt hơn và tăng số
lượng phôi có thể cấy. ở cừu, mặc dầu số lượng cho thấy tăng số lượng nang trứng 2-
3mm sau khi điều trị GH, tỷ lệ gây rụng trứng nhiều do gonadotrophin không bị thay đổi
so với không điều trị GH. ở dê, điều trị bốn tuần bằng rBST không có ảnh hưởng đến
chức năng buồng trứng và không ảnh hưởng đến eCG gây tỷ lệ rụng trứng. Mức độ của
21.8?5.2
P<0.01
7.3?1.3
0
13.2?5.5
19.2?4.1
P<0.05
Tiêm GnRH antagonist (0,5mg/ngày trong 10 ngày) cũng có thể được sử dụng để thay
thế Buserelin với cùng hiệu quả và được sử dụng thường xuyên ở chương trình cấy
phôi Lacaune ở Pháp (bảng 2)
Bảng 16. Tỷ lệ rụng trứng, sản lượng phôi và khả năng sống của phôi sau khi cấy phôi
tươi cho con nhận ở cừu Lacaune.
Tỷ lệ
rụng
trứng ?Sệ
DễNG
Số
trứng
thu
được
Tỷ lệ
trứng
thụ
tinh
Tỷ lệ
phôi
thoái
hoá
Tỷ lệ phôi
có khả
cổ tử cung. Vì vậy, tỷ lệ thụ tinh cao có thể đạt được bằng phẫu thuật bằng cách đưa
139
trực tiếp đưa tinh trùng vào sừng tử cung. Gần đây, thụ tinh trong tử cung bằng vi phẫu
thuật sau 48 giờ rút xốp có tẩm progesterone và cho kết quả thụ tinh cao và tần xuất
thấp phôi bị thoái hoákhông kể đến tỷ lệ rụng trứng, cho thấy khả năng bẩm sinh của tế
bào trứng để được thụ thai không bị tổn thương bằng gây rụng trứng nhiều với FSH.
3. Tạo phôi trong ống nghiêm
Mới chỉ một thập kỷ trôi qua kể từ khi sinh ra những con cừu và những con dê sau khi
thụ tinh ống nghiệm (IVF). Các kỹ thuật nuôi chín ống nghiệm (IVM) các tế bào trứng, sự
thụ thai của chúng bằng tinh trùng đã được hoạt hoá trong ống nghiệm và nuôi cấy trong
ống nghiệm (IVC) những phôi được tạo ra đã thành công cả ở cừu và dê. Mặc dầu các
kỹ thuật sử dụng cho tạo phôi trong ống nghiệm ở gia súc nhỏ nhai lại dao động giữa
các phòng thí nghiệm, những phần quan trọng nhất của kỹ thuật được coi là hoạt hoá
tinh trùng và nhiệt độ và pH của môi truờng nuôi cấy được thực hiện. Hepảin rất quan
trọng trong hoạt hoá tinh trùng bò trong ống nghiệm, đã được sử dụng thành công ở dê
và cừu. Tuy nhiên, chất lượng phôi tạo ra trong sự có mặt của heparin vẫn là một câu
hỏi, vì chỉ có 25% (5/20)phôi nang đã cấy sinh ra dê con sống so với 61% (11/18;
P<0.05) của nhóm đối chứng, mà ở đó tinh trùng được hoạt hoá bằng huyết thanh đã
được sử lý nhiệt. Những khác biệt giữa con đực và nguy cơ đa tinh trùng giữa các thí
nghiệm (10-20%) đã được chứng minh. Tuy nhiên, sau khi loại bỏ những tế bào trứng có
nhiều tinh trùng, trung bình 60-70% các tế bào trứng cừu và dê thụ thai bình thường có
thể đạt được trong ống nghiệm. Gần đây, có thể đạt được tỷ lệ phân chia trong ống
nghiệm tương đương với tỷ lệ phân chia trong cơ thể, mà không có mặt các tế bào soma
trong hệ thống môi trường nuôi cấy không có huyết thanh. Các nghiêm cứu trước đây đã
chỉ ra rằng rào cản sự phát triển ở giai đoạn 8-16 tế bào có thể vượt qua bằng việc cùng
nuôi cấy với các tế bào ống dẫn trứng. Tỷ lệ có chửa cao đã đạt được sau khi cấy (2
phôi nang trên con nhận) phôi có nguồn gốc nuôi cấy trong môi trường ống dẫn trứng
tổng hợp (SOF) có BSA và axit amin hay SOF có bổ xung FCS (bảng 3)
Bảng 17. Ảnh hưởng của bổ xung môi trường SOF với 10% huyết thanh thai bê (FCS) 2
phôi nang
cấy
SOF
SOF+FC
S
83
81
16
9
29
27
16
15
6/8
8/8
5/8
8/8
44(7/16)
80(11/15)
*
Số tế bào trứng IVM/IVF/IVC ở mỗi nhóm =230
Người ta đã báo cáo rằng cấy phôi cừu tạo ra trong SOF bổ xung 20% huyết thanh
người làm cho thời gian có chửa dài hơn và trọng lượng so sinh cao hơn so với mong
đợi bình thường. Những khuyết tật này rõ ràng không quan sát thấy sau khi nuôi cấy
trong môi trường không có huyết thanh.
140
Copyright: Tài liệu đại học ©