Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt

Bài 1: LÀM QUEN PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC
VẬT VÀ PHA CHẾ DUNG DỊCH MẸ.

I. Giới thiệu hệ thống phòng thí nghiệm NCM&TBTV:

Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật hiện đại được thiết kế phù hợp với tính
chất dây chuyền của loại công việc này có sơ đồ tổng quát như sau:
1 2 3 4
1. Phòng rửa, sản xuất nước cất và sấy, hấp
2. Phòng chuẩn bị môi trường
3. Phòng cấy vô trùng
4. Phòng nuôi
Bên cạnh phòng thí nghiệm phải có hệ thống nhà kính, nhà lưới và vườn ươm để trồng
cây lấy nguyên liệu nuôi cấy và trồng cây đã tái sinh trong quá trình chọn lọc in vitro.
Các thiết bị chủ yếu của các phòng trên
1.1. Phòng rửa, sản xuất nước cất và sấy, hấp
Máy cất nước 1 lần (12-20 lít/giờ)
Máy cất nước 2 lần (4 lít/ giờ)
Máy sản xuất nước khử ion
Tủ sấy 60-600
0
C
Nồi hấp môi trường (Autoclave)
1.2. Phòng cấy vô trùng
Laminar
Quạt thông gió
Bộ dụng cụ cấy gồm dụng cụ cấy và bộ khử trùng
1.3. Phòng nuôi
Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, có chỗ chiếu sáng ở chỗ để bình nuôi cấy từ

(g/200 ml)
Dung tích
dùng cho 1 lít
môi trường
MS1: KNO
3
KH
2
PO
4
NH
4
NO
3

MgSO
4
1900
170
1650
370
19
1,7
(x10) 16,5
3,7
{20 ml
MS2: CaCl
2
440 (x 20) { 6,64 {10 ml
MS3 : H

KI
6,2
22,3
0,025
0,025
8,6
0,25
0,83
0,124
0,338
0,5 mg
(x20) 0,5 mg
0,213
5 mg
16,6 mg
{10 ml
MS4: FeSO4
Na2EDTA
27,8
37,3
0,556
(x20) 0,746
{10 ml
MS5: Myo-Inositol
Thiamine.HCl
Pyridoxine.HCl
Acid nicotic
Glycine
100
0,1

Pha môi trường WP1, WP2, WP4
Bảng 2.2.
Hóa chất
Nồng độ
Mg/l
Dung dịch stock
g/200 ml
Dùng cho 1 lít
môi trường
WP1
NH
4
NO
3
MgSO
4
.7H
2
O
KHSO
4
K
2
SO
4

400
370
170
990

4
.7H
2
O

37,3
27,8

(x 20) 0,746
0,556
10 ml

Cách tiến hành pha môi trường WP cũng tương tự như môi trường MS, nhưng một
điều nên chú ý rằng môi trường WP này chủ yếu sử dụng cho cây thân gỗ.
Đối với WP4 chúng ta cũng bảo quản lạnh trong lọ màu

Báo cáo thực hành 3 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu
Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt

BÀI 2. MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG NHÂN CHỒI
CẨM CHƯỚNG VÀ ĐỒNG TIỀN
1. Dụng cụ, thiết bị và hoá chất
1.1. Dụng cụ và thiết bị
-Cốc chịu nhiệt, nồi inox 3 lit, ống đong, đũa thuỷ tinh…để pha môi trường dinh
dưỡng
-Nồi Autoclave
-Cân kĩ thuật 10
-2
gam
-Máy cất nước

Báo cáo thực hành 4 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu
Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt
dùng giấy mềm lau khô rồi ngâm vào dung dịch bảo quản, tắt bếp khuấy từ, lấy cục khuấy
từ ra rửa lại bằng nước cất, lau sạch, để lại vào đĩa petri.
Bổ sung nước cất đến 400ml.
- Cân 30g saccharo, 8g agar (dùng cho 1l môi trường). Cho agar vào nồi thêm
500ml nước tiến hành khuấy đều, đun sôi trên bếp điện vài phút. Trộn chung agar và dung
dịch đã pha chất kích thích sinh trưởng đã đo pH lại với nhau,cho thêm nước cất cho đủ
1lít, phân phối môi trường vào trong các chai, bình tam giác thủy tinh. Dùng túi nilon và
dây chun buộc chặt nắp bình. Dán nhãn có ghi tên môi trường đồng tiền nhân chồi là Gd.a
lên bình môi trường.
- Kiểm tra nước trong và ngoài nồi khử trùng Autoclave. Xếp các bình môi trường
vào giỏ của nồi. Đậy nắp và nhấn nút Star, tiến hành hấp môi trường ở mode 2 (121
0
C/25
phút) hấp xong lấy ra, dựng đứng các chai môi trường, để nguội.
2.2. Pha môi trường nhân chồi cẩm chướng (D.a)
Công thức môi trường: MS

+ 30 g sac + 8 g agar + 0,3 mg/l BA +0,2 mg/l IBA
pH = 5,8
Để pha môi trường nhân chồi cẩm chướng ta thực hiện các thao tác tương tự như
pha môi trường đồng tiền chỉ khác chất điều khiển sinh trưởng ở đây là 0,3 mg/l BA và
0,2 mg/l IBA.
Dán nhãn ghi tên môi trường là D.a
đối với panh kẹp, kéo và dao nhúng cồn và hơ trên ngọn lửa cho cháy đỏ, để thật nguội.
+ Bình mẫu mở nắp, hơ miệng bình để tránh mẫu có thể nhiễm bởi vi sinh vật bám
trên miệng bình, dùng panh gắp mẫu ra đĩa inox, tách riêng từng chồi đối với những chồi
nhỏ ở gốc mẫu cấy, bỏ bớt lá vàng và những phần quá trắng do bệnh thuỷ tinh thể, bỏ rễ
và phần agar dính ở gốc. Đối với những đoạn thân dài thì dùng dao hoặc kéo cắt thành
từng đoạn 1 sao cho mỗi đoạn có ít nhất 1 chồi nách. Mỗi lần chỉ cắt1 ít mẫu để trên dĩa
vừa đủ cấy cho 1 đến 2 bình tam giác để tránh mẫu bị khô, héo, do sức nóng của đèn cồn
hay quạt gió
Báo cáo thực hành 6 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu
Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt
+ Mở nắp miệng bình môi trường và hơ qua ngọn lửa đèn cồn, dùng panh gắp mẫu
vừa tách cấy xuống mặt thạch (chồi, đỉnh hướng lên trên). Một bình cấy chuyền ít nhất
phải được 6-10 chồi tuỳ mẫu và tuỳ bình môi trường lớn hoặc nhỏ. Hơ qua nắp trên ngọn
lửa đèn cồn, đậy nắp cột thun, ghi thông số: tên người cấy, nhóm cấy, ngày cấy.
Chú ý thao tác phải hết sức cẩn thận, không cho tay đưa lên không gian phía trên đĩa
mẫu và các thao tác thực hiện hoàn toàn trong điều kiện vô trùng.
+ Sau khi tiến hành cấy xong, làm vệ sinh box cấy, tắt nguồn tủ cấy, rửa dụng cụ cấy
cho sạch và cho vào tủ sấy ở 160
0
C

Kết quả:
Sau 2 ngày cấy quan sát thấy có 1/5 bình xuất hiện 1 đám mốc, còn các bình còn lại
không quan sát thấy hiện tượng nhiễm vi sinh vật cho đến các ngày hôm sau. Mẫu cấy
phát triển bình thường, sau 2 tuần vẫn chưa thấy nhiễm. Các mẫu cấy phát triển sinh khối
bình thường, màu sắc của mẫu cấy có xanh hơn so với lúc đầu nhưng vẫn bị mọng nước.


Bình nước cất 2 lần đã thanh trùng
Cồn tuyệt đối, thuỷ ngân clorua 1%
2 Bộ khử trùng, 2đĩa inox, 2đĩa petri, cốc đố nước thừa 1000ml, ống đong
50ml (pha cồn, thuỷ ngân clorua).
Đèn cồn, quẹt lửa, đồng hồ.
Tất cả được lau cồn trước khi để vào box, box cũng đã được lau bằng cồn.
+ Bật box cấy: bật công tắc nguồn, bật quạt, bật đèn UV khử 30 phút.
+ Hạt keo lai đã rửa qua nước sạch, được ngâm trong nước ấm 60
0
C, để qua đêm
được dùng để vào mẫu.
+ Môi trường A.e đã chuẩn bị hôm trước, lấy bông thấm cồn lau lại và xếp vào rổ, để
bên cạnh box cấy.
- Tiến hành:
+ Box sau 30 phút, tắt UV, bật đèn, vặn quạt nhỏ lại. Trước khi tiến hành làm phải
rửa sạch tay bằng xà phòng dưới vòi nước, lau lại bằng cồn, trang phục tóc tai gọn gàng.
+ Hạt keo để ráo nước cho vào bình lắc. Tiến hành lắc bằng cồn 70 % trong
30s(cồn 99,5
0
pha thành cồn 70
0
bằng ống đong: ≈15ml nước/ ≈35ml cồn 99,5
0
), tráng lại
Báo cáo thực hành 8 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu
Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt
mẫu bằng nước cất 5 lần. Tiếp tục khử trùng thủy ngân 0,1%/ 10 phút (được pha từ
HgCl
2
1%: 5ml HgCl

Báo cáo thực hành 9 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu
Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt

BÀI 5. NHÂN CHỒI KEO LAI
- Dụng cụ chuẩn bị cho 1 box cấy tương tự như nhân chồi cẩm chướng, đồng tiền:
+ Đĩa inox, đĩa petri, panh cấy, dao, kéo
+ Ống đựng cồn.
+ Đèn cồn, quẹt lửa.
+ Bật box cấy.
+ Mẫu: Bình keo lai cấy đã phát triển thành nhiều chồi, có rễ và dài (cao)
+ Môi trường chuẩn bị sẵn từ hôm trrước, lau bằng cồn, xếp vào rổ để cạnh box
cấy.
- Tiến hành:
+ Box sau khi tắt UV, bật nguồn, bật đèn sáng, bật quạt. Vệ sinh tay bằng xà
phòng dưới vòi nước chảy. Để khô tay và lau lại bằng cồn, thắp đèn cồn. Khử trùng đĩa
petri, đĩa inox bằng cồn và đốt cháy. Panh và kéo (hoặc dao) đem đốt trên ngọn lửa đèn
cồn cho cháy đỏ để nguội.
+ Bình mẫu mở nắp, dùng panh gắp mẫu ra để đĩa inox, cắt từng đoạn 1 – 2cm, bỏ
bớt lá, bỏ rễ. Tiếp tục dùng môi trường đã pha tiến hành lấy panh gắp cấy bằng cách cắm
đoạn thân, chồi vừa cắt xuống mặt thạch (chồi, đỉnh hướng lên trên). Chú ý trong quá
trình cấy bình luôn dăt nghiêng 1 góc 45
0
so với mặt tủ, các thao tác thực hiện trong
không gian cách đền cồn 20 cm và tuyệt đối không để tay lên phía trên đĩa mẫu. Một bình
cấy chuyền ít nhất phải được 4 – 5 đoạn thân. Lượng chồi cấy vào phụ thuộc bình to hay
nhỏ. Hơ miệng bình trên ngọn lửa đèn cồn, đậy nắp nhãn: tên người cấy, nhóm cấy, ngày.
+ Sau khi xong việc cấy hạt, tiến hành vệ sinh box, rửa sạch dụng cụ, để ráo, cho
vào tủ sấy. Trong quá trình làm phải cẩn thận không được để tay lên trong phạm vi khu
vực đĩa cấy.
KẾT QUẢ: sau khi cấy vài ngày quan sát thấy các bình sau khi cấy phất triển rất tốt trừ

Báo cáo thực hành 11 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu
Công nghệ tế bào thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt

BÀI 7. NHÂN CALLUS CẨM CHƯỚNG
- Chuẩn bị dụng cụ: + Đĩa inox, đĩa petri.
+ Panh cấy, dao kéo.
+ Đèn cồn, quẹt lửa
+Ống chứa cồn
Thao tác khử trùng box cấy cũng tương tự như những lần cấy trước.
- Mẫu callus là những bình callus cẩm chướng. Lau xung quanh bình mẫu bằng cồn.
Môi trường cũng được lau sạch bằng dung dịch cồn, xếp vào rổ để vào box cấy.
- Sau 30 phút, tắt UV, bật đèn sáng, bật quạt, rửa tay sạch sẽ bằng xà phòng dưới vòi
nước, tay áo xắn cao, có đồng hồ, nhẫn, vòng tay tháo hết ra, bật đèn cồn. Tiến hành quá
trình cấy chuyền callus.
+ Hơ bình mẫu qua ngọn lửa đèn cồn.
+ Đĩa inox, đĩa petri đốt cháy bằng đèn cồn.
+ Dao cắt, panh cấy được đốt cháy đỏ, để nguội.
+ Ống đựng cồn, dao cấy sau mỗi lần sử dụng nhúng vào để đốt lại khử trùng.
+ Lấy mẫu callus ra đĩa inox, cắt nhỏ, khoảng 1–2 mm
2
, mỗi bình cấy khoảng 5
mẫu.
+ Miệng bình môi trường được hơ qua ngọn lửa đèn cồn, dùng panh gắp mẫu
callus đã cắt cho vào bình và nhấn nhẹ xuống môi trường thạch.

C là có
thể đổ môi trường vào bịch. Việc đổ môi trường vào các bịch được tiến hành ở trong box
vô trùng. Phân phối môi trường từ bình tam giác vào các bịch nilon sao cho mỗi bịch
khoảng 50ml môi trường, gấp mép bịch lại chú ý tay không được chạm mép bịch dùng
ghim để cố định mép bịch. Dán nhãn, ghi tên môi trường, để nguội xếp trong các kệ ta
được các bịch môi trường ra rễ cúc. Làm vệ sinh box cấy. Báo cáo thực hành 13 SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu