BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0**** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN LOÀI Fusarium spp. GÂY BỆNH THỐI
XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG PHƢƠNG PHÁP
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
KS. DƢƠNG THÀNH LAM PHẠM THỊ HẰNG
TS. LÊ ĐÌNH DÔN
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2007
ii
LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi nhận đƣợc rất nhiều sự ủng hộ
và giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và bạn bè. Nay tôi xin chân thành cảm ơn đến:
Cha Mẹ và những ngƣời thân luôn tạo điều kiện, động viên con trong suốt
TÓM TẮT
PHẠM THỊ HẰNG, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9-2007
“PHÁT HIỆN LOÀI NẤM Fusarium spp. GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG
(Cactaceae) BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)” tại phòng Bảo
Vệ Thực Vật, Khoa Nông Học trƣờng Đại học Nông Lâm và Viện nghiên cứu Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng – phòng Công nghệ Sinh học Thực vật
Trƣờng Đại học Nông Lâm – TP.HCM.
Thời gian thực hiện đề tài: 20/3/2007 đến 30/7/2007.
Giáo viên hƣờng dẫn: KS. Dƣơng Thành Lam.
TS. Lê Đình Đôn.
Nội dung nghiên cứu
Điều tra tình hình bệnh hại xƣơng rồng trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh.
Thu thập xƣơng rồng bị bệnh từ các vƣờn điều tra. Từ đó phân lập, nhân và
thu sinh khối các dòng nấm đã phân lập đƣợc.
Ly trích thu DNA. Thực hiện quy trình phản ứng PCR khuếch đại trình tự
nằm trong vùng tef bằng primer ef1 và ef2 của các dòng nấm phân lập đƣợc.
Giải trình tự sản phẩm PCR.
Chủng bệnh lên xƣơng rồng khỏe mạnh.
Kết quả đạt đƣợc
Tỷ lệ nhiễm bệnh tại các vƣờn điều tra:
Bệnh do vi khuẩn: 7,43%.
Bệnh do nấm: 18,2%.
Bệnh do virus: 0,16%.
Phân lập đƣợc 12 dòng nấm từ các mẫu xƣơng rồng bị bệnh với 2 hình thái
có màu khuẩn lạc đặc trƣng:
Khuẩn lạc nấm màu trắng, tròn, tơ mịn.
Khuẩn lạc nấm màu tím, tròn, tơ mịn.
v MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................. ii
TÓM TẮT ................................................................................................................. iii
MỤC LỤC ................................................................................................................... v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ....................................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ ................................................................... x
DANH SÁCH ĐỒ THỊ ............................................................................................... x
Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1
1.2. Mục đích - yêu cầu ....................................................................................... 2
1.2.1. Mục đích ............................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................. 2
1.3 Giới hạn của đề tài ........................................................................................ 2
Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3
2.4.2.3. Biện pháp hóa học ....................................................................... 17
2.5. Tổng quan về vùng tef trên genome của nấm Fusarium ............................ 17
2.6. Ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nấm ............................................ 18
2.6.1. Khái niệm ............................................................................................ 18
2.6.2. Nguyên tắc .......................................................................................... 19
2.6.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng PCR ............................. 20
2.6.4. Ứng dụng của PCR ............................................................................. 22
2.7. Giới thiệu sơ lƣợc về kỹ thuật DNA sequencing ....................................... 22
2.8. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về bệnh do nấm Fusarium spp. .. 22
2.8.1. Trên thế giới ........................................................................................ 22
2.8.2. Tại Việt Nam ....................................................................................... 25
2.9. Danh mục một số loài Fusarium đƣợc tìm thấy ở Việt nam ...................... 26
Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 27
vii
3.1. Vật liệu thí nghiệm ..................................................................................... 27
3.1.1. Thời gian – địa điểm nghiên cứu ........................................................ 27
3.1.2. Vật liệu ................................................................................................ 27
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 29
3.2.1 Điều tra tình hình bệnh chết trên cây xƣơng rồng tại TP. Hồ Chí Minh...... ... 29
3.2.2. Phân lập mẫu nấm ............................................................................... 29
3.2.3. Tăng sinh khối nấm trên môi trƣờng nhân sinh khối .......................... 31
3.2.4. Ly trích DNA tổng số của nấm ........................................................... 32
Quy trình này đƣợc thực hiện dựa trên quy trình của Lee và Taylor. ............... 32
3.2.5. Điện di xem DNA tổng số .................................................................. 32
3.2.6. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng tef các dòng nấm
Fusarium spp. .................................................................................................... 33
3.2.7. Đọc trình tự sản phẩm PCR ................................................................ 35
3.2.8. Chủng nấm lên cây xƣơng rồng .......................................................... 36
3.2.8.1. Tiến hành chủng bệnh trên xƣơng rồng....................................... 36
PGA :Potato glucose agar.
WA :Water agar.
EtBr :Ethidium bromide.
l :micro lít.
g :micro gam.
M :micro gam/ lít.
mM :mili gam/ lít.
ctv :cộng tác viên.
ng :nano gam.
bp :base pair.
rDNA : ribosomal DNA
RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism.
Tm : Melting Tempereture.
TEF : Translation elongation factor.
ITS : Internal Transcribed Spacer.
ix
NCBI : National Center for Biotechnology Informatic.
DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 2.1. Hình thái bào tử nấm Fusarium spp. ................................. 13
Hình 2.2. Vùng gen tef trên nấm Fusarium
sử dụng trong FUSARIUM-ID ........................................ 17
Hình 4.1. Xƣơng rồng với triệu chứng thối gốc ................................ 38
Hình 4.2. Xƣơng rồng với triệu chứng thối vàng và đen ở gốc ......... 39
Hình 4.3. Xƣơng rồng với triệu chứng thối thân ............................... 39
virus gây ra qua các vƣờn điều tra ................................. 40
Bảng 4.2. So sánh phần trăm (%) độ tƣơng đồng
giữa dòng FC07 – 3, FC07 – 7 và FC07-10. ................... 46
Bảng 4.3. So sánh phần trăm độ tƣơng đồng (%) giữa 3 dòng
FC07 – 3, FC07 – 7, FC07 – 10 với các dòng trên genbank........ 49
DANH SÁCH ĐỒ THỊ
ĐỒ THỊ TRANG
Đồ thị 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm,
virus gây ra qua các vƣờn điều tra ................................. 40
1
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, do nhu cầu đời sống của con ngƣời đƣợc nâng cao nên vấn đề thƣ
giãn tinh thần ngày càng đƣợc coi trọng. Hiện nay vấn đề chơi cây cảnh trên địa bàn
Tp. Hồ Chí Minh (Tp: thành phố) ngày càng phát triển trong đó có xƣơng rồng.
Xƣơng rồng đang dần đƣợc khẳng định trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh vì chúng
tƣơng đối dễ trồng, giá cả phải chăng, ai cũng có thể chơi và chăm sóc. Xƣơng rồng
dù sống trên sa mạc khô cằn vẫn nở hoa sặc sở, thể hiện một sức sống mãnh liệt. Do
Chủng bệnh trên xƣơng rồng khỏe.
1.3 Giới hạn của đề tài
Đề tài đƣợc thực hiện từ 20/03/2007 đến 30/07/2007.
Chỉ thực hiện đƣợc trên một số mẫu.
3 Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Một số đặc tính để phát triển xƣơng rồng (theo Huỳnh Văn Thới, 2004)
Trƣớc đây không chỉ ở nƣớc ta mà nhiều nƣớc trên thế giới cũng vậy, số
ngƣời thích chơi kiểng xƣơng rồng rất ít. Ngƣời nào thích “sƣu tập” thì số lƣợng
cũng không nhiều.
Nhƣng, càng về sau, số nghệ nhân đến với kiểng xƣơng rồng càng ngày càng
nhiều, khi họ nhận ra một điều loại kiểng trụi lá này đƣợc các nhà thực vật học
không ngừng lai tạo thêm nhiều cây có hình dáng lạ, và màu sắc cũng khác lạ.
Xƣơng rồng có đủ loại: cây cao có mà cây thấp cũng có, cây to cây nhỏ
cũng nhiều.
Theo thói quen, hễ nói đến cây kiểng, ai cũng nghĩ là trồng ở trong vƣờn,
ngoài sân, trƣớc hàng ba, lan can… nơi có nhiều nắng gió thông thoáng, chứ không
ai nghĩ kiểng lại đem chƣng bày trong nhà, nơi thiếu ánh nắng và không khí lúc nào
cũng hầm hập.
Với xƣơng rồng là loại cây kì diệu, có thể sống tƣơi tốt trong nhà một vài
tuần, thậm chí cả tháng, trong điều kiện thiếu hẳn ánh nắng, thiếu bón tƣơi… chính
sự kì diệu này đã đƣa kiểng xƣơng rồng đến với mọi ngƣời, mọi nhà, trong đó có
đông đủ cƣ dân thành thị.
Đƣợc biết, tại nhiều nƣớc Âu Mỹ, mãi đến những năm đầu thế kỷ XX, ngƣời
ta mới khám phá ra đƣợc điều này. Bởi vì trong giai đoạn này các thành phố của họ
Bộ (Ordo) Caryophyllales
Họ (Familia) Cactaceae
(Nguồn:http:// en.wikipedia.org/wiki/cactaceae).
2.2.2. Giới thiệu về cây xƣơng rồng và các cây cùng họ
Trích theo (nguồn: http:// en.wikipedia.org/wiki/cactaceae).
5
Cây xƣơng rồng thƣờng là loại cây mọng nƣớc thuộc họ Cactaceae (có cây
ra hoa hai lá mầm). Họ Cactaceae có từ 24 đến 220 chi, tùy theo nguồn (90 chi phổ
biến nhất), trong đó có từ 1.500 đến 1.800 loài. Những cây xƣơng rồng đƣợc biết
đến nhƣ là có nguồn gốc từ Châu Mỹ, nhất là ở những vùng sa mạc. Cũng có một số
loại biểu sinh trong rừng nhiệt đới, những loại đó mọc trên những cành cây, vì ở đó
mƣa rơi xuống đất nhanh, cho nên ở đó thƣờng xuyên bị khô.
Loài cây quen thuộc có chung họ xƣơng rồng
Quỳnh (Epiphyllum oxypetallum): Đây là loại hoa kiểng rất đƣợc nhiều
ngƣời yêu chuộng vì đặc tính hoa đẹp. Hiện nay, ngƣời ta đã lai tạo đƣợc loại
hoa Nhật quỳnh, loại hoa quỳnh nở cả ngày.
Thanh long (Hylocereus undatus): Đây là một loại cây ăn trái. Trái có mùi vị
đặc trƣng, hơi chua, ngọt. Vỏ trái màu từ đỏ hồng đến đỏ tía.
2.2.3. Tình hình sản xuất và phát triển xƣơng rồng ở Tp. Hồ Chí Minh và trên
thế giới
2.2.3.1. Tại Tp. Hồ Chí Minh
Theo Trƣơng Duy Lam (2006), từ những năm 60 của thế kỷ trƣớc, các loại
cây xƣơng rồng đã đƣợc du nhập vào Việt Nam nhƣ Bolivia, Eriocacfus warasii…
Và cho đến ngày nay, chúng là loại cây không thể thiếu trong bộ sƣu tập của những
ngƣời chơi xƣơng rồng. Đất Tp. Hồ Chí Minh vẫn còn nổi tiếng với một bậc lão
thành chuyên về các giống xƣơng rồng đó là Bác Năm Trƣờng ở Thủ Đức. Ông đã
lai tạo, nhân giống liên tục để đến hôm nay trên thị trƣờng Việt Nam nói chung và
thị trƣờng Tp. Hồ Chí Minh nói riêng có rất nhiều giống xƣơng rồng có màu sắc
hoa rất lạ và đẹp. Trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh hiện nay phần lớn xƣơng rồng
2.2.4. Đặc tính thực vật và điều kiện sinh thái của xƣơng rồng (theo Huỳnh
Văn Thới, 2004)
2.2.4.1. Đặc tính thực vật
Xƣơng rồng không đẹp mã bằng nhiều giống cây kiểng khác, vì chúng chỉ
có một đoạn thân cây mập mạp, trơ trụi và giản dị tƣởng chừng nhƣ đời sống của nó
7
không có gì đáng để cho mọi ngƣời quan tâm chú ý đến. Thật ra, xƣơng rồng vẫn
hội đủ những đặt tính thực vật đáng để đƣợc tìm hiểu cặn kẽ.
Thân cây
Xƣơng rồng có thân mập, căng bong mọng nƣớc, vì bên trong chứa rất nhiều
nƣớc gọi là mủ.
Thân xƣơng rồng rất đa dạng: hình trụ (thƣờng gọi là mộc trụ hoặc độc trụ),
hình cầu và dẹp. Đa số giống là hình trụ và hình cầu, số ít giống hình dẹp, nhƣ cây
lƣỡi long (gốc dẹp, thân dẹp và cành nhƣ những chiếc lá dày). Hoặc loại xƣơng
rồng “tai thở”… Thân cây xƣơng rồng, tùy giống mà có loại cao loại thấp, loại to,
loại nhỏ. Thân có khía hoặc có múi. Có giống ít khía nhƣ giống ta dùng làm hàng
rào (chỉ có ba khía), nhƣng cũng có giống 25 khía nhƣ giống Ferocactus wedzenii.
Có giống khía rất cạn, nhƣng cũng có giống khía sâu. Giống không khía thì có múi.
Múi là những nốt sần lớn từa tựa nhƣ vỏ trái thơm (dứa) mà đa số các giống xƣơng
rồng hình cầu đều có dạng này.
Lông
Đa số giống xƣơng rồng có thân trơn láng, nhƣng cũng có một số giống thân
có lớp lông mịn phủ đầy, nhƣ Cephalocerus. Có giống trên ngọn đƣợc phủ chụp lớp
lông dài trắng xóa, gọi là giống Borzicactus.
Gai
Đa số xƣơng rồng đều có gai nhọn và là gai chùm, cái nào cũng nhọn hoắt.
Nhiều giống xƣơng rồng có nhiều gai cứng mọc tua tủa, nhƣng cũng có giống gai
nhỏ và mềm dịu. Đƣợc biết, mới đây một chuyên viên ngành hoa kiểng ở California
là ông Luther Burbank đã lai tạo ra đƣợc giống xƣơng rồng mới không gai. Gai
năm bảy hoa, thậm chí nhiều đến chín mƣời hoa.
Tùy từng giống mà hoa đậu trên cây ít hay nhiều ngày: có giống chỉ nở một
ngày rồi tàn, nhƣng cũng có giống hoa khoe sắc trên cây đến vài ba ngày mới héo.
Màu sắc của hoa xƣơng rồng cũng rất đa dạng, gồm có màu trứng, đỏ son, tím lợt,
vàng chanh, vàng cam…
Xin đơn cử một số giống xƣơng rồng với sắc hoa đặc trƣng của nó:
9
- Hoa màu trắng với nhiều chấm đỏ tía điểm xuyết, có giống Turbicarpus,
xuất xứ tại Mexico.
- Hoa màu bang và đỏ sậm có các giống Thelocactus (xuất xứ tại Mexico), và
giống xƣơng rồng ở vùng Texas là Homalocephala.
Về vị trí hoa trổ ra trên cây. Tùy giống mà có sự khác nhau. Thông thƣờng
hoa mọc ra từ kẽ múi, nếu thân có dạng múi. Ngƣợc lại, nếu thân dạng khía thìhoa
mọc ra ở cạnh gai (gai mọc ở mép khía). Ngay chồi con cũng vậy, thân dạng múi
chồi con nẩy ra từ kẻ múi, còn thân dạng khía thì chồi con nẩy ra ở dạng gai.
Cũng có giống xƣơng rồng hoa mọc thành từng cụm ở nách lá, nhƣ các giống
EuphorbiaMilii, Euphorbia ligularia… Có giống hoa mọc trên sẹo của lá nhƣ
xƣơng rồng Euphorbia Antiquorum
Trái xƣơng rồng
Xƣơng rồng có trái hình cầu bên trong không chia thành ngăn hoặc múi và
chứa nhiều hột. Từ lúc xƣơng rồng trổ hoa cho đến ngày trái chín. Tùy giống, ngắn
là một tháng, dài là vài ba tháng.
Hột xƣơng rồng
Trái xƣơng rồng chứa rất nhiều hột. Cây còn nhỏ thƣờng cho trái nhỏ, những
cây trƣởng thành ra trái to hơn. Trong trái nhỏ chứa chừng vài chục hột, còn trái lớn
chứa từ 500 hột trở lên. Kích thƣớc hột rất nhỏ, nhƣ hột é, nhỏ hơn hột mè
(vừng). Tùy giống, khi chín trái già tự động tách vỏ ra để hột bên trong bắn hết ra
ngoài. Nhƣng cũng có giống khi chín, trái cứ đeo dính trên cây, nếu không đƣợc hái
thì chờ đến lúc vỏ trái bị mục hột mới phân tán ra ngoài. Hột vừa chín có thể đem
tốt, kích thích sự ra hoa nhiều hơn và màu sắc hoa đƣợc tƣơi tắn hơn. Do xƣơng
rồng là giống cây có nguồn gốc vùng sa mạc, quanh năm có thời tiết khắc nghiệt
nhất, nên dù có gặp mùa nắng hạn vùng nhiệt đới kéo dài, cây vẫn đủ sức chống
chọi. Nên tƣới nƣớc để giữ đƣợc độ ẩm cần thiết giúp cây sinh trƣởng tốt hơn.
Nhiệt độ
Xƣơng rồng chịu đựng đƣợc nhiệt độ cao, vì vậy trồng xƣơng rồng trong
nhà nhiều ngày liền, lúc nào nhiệt độ cũng khô, nóng nhƣng chúng vẫn sống tƣơi
tốt. Với vùng nhiệt độ thấp, xƣơng rồng vẫn chịu đựng đƣợc, mặc dầu sự sinh
trƣởng có phần chậm lại.
11
Độ ẩm
Độ ẩm không khí cũng rất cần thiết cho sự sinh trƣởng của xƣơng rồng, tuy
nhiên độ ẩm quá thấp lại không tốt.
2.2.5. Bệnh hại trên xƣơng rồng
2.2.5.1. Bệnh thối gốc xƣơng rồng
Là bệnh khá phổ biến và nguy hiểm cho tất cả các loại xƣơng rồng. Bệnh
gây hại chủ yếu là thối gốc hoặc một số vết thƣơng của cây ghép. Ban đầu là các
đốm thối chứa nhiều nƣớc màu xám hoặc nâu đen, các chấm mốc màu đỏ tím hoặc
màu trắng ở nơi tiếp giáp phần bệnh và phần khỏe. Đó là thể quả nấm và chất tiết
của nấm. Khi bệnh lan rộng đến xung quanh thân, cây có thể bị khô mà chết.
Nguyên nhân gây bệnh thối gốc xƣơng rồng là do nấm lƣỡi liềm (Fusarium
oxysporum Schlecht) thuộc lớp nấm bào tử sợi gây ra. Bào tử không màu hình lƣỡi
liềm có 3 – 4 vách ngăn, kích thƣớc 19 – 50 x 2,5 – 5 µm. Nhiệt độ thích hợp cho
nấm sinh trƣởng là 25 – 30°C. (Trần Văn Mão, Nguyễn Thế Nhã, 2002).
Theo Ik Hwa Hyun, Sang Dok Lee và ctv (1998), một loài Fusarium đƣợc
phân lập từ xƣơng rồng có triệu chứng thối rửa ở tỉnh Koyang, Kyonggi năm 1997.
Mầm bệnh này đƣợc xác định là Fusarium oxysporum dựa trên đặc điểm nấm học.
Triệu chứng thối xuất hiện dƣới đất và vòng thƣơng tổn chiếm khoảng 1 – 3 cm
đƣờng kính, xuất hiện trên gốc xƣơng rồng. Hình dạng nấm bệnh có cả dạng tiểu
Rệp sáp hại xƣơng rồng (Diaspis echinocacti Bouche) thuộc bộ cánh đều họ
rệp sáp hình thuẫn. Chúng dùng miệng chích hút để hút nhựa cây xƣơng rồng ảnh
hƣởng đến sinh trƣởng của cây. Mỗi năm phát sinh 2 – 3 lứa, tháng 5 – 7 và tháng
10 năm sau đều có rệp gây hại. (Trần Văn Mão, Nguyễn Thế Nhã, 2002).
2.3. Sự phân loại, phân bố, phạm vi kí chủ, đặc điểm phát sinh phát triển và
khả năng gây bệnh của nấm Fusarium
2.3.1. Sự phân loại
Giới (Kingdom) Fungi
Ngành (Phylum) Ascomycota
Lớp (Class) Sordariomycetes
13
Bộ (Order) Hypocreales
Họ (genus) Fusarium
(Nguồn:http:// en.wikipedia.org/wiki/Fusarium).
Hình 2.1. Hình thái bào tử nấm Fusarium spp.
a. Nấm có dạng hình lƣỡi liềm. b. Vách ngăn.
(Nguồn: />Moulds/Illustrations/Fusarium_drawing.jpg)
Nấm Fusarium thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes), giai đoạn sinh sản
hữu tính là gibberella thuộc lớp nấm nang (Ascomycetes). Có tế bào sinh bào tử
trần. Fusarium đặc trƣng bởi hệ sợi nấm ngăn vách màu trắng hoặc có một số màu
chuối, xoài, nhãn, nho, ổi, cam quýt, đu đủ, bơ…. Ngoài ra, có một số dòng nấm
Fusarium gây bệnh cho ngƣời và động vật nhƣ: gây ung thƣ họng ở ngƣời và ung
thƣ bán cầu đại não trên ngựa và chuột (Thiel, P.G và ctv, 1991).
2.3.4. Đặc điểm phát sinh phát triển của nấm Fusarium
Theo Bugnicourt F. (1939), nấm Fusarium có phổ kí chủ rất rộng trong các
điều kiện khác nhau và có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ 5ºC– 40
0
C.
2.4. Khả năng gây hại của nấm Fusarium spp. và biện pháp phòng trừ
2.4.1. Khả năng gây hại
Lester W. Burgess và ctv, (1988), đại học Sydney (Australila) xác định 13
nhóm, 20 loài gây hại trên một số cây trồng sau:
Copyright: Tài liệu đại học ©