Download miễn phí Khóa luận Quy trình chẩn đoán viêm gan C bằng kỹ thuật PCR Elisa và Real-Time PCR



MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮVIẾT TẮT . iii
DANH MỤC CÁC HÌNH . iv
DANH MỤC CÁC BẢNG . vi
LỜI MỞ ĐẦU . 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀBỆNH VIÊM GAN SIÊU VI C . 3
1.1. Lịch sửphát hiện bệnh . 3
1.2. Đặc điểm của virus gây bệnh viêm gan siêu vi C . 3
1.2.1. Cấu tạo của virus HCV . 3
1.2.2. Cấu trúc genome virus HCV . 4
1.2.3. Cách thức tồn tại và khảnăng gây bệnh . 7
1.3. Triệu chứng lâm sàng . 8
1.3.1. Giai đoạn cấp tính . 8
1.3.2. Giai đoạn mãn tính . 8
1.4. Chẩn đoán. 9
1.5. Dịch tễhọc . 10
1.5.1. Tình trạng nhiễm bệnh viêm gan siêu vi C . 10
1.5.2. Con đường lây bệnh và các biện pháp đềphòng và điều trịbệnh
viêm gan siêu vi C . 11
1.6. Định lượng RNA-HCV trong huyết thanh . 15
1.6.1. Phương pháp PCR ELISA . 15
1.6.2. Phương pháp khuếch đại tín hiệu . 17
1.6.3. Phương pháp PCR . 19
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP . 29
2.1. Vật liệu . 29
2.1.1. Vật liệu sinh học . 29
2.1.2. Hóa chất . 29
2.1.3. Thiết bị- dụng cụ. 30
ii
2.2. Phương pháp . 33
2.2.1. Ly trích RNA . 34
2.2.2. Thực hiện phản ứng phiên mã ngược . 36
2.2.3. Phương pháp PCR ELISA . 37
2.2.4. Phương pháp Real-time PCR . 38
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ- THẢO LUẬN . 41
3.1. Kết quả. 41
3.1.1. Biểu đồkhuếch đại của real-time PCR . 41
3.1.2. Biểu đồ đường chuẩn của real-time PCR . 43
3.2. Thảo luận . 44
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - ĐỀNGHỊ. 46
4.1. Kết luận . 46
4.2. Kiến nghị. 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO
 


http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2013-12-27-khoa_luan_quy_trinh_chan_doan_viem_gan_c_bang_ky_t.tb1ObBgMkQ.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-52619/
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí

Tóm tắt nội dung tài liệu:

viêm
gan C sẽ tùy thuộc vào kết quả của cuộc thử máu này. Nếu genotype được xác
định là loại số 1, bệnh nhân cần điều trị khoảng một năm. Nếu là loại số 2 hay
3, thời gian sẽ là khoảng 6 tháng. Những loại khác có thể phải điều trị từ 6 đến
12 tháng, tùy theo từng trường hợp.
14
Tên Thuốc Công ty Cơ chế tác động
Có trên thị trường
PEG-Interferon-alpha
(Pegasys®)
PEG-Interferron-alpha 2b
(Peg-Intron®)
Ribavirin
Interferon alpha-2a
(Roferon-A )
Interferon alpha-2b
(Intron® A )
Interferon
Đang nghiên cứu
Pha III
Viramidine(Taribavirin)
Interferon –Beta
Zadaxin
Pha II
VX-950
Valoppicitabine (NM283)
SCH503034
Albuferon
Suvus (Methylene blue)
Omega interferon
Multiferon
Actilon (CPG 10101)
Roche
Schering-Plough
Copegas®(Roche),Rebetol®
( Schering Plough), Ribaphere®,
Vilona®,Virazole®
Roche
Schering-Plough
Các hãng thuốc và dạng thuốc generic
khác
Valeant Pharma
Serono
SciClone
Certex
Indenix/Novartis
Schering-Plough
Human Genome Sciences/Novartis
Bioenvision
Intarcia Therapeutics
Viragen/Valentis
Coley
Interferron tác động kéo dài
Interferon tác động kéo dài
Nucleosid ức chế polymerase
Hiệp lực với interferon
Interferron điều trị viêm gan siêu vi B
và một số dạng C
Nucleosid ức chế polymerase
Tiến dược của ribavirin
Interveron-Beta 1a,tác nhân miễn
dịch
Ức chế NS3 serine protease
Nucleosid ức chế polymerase
Ức chế NS3 serine protease
Interferon-alpha gắn kết với albumin)
Xanh methylen
Tác nhân miễn dịch
Interferon tác động kéo dài,đã sử
dụng ở một số quốc gia,ngoại trừ Hoà
Kỳ và chau âu
Chủ vận TLR9 ( Tác nhận miễn dịch)
Bàng 1.1: Các thuốc trên thị trường dùng điều trị viêm gan C và các
thuốc có triển vọng [22]
15
1.6. Định lượng RNA-HCV trong huyết thanh
1.6.1.Phương pháp PCR ELISA [8], [15], 17]
1.6.1.1 Định nghĩa:
ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay - Xét nghiệm hấp thu
miễn dịch liên kết với enzyme) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện sự hiện
diện của kháng nguyên hay kháng thể trong mẫu xét nghiệm.
Phương pháp này dựa vào nguyên lý tính bắt cặp đặc hiệu giữa kháng
nguyên và kháng thể. Do trong thành phần phản ứng có enzyme, khi thêm cơ
chất tương ứng, enzyme sẽ biến đổi cơ chất và tạo tín hiệu có thể xác định được.
Khi virus viêm gan C vào trong cơ thể thì hệ thống miễn dịch của cơ thể
sẽ tạo ra những chất để chống lại việc xâm nhập này, những chất này gọi là
kháng thể. Nếu cơ thể có kháng thể (Anti-HCV) có nghĩa là đã có sự hiện diện
của virus viêm gan C.
Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên kháng thể sẽ quyết định cường
độ màu ánh sáng phát ra.
1.6.1.2 Phương pháp xét nghiệm virus HCV bằng ELISA
Có 2 cách :
+ Phương pháp gián tiếp là phương pháp miễn dịch, nghĩa là qua
phản ứng kháng nguyên kháng thể ta sẽ xác định được kiểu của kháng thể, từ đó
biết được type huyết thanh của siêu vi C (HCV serotype)
+ Phương pháp trực tiếp dựa trên sự phân tích trực tiếp trên gen của
siêu vi C để xác định kiểu gen của siêu vi C (HCV genotype).
Ưu điểm của kỹ thuật này là đơn giản, không sợ nguy cơ ngoại nhiễm và
có thể thực hiện hoàn toàn trên máy tự động. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn
còn ít nhiều nhược điểm như không định được chi kiểu (subtype), không biết
được tình trạng bệnh nhân có hay không có HCV-RNA (tình trạng siêu vi đang
tăng sinh để điều trị đặc hiệu), ở bệnh nhân bị ức chế hay suy giảm miễn dịch sẽ
không có anti HCV từ đó không xác định được loại HCV, không phân biệt được
16
giữa anti HCV nhiễm trước đây còn tồn tại và loại HCV đang nhiễm. Và một
điều cực kỳ quan trọng là sự phù hợp giữa type huyết thanh và kiểu gen vẫn còn
nhiều khác nhau. Dễ bị dương tính giả, chi phí cao.
Hiện nay, người ta kết hợp phương PCR với phương pháp ELISA để phát
hiện virus HCV, người ta hay gọi là phương pháp PCR-ELISA. Để nhân bản
cDNA được tách chiết từ RNA HCV trong huyết thanh người bệnh, sau đó ta
cho vào trong vi giếng tiến hành xét nghiệm.
Hình 1.7. Các vi giếng của microtiter plate chứa kháng nguyên
*Phương pháp PCR-ELISA:
Dưới sự xúc tác của enzyme kết hợp với kháng thể kháng digoxigenin.
Đầu tiên, người ta tách chiết HCV RNA từ huyết thanh và chuyển thành cDNA
nhờ enzyme phiên mã ngược, cDNA này được dùng làm bản mẫu (template) cho
phản ứng PCR. Trong thành phần của phản ứng PCR, một trong hai primer sẽ
được đánh dấu ở đầu 5’ với biotin, như vậy, sản phẩm PCR tạo ra sẽ có một
mạch được đánh dấu biotin ở đầu 5’. Sau bước nhân bản, sản phẩm PCR được
biến tính thành dạng mạch đơn và được cho vào các vi giếng. Mặt trong mỗi vi
giếng được phủ streptavidin là một protein có ái lực đặc biệt cao đối với biotin sẽ
giữ các mạch mang bitotin ở đầu 5’. Tiếp theo, người ta cho probe đặc hiệu cho
HCV vào vi giếng và tiến hành phản ứng lai. Probe này được đánh dấu ở đầu 3’
với digoxigenin sẽ bắt cặp bổ sung với mạch mang biotin ở đầu 5’. Phức hợp
kháng thể kháng digoxigenin-alkaline phosphatase được cho vào và ủ trong một
thời gian thích hợp, phần dư thừa sẽ được loại bỏ. Phản ứng màu sẽ xuất hiện khi
17
cơ chất hiện màu của alkaline phosphatase được cho vào. Cường độ màu tương
ứng với hàm lượng sản phẩm PCR có trong mẫu.
Việc định lượng HCV RNA có trong mẫu được thực hiện bằng cách quy
giá trị cường độ màu ở mỗi vi giếng vào một đường chuẩn xây dựng từ những
mẫu có nồng độ HCV RNA biết trước. Phương pháp này có khả năng phát hiện
HCV với nồng độ là 600 IU/ml. Độ tuyến tính của phương pháp nằm trong
khoảng 600 IU/ml đến 850.000 IU/ml.
Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt
cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu.
Nhưng phương pháp này rất hạn chế do KN không đặc hiệu sẽ ảnh hưởng
đến kết quả xét nghiệm.
1.6.2. Phương pháp khuếch đại tín hiệu [12], [14]
Phương pháp khuếch đại tín hiệu: là phương pháp phát hiện và định lượng
RNA bằng kỹ thuật lai và khuếch đại tín hiệu. Bộ gen virus lúc đầu được lai vào
một giá, thì các bộ dò oligonucleotide liên kết/bắt cặp đặc hiệu, sau đó tín hiệu
phát ra bởi các phân tử lai được khuếch đại và đo lường. Có hai kỹ thuật hay sử
dụng:
+Kỹ thuật DNA nhánh (Branched DNA technology)
+Phương pháp bắt giữ lai (hybrid capture)
1.6.2.1. Kỹ thuật DNA nhánh-bDNA (Branched DNA technology)
Trong xét nghiệm này, mẫu dò lai với acid nucleic đích không khuếch đại
trước. Có sự gia tăng tín hiệu lai đáng kể, thường được thêm vào bộ khuếch đại
bDNA (bDNA Amlifier). RNA được lai với các probe đặc hiệu. Sau đó, phức
hợp RNA HCV – probe được cố định trên một vi giếng (microwell) và tiếp tục
được lai với các probe khuếch đại tín hiệu, mỗi probe này liên kết với nhiều phân
tử alkline phosphatase (Hình 1.8). Cuối cùng, cơ chất của enzyme được cho vào
vi giếng và tín hiệu hóa quang (chemiluminescent) sẽ được thu nhận bởi máy
đọc tín hiệu ánh sáng.
18
Hình 1.8. Kỹ thuật bDNA nhánh
Trong phương pháp định lượng bằng bDNA thì việc thiết kế các probe
mục tiêu là vô cùng quan trọng. Cả hai lọai probe (probe cố định RNA HCV vào
vi giếng và probe ...

---