Download miễn phí Bài giảng Công nghệ sinh học trong bệnh cây
MỤC LỤC
Giới thiệu CNSH trong bệnh cây 6
1.1. Khái niệm về công nghệ sinh học 6
1.2. Công nghệ sinh học trong bệnh cây 6
Chương 1. Di truyền quần thể trong bệnh cây 7
1. Sinh học quần thể của tác nhân gây bệnh 7
2. Tiến hóa 7
2.1. Tiến hóa 7
2.2. Sinh học tiến hóa: Di truyền quần thể và phả hệ trong bệnh cây 7
3. Năm lực tiến hóa (Five Evolutionary Forces) 8
4. Đột biến 8
4.1. Định nghia 8
4.2. Vai trò 8
4.3. Một mô hình đột biến đơn giản 8
4.4. Đột biến trong tác nhân gây bệnh cây 9
4.5. Đột biến và chiến lược tạo giống kháng 9
5. Trôi dạt di truyền 10
5.1. Định nghĩa 10
5.2. Đặc điểm 10
5.3. Nguyên nhân 10
5.4. Đo trôi dạt di truyền 10
5.5. Trôi dạt di truyền làm giảm đa dạng di truyền và dẫn tới phân chia quần thể 10
5.6. Trôi dạt di truyền trong tác nhân gây bệnh cây 11
5.7. Ví dụ trôi dạt di truyền trong bệnh cây 11
6. Giao lưu gene và kiểu gen (Gene and Genotype Flow) 11
6.1. Định nghĩa. 11
6.2. Đặc điểm 11
6.3. Giao lưu gen (gene flow) và giao lưu kiểu gen (genotype flow) 11
6.4. Phân chia quần thể và giao lưu gen 11
6.5. Ví dụ giao lưu gen trong bệnh cây 13
6.6. Mối liên hệ giữa trôi dạt di truyền và giao lưu gen 13
6.7. Khái niệm siêu quần thể và tác nhân gây bệnh 14
7. Hệ thống sinh sản/ghép cặp (Reproductive/Mating Systems) 14
7.1. Đánh giá cấu trúc di truyền trong quần thể 14
7.2. Hệ thống sinh sản và ghép cặp của các tác nhân gây bệnh cây 16
7.3. Đa dạng gen và đa dạng kiểu gen 17
7.3.1 Đa dạng gen 18
7.3.2 Đa dạng kiểu gen 18
7.3.3 Ví dụ đo đa dạng gen và đa dạng kiểu gen 18
8. Chọn lọc tự nhiên 20
8.1. Khái niệm 20
8.2. Hai mô hình chọn lọc 20
9. Tương tác giữa các lực tiến hóa và cấu trúc di truyền của quần thể tác nhân gây bệnh 20
9.1. Tương tác giữa đột biến và chọn lọc 20
9.2. Tương tác giữa tái tổ hợp và chọn lọc 21
9.3. Tương tác giữa trôi dạt di truyền, giao lưu kiểu gen và chọn lọc 21
9.4. Tương tác giữa chọn lọc và giao lưu kiểu gen 21
9.4.1 Tương tác giữa tái tổ hợp và giao lưu gen 21
9.5. Ứng dụng di truyền quần thể để đánh giá các nguy cơ do tiến hóa của tác nhân gây bệnh 22
Chương 2. Lựa chọn vùng gen của tác nhân gây bệnh 25
1. Bộ gen của tác nhân gây bệnh 25
1.1. Bộ gen viroid 25
1.2. Bộ gen virus 25
1.3. Bộ gen vi khuẩn và phytoplasma 26
1.4. Bộ gen nấm 26
2. Chọn vùng gen nghiên cứu 26
2.1. Chọn vùng gen virus 26
2.2. DNA ribosome 27
2.2.1 Cấu trúc và chức năng RNA ribosome 27
2.2.2 Vai trò của rDNA trong phân loại và nghiên cứu đa dạng và chẩn đoán 27
2.3. Gen mã hóa 28
2.4. Các chuỗi lặp 28
2.4.1 Các chuỗi lặp liền kề (tandem repetitive sequences) 28
2.4.2 Các chuỗi lặp phân bố rải rác (Dispersed repetitive sequences) 28
2.5. DNA ti thể (mitochondrial DNA) 28
Chương 3. Các kỹ thuật CNSH trong nghiên cứu bệnh cây 28
1. Các marker di truyền 29
1.1. Định nghĩa 29
1.2. Phân loại 29
2. Các loại marker phân tử 29
3. Kỹ thuật dựa trên lai phân tử: RFLP 30
3.1. RFLP: các chú ý về kỹ thuật 30
3.1.1 RFLP: Các ưu điểm chính 30
3.1.2 RFLP: Các hạn chế chính 30
4. Các kỹ thuật dựa trên PCR 31
5. Các kỹ thuật dựa trên PCR dùng mồi tùy ý: RAPD, AP-PCR và DAF 31
5.1. RAPD 31
5.1.1 RAPD: nhược điểm 31
5.2. DAF 31
5.3. AP-PCR 32
6. Kỹ thuật dựa trên PCR dùng mồi tùy ý: AFLP 32
6.1. AFLP: các bước 32
6.2. AFLP: ưu điểm 32
6.3. AFLP: nhược điểm 32
7. Kỹ thuật dựa trên PCR dùng mồi tùy ý: ISSR 32
8. Kỹ thuật dựa trên PCR dùng mồi đặc hiêu: SSR (=Microsatellites) 33
8.1. Phân loại microsatellite 33
8.2. Đặc điểm di truyền của microsatellite 33
8.3. Cơ chế tạo đột biến của microsatellite 33
8.4. Phân bố của microsatellite 35
8.5. Trình tự phân tích microsatellite 35
8.6. Microsattelite: ưu điểm chính 37
8.7. Microsattelite: nhược điểm chính 37
9. Marker EST (expressed sequence tags) 37
10. Kỹ thuật CAPS 37
11. Kỹ thuật SNP 37
12. Kỹ thuật rep-PCR 38
13. Tóm tắt các kỹ thuật 38
Chương 4. Phân tích kết quả dựa vào số liệu băng điện di 40
1. Giới thiệu 40
2. Các bước chính trong phân tích đa dạng dựa trên băng điện di 41
2.1. Mô tả sự đa dạng 41
2.2. Tính toán mối quan hệ giữa các đơn vị được phân tích ở bước trên 41
2.3. Biểu diễn mỗi quan hệ 41
3. Lượng hóa mức đa dạng: đo đa dạng trong quần thể 41
3.1. Dựa trên số lượng biến dị 41
3.1.1 Mức đa hình hay tỷ lệ đa hình (Pj) 41
3.1.2 Tỷ lệ các locus đa hình (P) 41
3.1.3 Số allele trung bình trên locus 41
3.2. Dựa vào tần số biến dị 42
3.2.1 Số lượng allele hiệu quả (Ae) 42
3.2.2 Mức dị hợp tử kỳ vọng trung bình (H = mức đa dạng di truyền Nei (D) 42
3.3. Ví dụ tính đa dạng di truyền trong quần thể dùng 1 marker đồng trội 43
3.4. Ví dụ 43
3.4.1 Các bước tính (bảng dưới) 43
3.5. Ví dụ tính đa dạng di truyền trong quần thể dùng 1 marker trội 44
3.5.1 Ví dụ 44
3.5.2 Các bước tính (bảng dưới) 44
4. Lượng hóa mối quan hệ di truyền: khoảng cách di truyền (nghĩa rộng) 45
4.1. Đánh giá các mối quan hệ dựa theo khoảng cách hình học 46
4.1.1 Các phương pháp phổ biến tính hệ số tương đồng S (similarity) dựa trên biến nhị thức (0, 1) 46
5. Phần mềm 47
Chương 5. Phân tích đa dạng, phân loại dựa trên trình tự DNA 47
1. Các thuật ngữ/khái niệm 47
2. Giải trình tự chuỗi DNA (sequencing) 47
2.1. Giới thiệu 47
2.2. Sequencing dùng BigDye Terminator 47
3. Tìm kiếm chuỗi có quan hệ gần trên ngân hàng gen 48
3.1. Ngân hàng gen (Genbank) và NCBI 48
3.2. Tìm kiếm chuỗi DNA trên GenBank bằng phần mềm BLAST 48
4. So sánh trình tự 49
4.1. Căn trình tự đa chuỗi bằng phần mềm ClustalX 50
4.2. Xác định mức đồng nhất (sequence identity) bằng phần mềm Bioedit 50
4.3. Xác định khoảng cách di truyền (genetic distance) 51
4.3.1 Khái niệm khoảng cách di truyền phân tử 51
4.3.2 Mô hình thay thế nucleotide (subtituation model). 51
4.3.3 Ví dụ tính khoảng cách di truyền dựa trên 5 chuỗi 16S RNA vi khuẩn dùng phần mềm MEGA 53
5. Xây dựng cây phả hệ 54
5.1. Maximum parsimony 54
5.2. Maximum likelyhood 55
5.3. Phương pháp khoảng cách (Distance) 55
5.4. Ví dụ xây dựng cây phả hệ của chuỗi các chuỗi 16S RNA vi khuẩn dùng phần mềm MEGA 58
Chương 6. Công nghệ microarray (chip gen) 59
1. Giới thiệu 59
2. Các loại microarray DNA 60
2.1. Microarray với các dò oligonucleotide ngắn 60
2.2. Microarrays với dò oligonucleotide dài 60
2.3. Microarrays với dò cDNA 60
3. Các phương pháp cố định dò trong microarray DNA 60
3.1. Tổng hợp trực tiếp ngay trên giá đỡ (in situ) 60
3.2. Tạo microarray bằng spotting 60
4. Gán nhãn dò 60
4.1. Gán nhãn trực tiếp 61
4.2. Gán nhãn gián tiếp 61
4.3. Gãn nhãn dùng dendrimer 61
5. Vật liệu để cố định dò 61
6. Các phương pháp gắn dò vào lam kính 61
7. Ứng dụng microarray DNA 61
7.1. Nghiên cứu biểu hiện gen “gene expression profiling” 61
8. Chẩn đoán và nghiên cứu kiểu gen (genome typing) 62
Chương 7. Công nghệ RNA interference 62
1. Lịch sử phát hiện 62
1.1. Hiện tượng đồng ức chế 62
1.2. Hiện tượng chế ngự (quelling) 63
1.3. Hiện tượng câm gen cảm ứng bởi virus 63
1.4. RNA Interferrence 63
2. Small interfering RNA (siRNA) và microRNA (miRNA) 63
2.1. miRNAs - khám phá 63
2.2. miRNAs - định nghĩa 63
2.3. miRNAs – nguồn gốc 63
2.4. miRNAs – sinh tổng hợp 63
2.5. siRNAs - khám phá 64
2.6. siRNAs - định nghĩa 64
2.7. siRNAs – nguồn gốc 64
2.8. siRNAs – sinh tổng hợp 64
3. So sánh miRNA và siRNA 64
3.1. Giống nhau 64
3.1.1 Khác nhau 64
4. Công nghệ RNAi trong tạo giống kháng bệnh virus 64
4.1. Giới thiệu 64
4.2. Các đặc điểm chính trong công nghệ RNAi dựa trên siRNA 65
4.2.1 Thiết kế cấu trúc chuyển gen 65
4.2.2 Chọn chuỗi gen virus 66
5. Ví dụ công nghệ RNAi kháng bệnh virus 66
5.1. Tạo cây chuyển gen kháng PVY thông qua RNA silencing 66
5.1.1 Giới thiệu. 66
5.1.2 Thiết kế cấu trúc chuyển gen (hình) và chuẩn bị dòng vi khuẩn chuyển gen 67
5.1.3 Biến nạp cấu trúc chuyển gen vào cây khoai tây 67
5.1.4 Các phân tích chính cây chuyển gen 67
5.2. Tạo cây chuyển gen kháng TYLCV thông qua RNA silencing 68
5.2.1 Giới thiệu. 68
5.2.2 Thiết kế cấu trúc chuyển gen (hình) và chuẩn bị dòng vi khuẩn chuyển gen 68
5.2.3 Biến nạp cấu trúc chuyển gen vào cây khoai tây 69
5.2.4 Các phân tích chính cây chuyển gen 70
6. Sử dụng công nghệ microRNA trong phòng chống bệnh virus 70
6.1. Dùng công nghệ miRNA tạo tính kháng CMV 70
6.1.1 Giới thiệu 70
6.1.2 Thiết kế cấu trúc miRNA chuyển gen 71
6.1.3 Chuyển gen vào cây thuốc lá 73
6.1.4 Lây nhiễm nhân tạo 73
6.1.5 Đánh giá cây chuyển gen được lây nhiễm CMV dựa trên triệu chứng 73
6.1.6 Phân tích miRNA trên cây chuyển gen 73
6.1.7 Phân tích RNA của CMV trên cây lây nhiễm 73
6.1.8 Phân tích virion CMV trên cây lây nhiễm 73
Chương 8. PCR trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh 74
1. Tóm tắt kỹ thuật 74
2. Thiết kế và lựa chọn mồi (primer) 74
2.1. Tự thiết kế mồi 75
2.1.1 Các chú ý khi thiết kế mồi 75
2.1.2 Thiết kế mồi chung (degenerate primer) 75
2.1.3 Phần mềm 76
2.2. Ví dụ mồi chung 76
Chương 9. Công nghệ huyết thanh học trong chẩn đoán 76
1. Cơ sở của phản ứng huyết thanh học 76
2.3. Các khái niệm 76
2.3.1 Kháng nguyên (antigen): 77
2.3.2 Nhóm quyết định kháng nguyên (epitope) 77
2.3.3 Kháng nguyên của tác nhân gây bệnh cây 77
2.3.4 Kháng thể (antibody) 77
2.4. Kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng 78
3. Sản xuất kháng thể đơn dòng 78
3.1. Các bước chính để sản xuất kháng thể đơn dòng gồm 78
3.2. Qui trình tạo kháng thể đơn dòng 79
3.2.1 Gây miễn dịch trên thỏ 79
3.2.2 Dung hợp (lai) 79
3.2.3 Sản xuất 80
4. Kỹ thuật chẩn đoán bằng ELISA 80
4.1. Vật liệu chính cho ELISA 80
4.2. Các kỹ thuật ELISA. 80
4.2.1 Kỹ thuật ELISA trực tiếp kiểu kẹp kép kháng thể (DAS-ELISA) 81
4.2.2 Phản ứng ELISA gián tiếp kiểu bẫy kháng nguyên trước (PTA-ELISA) 81
http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2013-12-27-bai_giang_cong_nghe_sinh_hoc_trong_benh_cay.fDgAzfNbd5.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-52442/Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
ng mã hóa và 3’UTR.
Tần số thay đổi theo đơn vị phân loại (theo nghĩa số lượng tuyệt đối các loci microsatellite và motif của chuỗi lặp). Ở thực vật, tần số microsatellite cao ở thực vật có bộ gen nhỏ (vd 0.85% ở cây Arabidopsis) và thấp hơn ở cây có bộ gen lớn (vd 0.37% ở ngô). Tần số = 1.07% ở nhiễm sắc thể 22 của người và 0.21% ở tuyến trùng Caernorhabditis elegans.
Trình tự phân tích microsatellite
Thực hiện một phân tích microsatellite không đơn giản như đối với các phân tích dùng mồi ngẫu nhiên hay ISSR. Có nhiều kỹ thuật microsatellite khác nhau nhưng phổ biến nhất là PCR sử dụng 2 mồi F và R được thiết kế ở một locus bảo thủ ở 2 phía của của microsatellite. Như vậy cặp mồi này có thể được áp dụng cho mọi cá thể của loài và tạo ra sản phẩm PCR có kích thước khác nhau nếu microsatellite của các cá thể là khác nhau (hình ). Tuy nhiên để có được bộ mồi thích hợp không hề dễ dàng vì microsatellite phải được phân lập trước.
Hình Phát hiện microsatellites từ DNA genome. Hai mồi F và R (mũi tên xám) được thiết kế ở 2 bên vùng microsatellite. Nếu không có microsatellite => có sản phẩm 100 bp. Giả sử có một microsatellite với chuỗi lặp CA và n = 8 (dài 16 bp) thì sản phẩm PCR có kích thước = 116 bp.
Các bước chính trong phân tích microsatellite bao gồm
Xây dựng thư viện microsatellite
Xác định loci microsatellite duy nhất
Xác định vùng thích hợp để thiết kế mồi
Thử PCR
Đánh giá và diễn giải các băng
Đánh giá sản phẩm PCR tao sự đa hình.
Xây dựng thư viện microsatellite. Đây là bước phức tạp, tốn công sức nhất. Các bước cụ thể gồm:
Tinh chiết DNA genomic
Cắt sản phẩm DNA genome bằng RE.
Điện di sản phẩm cắt bằng agarose nồng độ thấp (khoảng 0.7%). Chọn vùng điện di chứa các băng trong khoảng 300 – 700 bp. Tinh chiết các băng khỏi gel agarose.
Clone các băng (dùng TA vector hay adapter) vào E.coli.
Chọn lọc các clone (+, có khả năng chứa microsatellite) bằng Southen blot với dò chứa các chuỗi lặp.
Giải trình tự các clon +.
Sau khi đã biết trình tự các clone, các mồi đặc hiệu sẽ được thiết kế và thử PCR.
Vì xây dựng thư viện microsatellite theo phương pháp truyền thống rất tốn công sức (có thể mất 1 tháng để hoàn thành), hơn nữa năng suất lại không cao nên đã có nhiều kỹ thuật khác được áp dụng. Chẳng hạn, trong một kỹ thuật gọi là PIMA (PCR isolation of microsatellite arrays), thay vì cắt sản phẩm DNA genome và clone, người ta thực hiện RAPD dùng mồi ngẫu nhiên. Các sản phẩm RAPD được clone và kiểm tra bằng mồi đặc hiệu chuỗi lặp và mồi đặc hiệu vector. Kỹ thuật PIMA dựa trên cơ sở là các sản phẩm RAPD thường chứa nhiều microsatellite hơn các sản phẩm cắt ngẫu nhiên. Kỹ thuật PIMA có thể giảm thời gian xuống còn 1 tuần.
Hình. Sơ đồ trình bày các bước thiết lập marker microsatellite. Bên trái là sơ đồ truyền thống và bên phải là sơ đồ PIMA (Zane et al., 2002).
Bước tiếp theo là chọn các marker satellite tốt nhất và tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR. Mục tiêu là để cân bằng giữa giữa yêu cầu đặc hiệu cao và năng suất của sản phẩm PCR. Ngoài ra còn cần xét đến khả năng nhận được sản phẩm từ nhiều loci microsatelitte khác nhau với kích thước không trùm (overlap) lên nhau. Hiệu quả của microsatellite phụ thuộc vào sự phong phú của các chuỗi lặp vì càng nhiều chuỗi lặp khác nhau thì càng dễ chọn lựa marker thích hợp.
Nhìn chung, các nhà nghiên cứu thích dùng các mồi nhằm vào các đoạn microsatellite với 3 hay 4 nts lặp (để tránh hiện tượng hình thành các băng “stutters” thường bắt gặp ở các microsatellite 2 nts).
Microsattelite: ưu điểm chính
Là marker đồng trội => cực kỳ tuyệt vời cho phân tích di truyền quần thể đối với các sinh vật giao phối.
Có thể tự động hóa nếu mồi được gán nhãn huỳnh quang và được phân tích trên máy sequencer tự động.
Nếu bộ mồi đã được lựa chọn thì việc áp dụng tương đối dễ dàng.
Microsattelite: nhược điểm chính
Như đã trình bày, việc xây dựng thư viện microsattelite và chọn lựa mồi thích hợp là cực kỳ tốn kém công sức và tiền bạc.
Các sản phẩm PCR trong phân tích microsatellite thường có kích thước nhỏ (một vài trăm bp) và chênh lêch kích thước nhiều khi không nhiều dẫn tới phải điện di agarose nồng độ cao (~3 %) hay điện di polyacrylamide hay phân tích dùng máy sequencer tự động (đắt).
Marker EST (expressed sequence tags)
Mỗi gen phải được phiên mã sang messenger RNA (mRNA) trước khi dịch mã sang protein. Tuy nhiên vì mRNA rất không bền bên ngoài tế bào nên các nhà khoa học phải chuyển nó sang dạng DNA bổ trợ (cDNA = complementary DNA). Ngay sau khi cDNA đã được phân lập, các nhà khoa học có thể giải trình tự vài trăm nts đầu 5’ và đầu 3’ của nó để tạo ra các nhãn chuỗi biểu hiện 5’ETS hay 3’ ETS (expressed sequence tags). 3’ETS thường nằm trong vùng không mã hóa (intron) hay UTR nên có xu hướng kém bảo thủ giữa các loài hơn.
EST đầu tiên được sử dụng để xác định các transcripts nhưng dần trở thành công cụ để khám phá gen nhằm có được thông tin về biểu hiện và điều hòa gen và để phát triển các marker phân tử như EST-based RFLPs, SSRs, SNPs, và CAPS.
ESTs đã được sử dụng để thiết kế các dò cho microarray DNA; phát triển các marker RFLP đơn hay có số copy thấp. Các marker RFLP xây dựng từ EST đã được sử dụng rộng rãi để xây dựng các bản đồ liên kết di truyền mật độ cao. Thông thường, các marker RFLP dựa trên EST cho phép thiết lập bản đồ liên kết có khả năng so sánh giữa các loài vì vùng mã hóa thường bảo thủ. Do vậy, phát triển một marker cho 1 loài có thể sử dụng sô liệu của loài khác đã có sẵn.
EST cũng cho phép tính toán để phát triển các marker SSR hay SNP. Các phần mềm tìm kiếm mô hình (pattern) cho phép xác định các chuỗi lặp SSR trong EST. Thông tin trình tự nucleotide sẵn có cho phép thiết kế các cặp mồi để kiểm tra tính đa hình của đối tượng nghiên cứu. Khoảng 1 -5% các EST ở nhiều loài cây có các SSR có độ dài thích hợp (>=20 bp). Có thể tìm một số lượng lớn SSR của một đối tượng nếu nhiều EST của nó đã được xác định. Ví dụ Kantety et al. (2002) đã tiềm kiếm các SSR với chuỗi lặp 2,3 và 4 nucleotid với độ dài tối thiểu 18 nucleotid) từ 262,631 EST của 5 loài cây (ngô, lúa, lúa mỳ, lúa miến và yến mạch) sẵn có trên cơ sở dữ liệu và phát hiện thấy rằng 3,2% EST chứa SSR. Các SSR dựa trên EST thường liên kết với các vùng phiên mã bảo thủ trong loài hơn là liên kết với các vùng không phiên mã; do đó, các SSR này có thể áp dụng trên các đối tượng thuộc cùng chi. Các SSR dựa trên EST cũng có khả năng cao hơn trong đánh giá sự biểu hiện khác nhau của gen so với các SSR dựa trên genome ngẫu nhiễn khác.
Kỹ thuật CAPS
CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) là một kỹ thuật kết hợp giữa PCR và RFLP nên còn có tên nguyên thủy là PCR-RFLP. Kỹ thuật rất đơn giản và gồm 2 bước: (1) PCR để nhân một đoạn genome quan tâm và (2) tiếp theo, dùng RE thích hợp để cắt sản phẩm PCR. Do vậy, CAPS phụ thuộc vào mô hình cắt bằng RE.
Ưu điểm
Đơn giản: chỉ PCR và cắt bằng RE (không cần phát triển dò và lai phân tử như RFLP)
Chủ yếu di truyền đồng trội.
Nhược điểm
Khả năng phát hiện đa hình DNA không...
