Thử nghiệm tác dụng tăng cường miễn dịch in
vitro của các chế phẩm cây trinh nữ hoàng
cung

Phạm Huy Cường

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Đô
Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Xác định biểu lộ của IL-2 và TNF-α ở mức độ mARN và protein của tế bào
lympho nuôi cấy in vitro của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng giai đoạn muộn và
người bình thường về lâm sàng với hai liều thuốc khác nhau. Đánh giá tác dụng tăng
cường miễn dịch của Crilin T so với Levamisol. Cần phải tăng số mẫu nghiên cứu để
có thể đánh giá chính xác. Thử tác dụng thuốc ở liều lượng khác nhau hơn. Xây dựng
mô hình thực nghiệm ung thư do hóa chất để thử tác dụng miễn dịch in vitro

Keywords: Sinh học; Sinh học thực nghiệm; Miễn dịch; Cây Trinh nữ hoàng cung

Content
MỞ ĐẦU

Trinh nữ hoàng cung (THNC) là một loại cây thuốc được sử dụng là thuốc cổ truyền ở
nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới. TNHC (Crinium latifolium (L.) đã
được dùng như loại thuốc y học cổ truyền để điều trị các bệnh Viêm khớp dạng thấp, ung thư,
lao, viêm do vi khuẩn sinh mủ.
Viên nang Crila biệt dược của Nguyễn Thị Ngọc Trâm, chiết từ lá cây Trinh nữ Crila
được sản xuất từ các alkaloid có hoạt tính sinh học.
Các phân đoạn đã chứng minh là có tác dụng tăng cường miễn dịch và chống ung thư
mạnh nhất (gồm các alkaloid và flavonoid) cũng đã được chiết và làm thành viên nén có tên là

Hình 1.1. Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)

1.1.1. Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L.
Các nhà khoa học Ấn Độ, Nhật Bản và Việt Nam đã nghiên cứu thành phần hóa học của
cây náng có tên khoa học Crinum latifolium L
 Thành phần alkaloid của cây Crinum latifolium L.
+ Crinum latifolium L. Ấn Độ: 11-O-Acetylambelline, 11-O-Acetyl-1,2--
epoxyambelline, Ambeline, Crinafolidine, Crinafoline, (-) 2-Epilycorine, 2-Epipancrassidine,
1,2--epoxyambelline, Hippadine (Pratorine, Alkalois N3), Latindine, Latisodine, Latisoline
(Latisodine-O--D-glucopyranosyl), (-) Lycorine, (-) Lycorine-1-0--glucoside, Pratorimine,
Pratorinine, Pratosine, Pseudolycorine-1-0--D-glucpside.
+ Crinum latifolium L. Nhật Bản: 3-O-Acetylhamayne, (-) Acetyllycorine, Cherylline
(S), (+) Crinamine, (-) Crinine (Vittatine, Crinidine), Hamayne (Bulbispermine,
Demethylcrinamine), Hipeastrine, Latifine (S), Powelline, Undulatine.

3
+ Cây TNHC Việt Nam với tên mới là Trinh nữ Crila (Crinum latifolium L.): 9-
Octadecenamide
b
, Dihydro-oxo-demethoxyhaemanthamine, Augustamine, Oxoassoanine,
Crinane-3--ol, Buphannidrine, Powelline, Undulatine, Ambelline, 6-hydroxybuphannidrine,
1,2-epoxyambelline, 6-hydroxycrinamidine, Epoxy-3,7-dimethoxycrinane-11-one, Lycorin và
Pratorin (Hippadin) và các flavonoid: 4’7-dihydroxy-3-vinyloxyflavan, 4’7-dihydroxyflavan,
kaemperol-3-O--glucopyranoside.
 Thành phần hóa học khác của cây Crinum latifolium L.
+ Crinum latifolium L. Nhật Bản có Glucan a và Glucan b.
+ Cây TNHC Việt Nam (Crinum latifolium L.) có 32 chất bay hơi và saponin, acid
hữu cơ, amino acid, p-hydroxycinnamat metyl, 3,4’-dihydroxycinnamat ethyl, keampferol-3-
4-di-O--D-glucopyranosit.
1.1.2. Tình hình nghiên cứu cây TNHC ở Việt Nam


4
1.3. Tình hình nghiên cứu về thuốc điều trị suy giảm miễn dịch
Tình trạng suy giảm miễn dịch có thể gặp ở hầu hết các loại bệnh lý do đó phạm vi chỉ
định dùng thuốc kích thích miễn dịch rất rộng rãi. Vì vậy từ khi phát hiện ra chất kích thích
miễn dịch thì các nghiên cứu về chúng phát triển cả về chiều rộng lẫn chiều sâu.
1.3.1. Vai trò của các cytokin
Một hệ thống phức tạp như hệ thống miễn dịch muốn hoạt động được cần phải có sự
tương tác giữa các tế bào. Để thực hiện được sự tương tác, các tế bào đó phải nhận biết được
và truyền đi các thông tin, với vai trò trung gian của các thụ thể. Các thông tin được mang tới
bởi những protein hay peptid rất nhỏ gọi là cytokin
1.3.2. Một số cytokin liên quan đáp ứng miễn dịch chống ung thư
1.3.2.1. Interleukin-2 (IL-2)
Năm 1976 một lymphokin gây phân bào giúp cho lympho bào tăng sinh và duy trì
trong các mẫu nuôi cấy lympho T bình thường gọi là IL-2. IL-2 là một polypeptide có 133
acid amin và TLPT khoảng 15kD do tế bào Th1 hoạt hóa sản xuất ra.
1.3.2.2. Yếu tố hoại tử u - Tumor Necrosis Factor alpha (TNFα)
TNFα được sản xuất chủ yếu bởi đại thực bào sau đó đi vào máu rồi đến các mô và cơ
quan khác, TNFα còn được tổng hợp trong các tế bào giết tự nhiên (NK), các tế bào u hắc tố
và một vài dòng tế bào ung thư.
1.3.3. Levamisole - thuốc điều trị suy giảm miễn dịch
Trên thực tế cũng như lâm sàng levamisole đã có rất nhiều nghiên cứu ứng dụng. Đến
nay levamisol vẫn là thuốc kích thích miễn dịch cổ điển mà các nghiên cứu đã làm sáng tỏ
mọi vấn đề về cơ chế tác dụng, công thức hóa học, cấu trúc phân tử. Vì vậy, Levamisol được
sử dụng trong thực nghiệm nuôi cấy tế bào lympho máu ngoại vi in vitro của công trình này,
với vai trò là chứng dương.
1.3.4. Tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư của TNHC
Một số alkaloid của TNHC: Crinafolin và crinafolidin đã được Ghosal (1985) thử
nghiệm với tế bào ung thư và cho kết quả tốt.
Phan Thị Phi Phi và cs (2003), sử dụng mô hình chiếu xạ bán cấp để đánh giá khả

 Kỹ thuật RT-PCR
 Kỹ thuật ELISA định lượng IL-2 và TNFα trong dịch nuôi cấy tế bào
lympho Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kiểm tra chất lƣợng ARN chiết tách đƣợc
Chúng tôi kiểm tra bằng phản ứng RT-PCR với mồi của gen B2M thì vẫn cho kết quả
dương tính với các băng đậm rõ nét (Hình 3.1A). Như vậy việc xác định sự biểu lộ các gen
IL-2 và TNFα bằng phản ứng RT-PCR có độ nhạy cao là khả quan.
3.2. Phản ứng RT-PCR đơn mồi của gen B2M, IL-2 và TNFα
Các cặp mồi này đều được khuếch đại đơn mồi với các tế bào dòng CTLL-2 (IL-2) và L929
(TNFα), chúng đều được thử điều kiện tối ưu và cho kết quả dương tính với 01 băng duy nhất cho
mỗi gen nghiên cứu và gen nội chuẩn B2M (Hình 3.1 A, B, C).

6

Hình 3.1. RT-PCR đơn mồi xác định biểu lộ các gen B2M, IL-2 và TNFα ở các tế bào dòng
chuẩn
3.3. Phản ứng RT-PCR đa mồi của gen B2M với IL-2/TNFα
Các cặp mồi sẽ được khuếch đại đồng thời và tránh được sự gắn mồi không đặc hiệu
và tạo ra nhiều sản phẩm không mong muốn. Kết quả cho thấy không có băng không đặc hiệu
(Hình 3.2 A và 3.2 B).

Hình 3.2. Hình ảnh PCR đa mồi của cặp gen nội chuẩn.
Với kết quả này, PCR đa mồi sẽ được dùng để xác định sự biểu lộ gen IL-2 và TNFα ở
các mẫu nuôi cấy lympho bào của người bình thường và bệnh nhân ung thư vòm.
3.4. Sự biểu lộ IL-2 ở mức độ mARN của lympho bào máu ngoại vi nuôi cấy in vitro với
thuốc thử.


Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của IL-2 ở lympho nuôi cấy của bệnh nhân ung
thư vòm mũi họng
Cả bệnh nhân và người thường đều cho kết quả như nhau và điều đặc biệt là Crilin T
cho kết quả kích thích tăng tiết IL-2 cao hơn so với chứng dương và chứng âm. Để đánh giá
sự tiết IL-2 của bệnh nhân so với người thường bằng RT-PCR (Hình 3.3 và Hình 3.4) có khác
nhau hay không thì không phải dễ vì hình ảnh có độ phân dải, đậm nhạt khác nhau. Cần phải
đối chiếu với kết quả ELISA, sẽ bàn luận sau.
3.5. Sự biểu lộ mARN của TNFα ở lympho bào nuôi cấy in vitro với thuốc thử.

8 Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của TNFα ở lympho người bình thường nuôi
cấy

p<0,05.

Hình 3.8. So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,25mg Crilin T ở tế bào bệnh nhân in vitro
(p= 0,14)

Hình 3.9. So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,5mg Crilin T ở dịch nuôi cấy in vitro tế
bào lympho từ bệnh nhân (p=0,39)

Hình 3.10. So sánh nồng độ IL-2 với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào lympho in vitro
(p=0,23)
Khi so sánh sự biểu lộ IL-2 ở lympho bào bệnh nhân với các nồng độ Crilin T với
levamisol, cho thấy 6/9 mẫu liều thấp và 7/9 (77.7%) mẫu liều cao có sự biểu lộ cao hơn so với
Levamisol (Hình 3.8 và hình 3.9). Với tỷ lệ này, chứng tỏ Crilin T có tác dụng kích thích miễn
dịch cao hơn Levamisol. Khi xem xét các liều thuốc Crilin T khác nhau, liều thấp cho đáp ứng
khá hơn so với liều cao (Hình 3.10). Tuy nhiên, những sự khác biệt này đều không có ý nghĩa
thống kê, do cỡ mẫu còn thấp. Các kết quả này cũng phù hợp với sự biểu lộ mARN phát hiện
bằng RT-PCR.

10
Vì đối tượng nghiên cứu là máu của những bệnh nhân ung thư vòm họng giai đoạn
muộn hay người bình thường đã khác nhau về di truyền học, do đó khả năng đáp ứng của các
tế bào lympho nuôi cấy với các tác nhân sinh học có thể khác nhau, sẽ cho kết quả khác nhau.
Đối với đối tượng người thường, chúng tôi thu được kết quả như sau: Nhóm chứng có biểu lộ
tốt, Levamisol cao hơn chứng âm (Hình 3.11), liều thấp và cao kích thích cao hơn Levamisol
(4/5) (Hình 3.12 và hình 3.13) và liều cao lại cho biểu lộ cao hơn liều thấp (Hình 3.14). Tuy
nhiên, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê.

Hình 3.11. So sánh sự biểu lộ Il-2 của lympho được kích thích bởi Levamisol với
chứng âm ở người thường (p=0,18)


12

Hình 3.16. So sánh nồng độ TNFα ở liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào lympho in vitro
(p=0,17)

Hình 3.17. So sánh nồng độ TNFα với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào người bình
thường in vitro (p=0,42)
Hình 3.18. So sánh sự
biểu lộ TNFα ở hai mức
độ mARN và Protein ở
tế bào lympho của cùng
một người bình thường
Sự biểu lộ TNFα
ở mức độ mARN không
có sự khác biệt giữa các
nhóm chứng âm và
dương. Sự biểu lộ này thấp hơn so với sự kích thích của Crilin T ở cả hai nồng độ 0,25mg và
0,5mg. Ở mức độ protein cũng cho kết quả tương tự (Hình 3.18A và hình 3.18B). Như vậy,
các kỹ thuật ELISA và RT-PCR đều cho kết quả tốt đối với sự biểu lộ TNFα.
3.8. Đánh giá tác dụng tăng cƣờng miễn dịch của Crilin T so với nhóm chứng dƣơng
Levamisol.

13
Qua kết quả thu được ở cả hai sự biểu lộ IL-2 và TNFα trong các thực nghiệm trên, ta
thấy Crilin T có tác dụng mạnh hơn Levamisol, đặc biệt là TNFα có sự chế tiết cao và sớm
hơn nhiều so với Levamisol


14
4. Đỗ Hòa Bình (2003), Một số thay đổi về số lượng và chức năng của tế bào lympho và
tần suất biểu lộ Protein LMP1, P53, MDM2 ở bệnh nhân ung thư vòm họng. Luận án
Tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội.
5. Đỗ Hòa Bình, Phan Thị Phi Phi, Phan Thu Anh và cs (1993), “Nghiên cứu tình trạng
suy giảm đáp ứng miễn dịch tế bào ở bệnh nhân ung thư vòm họng trước điều trị”, Tạp
chí Y học Việt Nam, số 9, tr. 1-5.
6. Đỗ Hòa Bình, Phan Thị Phi Phi, Bạch Khánh Hòa và cs (2001), “Sự thay đổi nồng độ
IL2 và IL-10 trong nước nổi nuôi cấy lympho bào máu ngoại vi bệnh nhân UTVH”.
Tuyển tập công trình NCKH của NCS,Tập 5, tr. 2-5.
7. Trần Ngọc Dung (2000), Nghiên cứu các thông số miễn dịch - sinh học giúp tiên
lượng, phát hiện sớm tái phát UTVH và kết hợp viên M sau xạ trị nhằm giảm tái phát,
Luận án tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội.
8. Nguyễn Nam Hải, Nguyễn Tiến Vững (2006), “Phân lập và xác định cấu trúc của hai
flavonoid từ Crium latifolium L”, Tạp chí Dược học, Số 1, tr. 7-8.
9. Võ Thị Bách Huệ, N.K.Q.C., Ngô Văn Thu, Delome Frederic, Daniel F. Michel
Becchi (1999), “Khảo sát alcaloid chiết từ lá cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum
latifolium L. Amaryllidaceae) bằng kỹ thuật sắc ký ghép với khối phổ (GC - MS)”,
Tạp chí Dược học.
10. Nguyễn Ngọc Lanh, Văn Đình Hoa và cs (2006), Miễn dịch học, Nhà xuất bản y học.
11. Nguyễn Ngọc Lanh, Vũ Triệu An, Phan Thị Phi Phi, Văn Đình Hoa, Phan Thị Thu
Anh, Trần Thị Chính, Dương Ngọc Quý (2003), Miễn dịch học. Xuất bản lần II. Nhà
xuất bản Y học.
12. Đỗ Tất Lợi (2003), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học Hà Nội, tr.
511-512.
13. Phan Thị Phi Phi (1997), “Đại cương về Cytokin”, Giáo trình giảng dạy sau đại học.
14. Nguyễn Nhật Thành, Phạm Thị Ninh, Trần Thị Phương Thảo, Hoàng Minh Châu,
Trần Văn Sung (2011), “Nghiên cứu thành phần hóa học lá cây trinh nữ hoàng cung
(Crinum latifolium) trồng ở Đồng Nai, Việt Nam”, Tạp chí Hóa Học, Số 49 (6A),
tr.355-361.

23. Gan, L., et al. (2003), “A polysaccharide-protein complex from Lycium barbarum
upregulates cytokine expression in human peripheral blood mononuclear cells” Eur J
Pharmacol, 471(3), pp. 217-22.

16
24. Geng, X., et al.(2012), “Interleukin-2 and autoimmune disease occurrence and
therapy”, Eur Rev Med Pharmacol Sci, 16(11), pp. 1462-7.
25. Ghosal Sh., S.K.S.a.F.A.W. (1983), “Alkaloids of Crinum latifolium” Phytochemistry,
22, pp. 2305-2309.
26. Ghosal Sh., S.K.S.a.R.S. (1985), “Crinum alkaloids: their chemistry and biology.”
Phytochemistry, 24, pp. 2141-2156.
27. Ghosal Sh., S.K.S.a.A.V.K. (1984), “1,2-beta-Epoxyambelline, an immuno-stimulant
alkaloid from Crinum latifolium”, J. Chem. Research (S), pp. 232-233.
28. Henegariu, O., et al. (1997), “Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step
protocol”, Biotechniques,23(3), pp. 504-11.
29. Hu, L.F., et al. (1991), Isolation and sequencing of the Epstein-Barr virus BNLF-1
gene (LMP1) from a Chinese nasopharyngeal carcinoma. J Gen Virol, 72 ( Pt 10), pp.
399-409.
30. Jenny, M., et al. (2011), “Crinum latifolium leave extracts suppress immune activation
cascades in peripheral blood mononuclear cells and proliferation of prostate tumor
cells”, Sci Pharm, 79(2), pp. 323-35.
31. Kobayashi Sh., T.T., Kihara M., Imakura Y.,Shingu T. and Taira. Z (1984),
“Alkaloidal constituents of Crinum latifolium and Crinum bulbispermum
(Amaryllidaceae)”, Chem. Pharm. Bul, 32, pp. 3015-3022.
32. Kobayashi Sh., T.T.a.T.Z.(1984), “Lati-fine, a biogenetic isomer of cherylline, from
Crinum latifolium L.”, J. Chem. Soc.Chem Commun, pp. 1043-1044.
33. Lai K.N., H.S., et al. (1991), “Soluble interleukin-2 receptors in patiens with
nasopharyngeal carcunima”. Cancer, 67, pp. 2180-2185.
34. Liu, Y., et al. (2009), “Immunostimulatory properties and enhanced TNF- alpha
mediated cellular immunity for tumor therapy by C60(OH)20 nanoparticles”.

- Alerg - Mex, 45(2), pp. 43-80.
46. Theze, J., P.M. Alzari, and J. Bertoglio (1996), “Interleukin 2 and its receptors: recent
advances and new immunological functions”, Immunol Today, 17(10), pp. 481-487.
47. Vivitskii – VM, Kyia - ES; Dziubak – ST (1991), “Immunomodullating of levamisol
in antibiotic therapy”, Antibiot - Khimioter, 21, pp. 25-28.

18
48. Wang, S., et al.(2011), “Subcellular resolution mapping of endogenous cytokine
secretion by nano-plasmonic-resonator sensor array”. Nano Lett, 11(8), pp. 3431-
3435.
49. Zajac, P., A. Schutz, D. Oertli Ch. Noppen, C. Scheafer, M. Hebere, G. Spagnoli,
W.R. Marti (1991), “Enhancerd generation of cytotoxic T - lymphocytes using
recombinant vaccinia virus expressing human tumor - assocciated antigents ang B7
costimulatory moleccules”. Cancers, 58(20), pp. 4567-4571.
50. Zhang, X., et al.(2009), "Analysis of Amaryllidaceae alkaloids from Crinum by high-
performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass
spectrometry", Rapid Commun Mass Spectrom, 23(18), p. 2903-2919.
51. Zvetkova, E., et al.(2001), “Aqueous extracts of Crinum latifolium (L.) and Camellia
sinensis show immunomodulatory properties in human peripheral blood mononuclear
cells”, Int Immunopharmacol, 1(12), pp. 2143-50.