BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ
VỀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ
GIỮA VIỆT NAM VÀ BUNGARI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH HỆ MIỄN DỊCH
CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC ALCALOID VÀ FLAVONOID
ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG
(Crinum latifolium L.) ĐỂ SỬ DỤNG LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN
XUẤT THUỐC HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ
Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Công ty CP Dược Liệu TW2
Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS. Nguyễn Thị Ngọc Trâm
7588
08/01/2010

FBS Fetal Bovine Serum ( Huyết Thanh Bê)
PBS Psychedelic Benzodiazepin Solution
GTBH
S
Graffi Tumors Bearing Hamster
TLC Sắc ký lớp mỏng

DANH MỤC CÁC BẢNG
1. Bảng 1: Máy móc thiết bị
2. Bảng 2: Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn C
1

bằng GC-MS.
3. Bảng 3: Dữ liệu phổ
1
H-NMR,
13
C-NMR, HMBC của HCB01.
4. Bảng 4: Suy giảm số lượng bạch cầu và công thức bạch cầu ở
chuột chiếu tia (nhận dạng bằng hình thái học) và tác dụng phục
hồi của Crila đối với các dòng này.
5. Bảng 5: Các dưới nhóm tế bào lympho máu ngoại vi (xác định
bằng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp) ở chuột bị chiếu tia và điều
trị bằng Crila.
6. Bảng 6: Tỉ
lệ % của các dưới nhóm tế bào lympho lách (xác định
bằng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp).
7. Bảng 7: Khả năng chế tiết TNFα và IL-2 của tế bào lách của chuột
chiếu tia được điều trị với Crila.
8. Bảng 8: Hoạt tính chống ôxy hóa của Crila và các phân đoạn.

11. Ảnh 11: hoạt tính chống kh
ối u, gây độc tế bào của thuốc viên
CRILA in vitro
12. Ảnh 12: hoạt tính chống khối u, gây độc tế bào của thuốc viên
CRILA in vitro
13. Ảnh 13: Hoạt tính chống khối u (gây độc tế bào) của Crinum
latifolium L. phân đoạn H
1

14. Ảnh 14: Hoạt tính chống khối u (gây độc tế bào) của Crinum
latifolium L. phân đoạn H
1.

15. Ảnh 15: Hoạt tính chống khối u (gây độc tế bào) của Crinum
latifolium L. phân đoạn H
1DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
1. Biểu đồ 1: Tỷ số Kyn/trp (% các tế bào đã được kích thích bằng PHA)
2. Biểu đồ 2: Tỷ số Kyn/trp (% các tế bào đã được kích thích bằng PHA)
3. Biểu đồ 3: Sự tạo thành neopterin % các tế bào đã được kích thích.
4. Biểu đồ 4: Sự tạo thành neopterin % các tế bào đã được kích thích.
5. Biểu đồ 5: Đồ thị tính giá trị IC
50
của mẫu.
6. Biểu đồ 6: Mẫu C
3
- Dòng Hep-G2
7. Biểu đồ 7: Mẫu C

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2
1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ Crinum
latifolium L…………………………………………… 2
1.1. T×nh h×nh nghiªn cøu trong n−íc 2
1.2. T×nh h×nh nghiªn cøu ngoµi n−íc 8
1.3. Các thuốc kích thích hệ miễn dịch 11
2. TÍNH CẤP THIẾT VÀ KHẢ THI CỦA NHIỆM VỤ HỢP TÁC
QUỐC TẾ 13

3. MỤC TIÊU CỦA NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ 13
4. NỘI DUNG CỦA NHIỆM VỤ 13
4.1. Chiết xuất các phân đoạn alcaloid và flavonoid từ lá cây Trinh nữ
hoàng cung Crinum latifolium L. 13
4.2 Đánh giá tác dụng sinh học in vitro và in vivo của các phân đoạn
alcaloid và flavonoid được chiết xuất từ cây TNHC (Crinum
latifolium L.) 14
CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 1
5
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 17
3.1 Chiết xuất các phân đoạn alcaloid và flavonoid từ lá của cây
Trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium L. 17
3.1.1 Chiết xuất các phân đoạn alcaloid từ lá của cây TNHC
(Crinum latifolium L.) 17
3.1.2 Chiết xuất các phân đoạn flavonoid từ lá của cây trinh nữ hoàng cung
(Crinum latifolium L.) 20
3.1.3 Máy móc thiết bị 22
3.1.4 Xác định thành phần hóa học của phân đoạn alcaloid C

nuôi cấy in vitro 49
3.2.2 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá của viên nang Crila
thông qua phản ứng bao vây gốc tự do 1,1 – diphenyl
– 2 – picrylhydrazyl (DPPH) 51
3.2.3 Thử gây độc tế bào với các dòng ung thư nuôi cấy in vitro 53
3.2.3.1 Với các dòng ung thư phổi, gan, màng tim in vitro 53
3.2.3.2 Thử độc tế bào in vitro của viên nang Crila và phân đoạn
H
1
trên tế bào ung thư tuỷ Graffi nuôi cấy 59
3.2.4 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vivo được chứng minh trên
chuột Wistar và chuột Hamster 65
3.2.4.1 Nghiên cứu tác dụng của viên nang Crila và phân đoạn
C
1
, H
1
trên chuột Wistar được gây ung thư do hoá chất
20 – methylcholanthrene 65
3.2.4.2 Đánh giá hoạt tính gây độc in vivo của viên Crila Việt Nam
sử dụng tại chỗ khối u tế bào tuỷ Graffi ở chuột Hamster 70
3.2.4.3 Nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch chống khối u của viên
nang Crila trên chuột Hamster được cấy ghép khối u tế bào tủy Graffi 75
CHƯƠNG IV:
BÀN LUẬN 80
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82
Tài liệu tham khảo 86
Phụ lục
sự trong nước. Chúng tôi đã được thực hiện nhiệm vụ: “Nghiên cứu khả
năng kích thích hệ miễn dịch chống ung thư c
ủa các alcaloid và
flavonoid được chiết xuất từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum
latifolium L.) để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc hỗ trợ điều
trị ung thư”.
2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC VỀ
Crinum latifolium L.
1.1 T×nh h×nh nghiªn cøu trong n−íc.

a. T×nh h×nh bƯnh ung th− vµ đ¸p øng miƠn dÞch chèng ung th−:
Bệnh ung thư là căn bệnh hiểm nghèo, cả thế giới chưa tìm được thuốc
đặc trò. Theo thông tin từ tổ chức Y Tế thế giới số lượng bệnh nhân ung
thư hàng năm khoảng 9 triệu người, số người chết vì căn bệnh ung thư
năm 1909 4%, năm 1990 20%. Từ năm 1990 đến nay tỉ lệ người mắc
bệnh bò tử vong tăng lên nhanh [1]. Trước hiểm hoạ đó các nhà khoa học
đã tập trung nghiên cứu tìm kiếm từ thiên nhiên hoặc từ con đường bán
tổng hợp và tổng hợp hoá học hy vọng rằng sẽ tìm được thuốc chữa trò
ung thư có hiệu quả.
Hiện nay các phương pháp chữa trò ung thư được sử dụng nhiều :
phẫu thuật, xạ trò, hoá trò, điều trò miễn dòch. Thuốc cho bệnh ung thư
trên thế giới hiện có khoảng 90 loại [24], trong đó có nguồn gốc thực vật
là 62%. Thực tế đó đã thúc dục các nhà khoa học tiếp tục đi tìm thuốc
chữa trò ung thư từ dược thảo trong đó có các nhà khoa học Việt Nam.
Cây Trinh Nữ Hoàng Cung (TNHC) có tên khoa học Crinum latifolium

Việt Nam có thể thay cho một nhà máy tổng hợp các alcaloid và flavonoid
có tác dụng kháng u. Thiên nhiên đã ban tặng cho Việt Nam một điều may
mắn là có được cây Trinh nữ hồng cung và thực tế từ kinh nghiệm dân
gian chúng tơi muốn nắm bắt và nhận được từ dược thảo Việt Nam một

4
viên thuốc q điều trị ung thư. Trong số các phương pháp điều trị ung
thư, phương pháp điều trị miễn dịch là phương pháp hiện nay đang được
quan tâm vì con người đã phát hiện ra các kháng ngun đặc hiệu của các
khối u của người. Tiếp theo đó người ta cũng nhận thấy các phản ứng hỗn
hợp giữa các lympho T với các kháng ngun của khối u. Trong các
trường hợp ung thư, các lympho T đượ
c sinh sản chủ yếu là dạng lympho
T CD4
+
và một phần là các lympho T CD8
+
đặc hiệu với các tế bào ung
thư tiết ra TNFα, Boon và các cộng sự (1994) đã phát hiện được một họ
các gen của kháng ngun của ung thư melanoma và gọi là MAGE
(melanoma associated genes). Từ máu của bệnh nhân mang bệnh
melanoma MZ2, họ đã tách được các lympho Tc CD8
+
đặc hiệu với khối u
MZ2-E.
b. Các kết quả đã đạt được của Đề tài và Dự án của Cơng ty CP Dược
Liệu TW2 ®· nghiªn cøu vỊ cây Trinh n÷ hoµng cung (Crinum
latifolium L.)
Trong những năm qua được sự giúp đỡ của Bộ Khoa Học Công
nghệ và Bộ Y Tế, TS. Nguyễn Thò Ngọc Trâm cùng các cộng sự của

nghiên cứu bảo tồn gen cây Trinh nữ hồng cung. Hiện đang tiếp tục phát
triển vùng trồng và chuẩn bị nghiên cứu phương pháp cấy mơ để so sánh
hoạt tính sinh học ức chế khối u của cây cấy mơ với cây nhân giống tự
nhiên.
c. Thành phần hóa học

* Alcaloid
- Cơng ty Dược Liệu TW2 - Nguyễn Thò Ngọc Trâm và cộng sự đã
tìm ra các alcaloid: 9-Octadecenamide
b
,

6
Dihydro-oxo-demethoxyhaemanthamine, Augustamine, Oxoassoanine,
Crinane-3α-ol, Buphanidrine, Powelline, Undulatine, Ambelline,
6-hydroxybuphanidrine, 6-hydroxypowelline, Crinamidine,
6-hydroxyundulatine, 1β,2β - epoxyambelline, 6-hydroxycrinamidine,
Epoxy-3,7-dimethoxycrinane-11-one .[48]
- Trường Đại học Dược Hà Nội – Nguyễn Văn Bằng, Vũ Đoan Trang,
và các cộng sự, đã xác đònh trong lá Trinh Nữ Hoàng Cung có alcaloid,
saponin, acid hữu cơ, amino acid. [2]
- Trần văn Sung và cộng sự xác đònh thêm 2 hoạt chất: Lycorin và
Pratorin (Hippadin) [11]
- Võ Thò Bạch Huệ, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, và các cộng sự xác đònh
được 4 alcaloid: Augustamin, ambelin, crinamidin, 6-hydroxycrinamidin
[5]
- Nguyễn Thò Ngọc Trâm và cộng sự đã nghiên cứu và công bố 32
chất bay hơi có trong lá cây Trinh nữ hoàng cung [49]
* Flavonoid
- ViƯc t×m kiÕm thc ch÷a trÞ ung th− tõ thùc vËt lµ h−íng ®i cđa thêi

tiến hành thí nghiệm cho uống những chất chiết bằng nước nóng của cây
Crinum latifolium L. (cây Trinh Nữ Hoàng Cung –Việt Nam). Kết quả
đã làm chậm sự tăng trưởng khối u của chuột thí nghiệm [50]

8
- Các tác giả còn chứng minh thêm được 4 phân đoạn alcaloid có tác
dụng gây độc tế bào ung thư da, ung thư màng tử cung, ung thư cơ tim có
kết quả dương tính mạnh [13].
- Để có thuốc hỗ trợ cho điều trò u xơ tuyến tiền liệt (phì đại lành tính
tuyến tiền liệt) và tránh nhầm lẫn cây Trinh Nữ Hoàng Cung với các cây
náng khác có ở Việt Nam, Công ty CP Dược Liệu TW2 đã sản xuất trà
túi lọc Trinh Nữ Hoàng Cung từ 1998 cho đến nay, sản phẩm đã và đang
có uy tín trên thò trường.
- Năm 2001 tại BV Hữu Nghò, Bác só Nguyễn Xuân Hướng sử dụng
nước sắc lá Trinh Nữ Hoàng Cung của Công ty Dược Liệu TW2 cung
cấp để điều trò u xơ tuyến tiền liệt cho các bệnh nhân của bệnh viện
Hữu Nghò Hà Nội, đạt hiệu quả cao. [4].
- Tháng 7 năm 2005 theo quyết đònh của Cục Trưởng Cục Quản lý
Dược Việt Nam, viên nang cứng CRILA do Trung tâm NCPTSX Dược
Phẩm CRINA thuộc Công ty CP Dược liệu TW2 sản xuất từ cao khô
Trinh nữ hoàng cung đã được phép lưu hành toàn quốc điều trò bệnh phì
đại lành tính tuyến tiền liệt (u xơ tuyến tiền liệt) và tháng 10 năm 2007
được bổ sung thêm tác dụng thứ hai điều trị u xơ tử cung.

1.2. T×nh h×nh nghiªn cøu ngoµi n−íc.

Từ những năm 1984 cho đến nay các công trình nghiên cứu về thành
phần hoá học và tác dụng dược lực của Crinum latifolium L. cũng đã
được công bố trên các tạp chí trong và ngoài nước.
a. Thành phần hoá học

chiết nước nóng từ lá cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)
Việt Nam có thể kích thích hữu hiệu sự sinh sản của tế bào lympho T và
đặc biệt có tác dụng kích thích trực tiếp các tế bào CD3 +T và CD4 + T
trong ống nghiệm. [51]
- Nguyễn Thò Ngọc Trâm, I.Yanchev, E.Zvetkova . Đã tiến hành thử
nghiệm gây ung thư trên chuột đực giống Wistar từ 50 đến 55 ngày tuổi
bằng cách cấy dưới da hoá chất gây ung thư 20-methylcholanthrene, và
tiến hành thí nghiệm cho uống những chất chiết bằng nước nóng của cây
Crinum latifolium L. (cây Trinh Nữ Hoàng Cung –Việt Nam). Kết quả
đã làm chậm sự tăng trưởng khối u của chuột thí nghiệm [53]
- Theo tác giả Ghosal , một số alcaloid từ Crinum latifolium như:
Crinafoline, crinafolidine đã được thử nghiệm với tế bào ung thư và cho
kết quả dương tính. [29]
- Theo tác giả E. Zvetkova, N.T.Tram, D.Fuchs dòch chiết nước nóng
của trà túi lọc Trinh nữ hoàng cung có khả năng kích thích tế bào
lympho T hoạt động và phát triển tăng sức đề kháng của cơ thể mạnh
hơn trà xanh. [58]
- Dòch chiết nước của Crinum latifolium L. có khả năng kích thích tế
bào lympho T của người hoạt động và phát triển [52]
- Dòch chiết nước nóng từ Crinum latifolium L. Việt Nam tạo nên một
số tác dụng mạnh trực tiếp mà nguyên nhân do kích thích một số hỗn
hợp những tế bào Lympho CD4
+
/CD8
+
, là sự sản xuất số lượng lớn

11
những tác nhân diệt ung bướu như TNF - α trong các sinh vật và bệnh
nhân ung thư.

Trên thế giới đã có một số loại thuốc kích thích hệ miễn dòch được sử
dụng như:
a. Các chất miễn dòch nội sinh:
• Interleukin-2; Interferon [9, 43, 45, 15]
b. Các chất kích thích miễn dòch từ các nguồn khác:
• Từ vi khuẩn, virút, ký sinh trùng, nấm như: BCG, MDP,
Bronchovachon, lentinan [20, 16, 17, 18, 19, 39, 47, 25]
• Từ nguồn tổng hợp hóa học: Levanisal, nimuthiol [26, 35, 39, 59,
22]
c. Từ nguồn gốc thực vật lectin của một số loại họ đậu, tầm gửi và
taxol chiết từ cây thông đỏ (Taxus baccata L.) [21, 23,]
Hiện nay bệnh ung thư ngày càng nhiều. Đứng trước thảm họa đó chúng
tôi thấy rằng cần tìm ra loại thuốc mới hỗ trợ điều trò bệnh ung thư từ
những alcaloid và flavonoid chiết xuất từ lá và hoa của cây Trinh nữ
hoàng cung (Crinum latifolium L.).
Việt Nam sẽ có một viên thuốc hỗ trợ điều trị ung thư có hiệu quả cao từ
dược thảo Việt nam – cây Trinh nữ hồng cung (Crinum latifolium L.).
Sản phẩm ra đời sẽ chứng minh được ngành Dược Việt Nam, trí tuệ Việt
Nam có thể tạo ra sản phẩm mới có tầm quốc tế nếu các nhà khoa học đem
hết tâm huyết, sức lực tập trung cho nghiên cứu khoa học và thật sự muốn
nâng tầm hiểu biết của mình cần phải hợp tác quốc tế để học hỏi kinh
nghiệm nghiên cứu khoa học của các nhà khoa học trong nước và quốc tế.
Tính đến tháng 12 năm 2006 trong nước chưa có một dạng thuố
c nào
được bào chế từ ngun liệu chiết xuất của cây Trinh nữ hồng cung hỗ

13
trợ điều trị ung thư. Do đó, nhiệm vụ của đề tài phải khẳng định được và
tạo ra nguyên liệu làm thuốc là các phân đoạn alcaloid và flavonoid có khả
năng hỗ trợ điều trị ung thư, kích thích tế bào lympho T hoạt động và phát

14
4.1. Chiết xuất các phân đoạn alcaloid và flavonoid từ lá cây Trinh nữ
hoàng cung (Crinum latifolium L.)
- Chiết xuất các phân đoạn alcaloid từ lá của cây trinh nữ hoàng cung
(Crinum latifolium L.).
- Chiết xuất các phân đoạn flavonoid từ lá của cây trinh nữ hoàng cung
(Crinum latifolium L.).
4.2. Đánh giá tác dụng sinh học in vitro và in vivo của các phân đoạn
alcaloid và flavonoid được chiết xuất từ cây TNHC (Crinum latifolium
L.) thông qua nghiên cứu in vitro và in vivo:
4.2.1 Chứng minh tác dụng tăng cường miễn d
ịch in vivo và in vitro của
các phân đoạn Alcaloid và Flavonoid và viên nang Crila.
- Thí nghiệm in vivo:
Đánh giá khả năng phục hồi, tăng cường dòng tế bào lympho T và
dòng tủy của viên nang Crila trên chuột nhắt trắng random bị chiếu tia
gamma.
- Tác dụng gây phân bào (mitogenic activity) in vitro của các phân đoạn
H
1
(flavonoid), C
1
(alcaloid) và viên nang Crila.
- Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro của viên nang Crila
và các phân đoạn C
1
, C
2
, C
3

Lá cây Trinh nữ hoàng cung thu hái vào tháng 4 năm 2007 tại Trại dược
liệu Long Thành – Đồng Nai.
- Nguyên liệu dùng để thử tác dụng sinh học:
+ Các phân đ
oạn chiết xuất alcaloid C
1
, C
2
, C
3
.
+ Phân đoạn chiết xuất Flavonoid
+ Viên nang Crila được sản xuất từ alcaloid tổng C = C
1
+ C
2
+ C
3

viên thuốc Crila đang được lưu hành trên thị trường với SĐK
VNB-3391-05.
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Phương pháp nghiên cứu chiết xuất: phương pháp ngấm kiệt.
- Các phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC).
- Phương pháp hoá lý: cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), khối phổ (MS),
sắc ký khí khối phổ (GC-MS), quang phổ hồng ngoại (IR), quang phổ tử
ngo
ại (UV).
- Phương pháp gây độc tế bào – tác giả Skehan (1990) và

, C
1
,
C
2
, C
3

.
Máu ngoại vi và các mạch bạch huyết cũng là 10-25 µg/ml ở môi trường
nuôi cấy (RPMI 1640 đã được bổ xung với FBS v.v…)
Các kiểm tra rõ ràng chắc chắn bằng lectin, convanavaline A (Con A)
cũng đã được thực hiện ở các liều 10 và 25 µg/ml môi trường nuôi cấy.
Các kết quả thí nghiệm thu được đã được ghi chép, (bằng kính hiển vi
quang học) trên Giemza.
Việc tìm hiểu tính gây độc tế bào (cũng là các tác động chống khối u) của
Crila đã được thực hi
ện trong các điều kiện nuôi cấy tế bào u tủy sống
Graffi (10
6
tế bào/ ml môi trường nuôi cấy) với các liều của Crila 10 -
25µg/ml môi trường nuôi cấy (RPMI 1640 được bổ sung với FBS v.v ) và
bổ sung bằng các phương pháp về tế bào học đã được mô tả.
Các khám phá in vivo (ở cơ thể sống)

50 con chuột đực thuộc loại Wistar 50-55 ngày tuổi đã được dùng cho việc
tạo khối u bằng hóa chất gây ung thư. Thực hiện việc tiêm dưới da chất
20- metylcholanthrene và sau khi nổi lên các khối u từ 2-3 mm, các con

17

Chiết alcaloid dựa vào tính tan của chúng, các alcaloid dạng muối tan
trong nước, các alcaloid dạng bazơ tan trong dung môi hữu cơ. Để có mẫu
là các phân đoạn alcaloid đưa thử sàng lọc tác dụng sinh học điều trị ung
thư, chúng tôi tiến hành chuẩn bị mẫu thử để chuyển sang nghiên cứu tại
Viện Hàn Lâm Khoa học Bungari và Áo.
Chúng tôi tiế
n hành chiết alcaloid toàn phần theo quy trình sau:
• Chuẩn bị nguyên liệu lá Trinh nữ hoàng cung được thu hái vào tháng
4/2007 tại Trại Dược Liệu, Long Thành, Đồng Nai.

18
- Lá TNHC được rửa sạch, phơi khô, sấy khô ở nhiệt độ 50 đến 60
o
,
xay thành bột.
- Lấy 10 kg bột lá TNHC làm ẩm bằng dung môi chiết xuất.
- Ngâm với ethanol 70
o
/acid acetic 2% (chỉnh pH = 4) các dịch chiết
cồn, acid thu được đem lọc rồi kiềm hóa bằng amoniac đến pH = 9-10,
sau đó lắc với chloroform nhiều lần đến khi chiết kiệt hết alcaloid, (
kiểm tra bằng thuốc thử Dragendorff).
- Tinh chế: dịch chloroform được lọc, sau đó lắc nhiều lần với HCl
0,1N gộp dịch chiết acid rồi kiềm hóa dịch bằng NH
4
OH đến pH= 9-
10. Dịch chiết đã kiềm hoá tiếp tục lắc với CHCl
3
, sau đó cất thu hồi
dung môi CHCl